Diagramma della sequenza della terapia genica. La seconda venuta della terapia genica

Terapia genetica

Baranov V.S. Terapia genica: la medicina del 21° secolo // Rivista educativa Soros. – 1999. – N. 3. – P. 63–68. (Università statale di San Pietroburgo)

© Baranov V.S., testo

© Rivista educativa Soros, 1999

© A. Afonin, elaborazione e pubblicazione della versione html, 2006

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INTRODUZIONE

I risultati decisivi della biologia molecolare e della genetica nello studio della struttura fine dei geni eucariotici, la loro mappatura sui cromosomi dei mammiferi, e soprattutto degli esseri umani, gli impressionanti successi del Progetto Genoma Umano nell'identificazione e nella clonazione dei geni le cui mutazioni portano alla numerose malattie ereditarie e, infine, rapida crescita nel campo delle biotecnologie e Ingegneria genetica erano i prerequisiti necessari per fare i primi tentativi di curare le malattie monogeniche partendo da esperimenti su animali e costruzioni teoriche già nel 1989.

Cos’è la terapia genica? Si tratta di un trattamento che utilizza il gene come farmaco o semplicemente di un trattamento correggendo il gene mutante? Queste e molte altre domande sorgono inevitabilmente quando si considera una direzione della medicina del prossimo 21° secolo così promettente, e forse potenzialmente pericolosa per l’umanità, come la terapia genica.

BREVE CENNO STORICO

Terapia genica per palcoscenico moderno può essere definito come il trattamento di malattie ereditarie, multifattoriali e non ereditarie (infettive) mediante l'introduzione di geni nelle cellule dei pazienti al fine di modificare specificamente i difetti genetici o conferire alle cellule nuove funzioni. Primo test clinici Le tecniche di terapia genica furono avviate il 22 maggio 1989, con l'obiettivo di marcare geneticamente i linfociti infiltranti il ​​tumore nei casi di melanoma avanzato. La prima malattia ereditaria monogenica per la quale sono stati applicati metodi di terapia genica è stata l'immunodeficienza ereditaria causata da una mutazione nel gene dell'adenosina deaminasi (ADA). Il 14 settembre 1990, a Bethesda (USA), ad una bambina di quattro anni affetta da questa malattia piuttosto rara (1:100.000) furono trapiantati i suoi stessi linfociti, precedentemente trasformati all'esterno del corpo (ex vivo) genoma ADA (gene ADA + gene peo + vettore retrovirale). L'effetto terapeutico è stato osservato per diversi mesi, dopodiché la procedura è stata ripetuta ad intervalli di 3...5 mesi. In tre anni di terapia sono state eseguite un totale di 23 trasfusioni endovenose. ADA- linfociti T trasformati senza effetti avversi visibili. Come risultato del trattamento, le condizioni della paziente sono migliorate così tanto che è stata in grado di condurre una vita normale e di non aver paura di infezioni casuali. Il trattamento del secondo paziente affetto da questa malattia ha avuto lo stesso successo. Attualmente sono in corso studi clinici sulla terapia genica per questa malattia in Italia, Francia, Regno Unito e Giappone.

Nel 1997 il numero di protocolli approvati per gli studi clinici era già 175 e alla loro attuazione hanno preso parte più di 2000 pazienti. La maggior parte di questi progetti (circa l'80%) riguarda la cura del cancro e dell'infezione da HIV (AIDS). Allo stesso tempo, nella ricerca moderna sulla terapia genica è necessario tenere conto del fatto che le conseguenze della manipolazione dei geni o del DNA ricombinante In vivo non sufficientemente studiato.

Nei paesi con il livello più avanzato di ricerca in questo settore, soprattutto negli Stati Uniti, i protocolli medici che utilizzano sequenze di DNA sensoriale sono soggetti a revisione obbligatoria da parte dei comitati e delle commissioni competenti. Negli USA si tratta del Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) e della Food and Drug Administration (FDA), con successiva approvazione obbligatoria del progetto da parte del direttore del National Institutes of Health. In Europa tali protocolli sono elaborati e approvati in conformità con le raccomandazioni dell’European Working Group on HumanGene Transfer and Therapy.

METODI DI TRASFEZIONE GENETICA IN TERAPIA GENICA

La condizione decisiva per il successo della terapia genica è garantire un rilascio efficace, cioè la trasfezione (in senso lato) o la trasduzione (quando si utilizzano vettori virali) di un gene estraneo nelle cellule bersaglio, garantendo il suo funzionamento a lungo termine in queste cellule e creando condizioni per il pieno funzionamento del gene (sua espressione). La trasfezione può essere effettuata utilizzando DNA puro (nudo) drogato (integrato) nel plasmide appropriato, oppure DNA complessato (DNA plasmidico collegato a sali, proteine ​​(transferrina), polimeri organici (DEAE-destrano, polilisina, liposomi o particelle d'oro), oppure DNA contenuto in particelle virali precedentemente private della capacità di replicarsi.

I principali metodi per fornire geni estranei alle cellule sono suddivisi in chimici, fisici e biologici. Efficienza di trasfezione e capacità di integrazione del DNA estraneo trasdotto durante in vari modi la trasfezione nelle cellule di DNA bersaglio non è la stessa. Solo i vettori virali o i costrutti genetici contenenti sequenze virali sono capaci di trasduzione attiva e, in alcuni casi, di espressione a lungo termine di geni estranei. Degli oltre 175 protocolli di sperimentazione clinica già approvati per la terapia genica, più di 120 prevedono l'utilizzo della trasduzione virale e di questi circa 100 si basano sull'utilizzo di vettori retrovirali.

Un esame dei dati ci permette di giungere alla conclusione che, nonostante gli sforzi di numerosi laboratori in tutto il mondo, tutto ciò che è già noto e testato In vivo E In vitro i sistemi vettoriali sono tutt’altro che perfetti. Se c'è un problema con la consegna di DNA estraneo In vitro praticamente risolto e la sua consegna alle cellule bersaglio di diversi tessuti In vivo risolto con successo (principalmente creando costrutti che trasportano proteine ​​recettoriali, compresi antigeni specifici per determinati tessuti), allora altre caratteristiche dei sistemi vettoriali esistenti - stabilità dell'integrazione, espressione regolata, sicurezza - richiedono ancora seri miglioramenti.

Si tratta innanzitutto della stabilità dell’integrazione. Finora l'integrazione nel genoma è stata ottenuta solo utilizzando vettori retrovirali o adeno-associati. L'efficienza dell'integrazione stabile può essere aumentata migliorando i costrutti genici come i sistemi mediati dai recettori o creando vettori episomali sufficientemente stabili (cioè strutture di DNA capaci di persistenza a lungo termine all'interno dei nuclei).

Il trasferimento genico mediato dal recettore è il seguente. La sequenza del DNA del gene desiderato è collegata a una determinata sostanza (ad esempio una glicoproteina), che ha un'elevata affinità per un determinato recettore di membrana della cellula trasformata (ad esempio un epatocita). Il complesso risultante è combinato con un adenovirus, che garantisce la penetrazione del costrutto genetico nel nucleo cellulare. Un tale vettore combinato garantisce un rilascio mirato ed efficace del gene a cellule specifiche.

Recentemente, particolare attenzione è stata rivolta alla creazione di vettori basati su cromosomi artificiali di mammiferi (Mammalian Artificial Chromosomes). A causa della presenza degli elementi strutturali di base dei cromosomi ordinari, tali mini-cromosomi vengono trattenuti a lungo nelle cellule e sono in grado di trasportare geni (genomici) a grandezza naturale e i loro elementi regolatori naturali, necessari per il corretto funzionamento del gene, nel tessuto giusto e al momento giusto.

PRINCIPI DI TERAPIA GENICA

A seconda del metodo di introduzione del DNA esogeno nel genoma del paziente, la terapia genica può essere effettuata sia in coltura cellulare (ex-vivo), o direttamente nel corpo (In vivo). Terapia o terapia genica cellulare ex vivo comporta l’isolamento e la coltura di tipi cellulari specifici del paziente In vitro, introducendovi geni estranei (ad esempio, quelli che migliorano la risposta immunitaria del corpo), selezionando cloni cellulari trasfettati e reinfondendoli nello stesso paziente. Attualmente, la maggior parte dei programmi di terapia genica approvati per gli studi clinici utilizzano questo approccio.

Terapia genetica In vivo si basa sull'introduzione diretta di sequenze di DNA clonate e confezionate in tessuti specifici del paziente. Particolarmente promettente per il trattamento delle malattie genetiche in vivo sembra possibile l’introduzione di geni mediante vaccini aerosolizzati o iniettati. La terapia genica con aerosol è sviluppata, di norma, per il trattamento delle malattie polmonari (fibrosi cistica, cancro ai polmoni).

Lo sviluppo di un programma di terapia genica è preceduto da un'analisi approfondita dell'espressione tessuto-specifica del gene corrispondente, dall'identificazione del difetto biochimico primario, dallo studio della sua struttura, funzione e distribuzione intracellulare prodotto proteico, E analisi biochimiche processo patologico. Tutti questi dati vengono presi in considerazione durante la stesura del protocollo medico appropriato. Il test della procedura per la correzione genetica di una malattia ereditaria viene effettuato su colture cellulari primarie del paziente, in cui questo gene è normalmente funzionalmente attivo. Utilizzando questi modelli cellulari, viene valutata l'efficacia del sistema di trasferimento del DNA esogeno selezionato, viene determinata l'espressione del costrutto genetico introdotto, viene analizzata la sua interazione con il genoma cellulare e vengono sviluppati metodi di correzione a livello biochimico.

Utilizzando colture cellulari, è possibile sviluppare un sistema per la consegna mirata di DNA ricombinante, tuttavia, il test dell'affidabilità del funzionamento di questo sistema può essere effettuato solo a livello dell'intero organismo. Ecco perché si presta tanta attenzione alla sperimentazione nei programmi di terapia genica. In vivo su modelli naturali o ottenuti artificialmente delle corrispondenti malattie ereditarie negli animali. La corretta correzione dei difetti genetici in questi animali e l’assenza di effetti collaterali indesiderati della terapia genica sono il prerequisito più importante per l’approvazione degli studi clinici.

Pertanto, lo schema standard per la correzione genetica di un difetto ereditario comprende una serie di fasi successive. Inizia con la creazione di un costrutto genetico pienamente funzionante (espresso) contenente le parti semantiche (codificanti le proteine) e regolatrici del gene. Nella fase successiva viene risolto il problema del vettore, garantendo una consegna efficiente e, se possibile, mirata del gene alle cellule bersaglio. Quindi viene effettuata la trasfezione (trasferimento del costrutto risultante) nelle cellule bersaglio, vengono valutati l'efficienza della trasfezione e il grado di correggibilità del difetto biochimico primario nelle condizioni di coltura cellulare (In vitro) e, soprattutto, In vivo su modelli biologici animali. Solo dopo potrà iniziare il programma di sperimentazione clinica.

GENOTERAPIA DELLE MALATTIE EREDITARIE MONOGENICHE

Il successo dei primi studi clinici è stato un potente incentivo per accelerare lo sviluppo di nuovi metodi di terapia genica per altre malattie ereditarie. Di seguito è riportato un elenco delle malattie per le quali è sostanzialmente possibile un approccio di terapia genica, la cui correzione genetica sarà probabilmente effettuata nel prossimo futuro, nonché quelle malattie per le quali esistono già protocolli ufficialmente approvati e che si trovano in fasi diverse degli studi clinici.

Tabella 1– Malattie ereditarie la cui correzione genetica si trova nella fase di sperimentazione clinica (CT), di sviluppo sperimentale (ED) ed è fondamentalmente possibile (PV)

GENOTERAPIA DELLE MALATTIE NON EREDITABILI

Contemporaneamente allo sviluppo della ricerca nel campo della correzione genetica dei difetti ereditari, anche la ricerca di metodi per l'uso terapeutico delle sequenze di DNA sensoriale per il trattamento dei difetti si è rivelata vincente. malattie ereditarie, e principalmente tumori maligni e infezioni virali. È significativo che sia in queste sezioni della patologia che la ricerca di metodi di correzione genetica venga effettuata in modo particolarmente intenso e che il numero di protocolli di sperimentazione clinica già approvati sia molte volte maggiore del numero di quelli per il trattamento delle malattie monogeniche.

Di seguito sono elencati i principali approcci metodologici alla terapia genica per vari tumori che sono stati sviluppati e sono già ampiamente utilizzati. Molti di questi approcci sono applicabili anche alla lotta contro le malattie infettive più gravi, come l’infezione da HIV (AIDS).

I risultati dei primi studi clinici di questi approcci furono massimo grado promettente, soprattutto nel trattamento delle malattie neurodegenerative e oncologiche del sistema nervoso.

Tavolo 2 - Approcci di base alla correzione genetica delle malattie tumorali

ALCUNE PROBLEMATICHE ETICHE E SOCIALI

TERAPIA GENETICA

L'emergere di tecnologie fondamentalmente nuove che consentono di manipolare attivamente i geni e i loro frammenti e di garantire la consegna mirata di nuovi blocchi di informazioni genetiche a regioni specifiche del genoma è diventato un evento importante in biologia e medicina.

Già adesso, all'attuale livello di conoscenza del genoma umano, tali modifiche sono teoricamente del tutto possibili al fine di migliorare alcuni parametri fisici (ad esempio l'altezza), mentali e intellettuali. Pertanto, la scienza umana moderna, nel suo nuovo ciclo di sviluppo, è tornata all'idea di miglioramento della razza umana, una volta postulata dall'eccezionale genetista inglese F. Galton e sviluppata dai suoi studenti e seguaci in Gran Bretagna (K. Pearson , L. Penrose, J. Haldane), in Russia (N.K. Koltsov, F.P. Filipchenko), negli Stati Uniti (G. Möller). L'ulteriore corso della storia, come sappiamo, ha completamente screditato l'idea stessa di migliorare la razza umana. Tuttavia, la futura onnipotenza dell'uomo sul proprio genoma ci costringe a tornare ancora e ancora su questo argomento, rendendolo oggetto di discussioni costantemente vivaci sulla stampa generale e scientifica. Non c’è dubbio che i timori iniziali legati all’ingegneria genetica umana fossero ingiustificati. L’uso della terapia genica per la cura di molte malattie è già stato riconosciuto come opportuno. L’unica e indispensabile limitazione, che rimane valida nelle condizioni moderne, è che tutte le misure di terapia genica dovrebbero essere mirate solo a un paziente specifico e riguardarlo esclusivamente cellule somatiche.

L’attuale livello di conoscenza non consente la correzione dei difetti genetici a livello delle cellule germinali e delle cellule degli embrioni umani preimpiantatori a causa di pericolo reale contaminazione del pool genetico con costrutti genetici artificiali indesiderati o introduzione di mutazioni con conseguenze imprevedibili per il futuro dell’umanità. Allo stesso tempo, nella letteratura scientifica sono sempre più frequenti e persistenti gli appelli a riprendere la discussione sull’opportunità della correzione genetica dei germi e delle cellule germinali umane.

Queste sono alcune delle domande che devono essere affrontate come parte del più ampio dibattito sulla terapia genica proposto dai genetisti.

1. La terapia genica sarà in futuro in grado di fornire una correzione genetica così completa da non rappresentare una minaccia per la prole?

2. In che misura il beneficio e la necessità di una procedura di terapia genica per una coppia superano il rischio di un simile intervento per tutta l'umanità?

3. Quanto saranno giustificate queste procedure alla luce dell'imminente sovrappopolazione del pianeta?

4. In che modo le attività di ingegneria genetica sugli esseri umani si relazioneranno ai problemi dell'omeostasi della società e della biosfera?

Pertanto, la rivoluzione genetica, la cui apoteosi è stata la terapia genica, non solo offre soluzioni reali per curare gravi malattie ereditarie e non ereditarie, ma nel suo rapido sviluppo pone anche nuovi problemi per la società, la cui soluzione è urgentemente necessaria nel contesto prossimo futuro.

introduzione

Ogni anno dentro riviste scientifiche Ci sono sempre più articoli di carattere medico studi clinici, in cui, in un modo o nell'altro, veniva utilizzato un trattamento basato sull'introduzione di vari geni: la terapia genica. Questa direzione è nata da rami della biologia ben sviluppati come la genetica molecolare e la biotecnologia.

Spesso, quando i metodi convenzionali (conservatori) sono già stati provati, è la terapia genica che può aiutare i pazienti a sopravvivere e persino a riprendersi completamente. Questo vale, ad esempio, per le malattie ereditarie monogeniche, cioè quelle causate da un difetto in un singolo gene, così come per molte altre. Oppure, ad esempio, la terapia genica può aiutare e salvare un arto per quei pazienti che hanno ristretto il lume dei vasi sanguigni nel arti inferiori e come risultato di ciò, si è sviluppata un'ischemia persistente dei tessuti circostanti, cioè questi tessuti presentano una grave carenza nutrienti e ossigeno, che normalmente vengono trasportati dal sangue in tutto il corpo. Manipolazioni chirurgiche ed è spesso impossibile trattare questi pazienti con farmaci, ma se le cellule fossero costrette localmente a rilasciare più fattori proteici che influenzerebbero il processo di formazione e germinazione di nuovi vasi, l'ischemia diventerebbe molto meno pronunciata e la vita diventerebbe molto più facile per i pazienti.

Terapia genetica oggi può essere definito come il trattamento delle malattie introducendo geni nelle cellule dei pazienti per modificare specificamente i difetti genetici o conferire alle cellule nuove funzioni. I primi studi clinici sui metodi di terapia genica sono stati intrapresi di recente, il 22 maggio 1989, allo scopo di diagnosticare il cancro. La prima malattia ereditaria per la quale sono stati applicati metodi di terapia genica è stata l’immunodeficienza ereditaria.

Ogni anno aumenta il numero di studi clinici di successo sul trattamento varie malattie l'utilizzo della terapia genica è in crescita e a gennaio 2014 ha raggiunto i 2mila.

Allo stesso tempo, nella ricerca moderna sulla terapia genica è necessario tenere conto del fatto che le conseguenze della manipolazione dei geni o del DNA “mischiato” (ricombinante) in vivo(dal latino letteralmente “nei vivi”) non sono stati sufficientemente studiati. Nei paesi con il livello più avanzato di ricerca in questo settore, soprattutto negli Stati Uniti, i protocolli medici che utilizzano sequenze di DNA sensoriale sono soggetti a revisione obbligatoria da parte dei comitati e delle commissioni competenti. Negli Stati Uniti si tratta del Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) e della Drug Administration. prodotti alimentari(Food and Drug Administration, FDA), seguita dall’approvazione obbligatoria del progetto da parte del direttore del National Institutes of Health.

Quindi lo abbiamo deciso questo trattamento si basa sul fatto che se alcuni tessuti del corpo mancano di determinati fattori proteici individuali, allora questo può essere corretto introducendo i geni corrispondenti che codificano per le proteine ​​in questi tessuti, e tutto diventerà più o meno meraviglioso. Non sarà possibile introdurre le proteine ​​stesse, perché il nostro organismo reagirebbe immediatamente con una forte reazione immunitaria e la durata dell'azione sarebbe insufficiente. Ora devi decidere il metodo per fornire il gene alle cellule.

Trasfezione cellule

Innanzitutto, vale la pena introdurre le definizioni di alcuni termini.

Il trasporto genico viene effettuato grazie a vettoreè una molecola di DNA usata come " veicolo"per il trasferimento artificiale di informazioni genetiche in una cellula. Esistono molti tipi di vettori: plasmidici, virali, ma anche cosmidi, fasmidi, cromosomi artificiali, ecc. È di fondamentale importanza che i vettori (in particolare quelli plasmidici) abbiano proprietà loro caratteristiche:

1. Origine della replicazione (ori)- la sequenza di nucleotidi da cui inizia la duplicazione del DNA. Se il DNA vettore non può raddoppiarsi (replicarsi), l'effetto terapeutico necessario non sarà raggiunto, perché verrà semplicemente scomposto rapidamente dagli enzimi nucleasi intracellulari e, a causa della mancanza di modelli, alla fine si formeranno molte meno molecole proteiche. Va notato che questi punti sono specifici per ogni specie biologica, cioè se si suppone che il DNA vettore si ottenga propagandolo in una coltura batterica (e non solo mediante sintesi chimica, che di solito è molto più costosa), allora due saranno necessarie origini di replicazione separate: per gli esseri umani e per i batteri;

2. Siti di restrizione- specifiche brevi sequenze (solitamente palindromiche), che vengono riconosciute da speciali enzimi (endonucleasi di restrizione) e da loro tagliate in un certo modo - con la formazione di "estremità appiccicose" (Fig. 1).

Fig.1 Formazione di “estremità appiccicose” con la partecipazione di enzimi di restrizione

Questi siti sono necessari per ricucire il DNA vettoriale (che, in sostanza, è un “grezzo”) con i geni terapeutici desiderati in un'unica molecola. Tale molecola reticolata da due o più parti è detta “ricombinante”;

3. È chiaro che vorremmo ottenere milioni di copie di una molecola di DNA ricombinante. Ancora una volta, se abbiamo a che fare con una coltura cellulare batterica, allora questo DNA deve essere isolato. Il problema è che non tutti i batteri ingeriscono la molecola di cui abbiamo bisogno; alcuni non lo fanno. Per distinguere questi due gruppi, inseriscono marcatori selettivi- aree di resistenza a determinati sostanze chimiche; Ora, se aggiungi queste stesse sostanze all'ambiente, solo quelle che sono resistenti ad esse sopravvivranno e il resto morirà.

Tutti questi tre componenti possono essere osservati nel primissimo plasmide sintetizzato artificialmente (Fig. 2).

Fig.2

Viene chiamato il processo di introduzione di un vettore plasmidico in determinate cellule trasfezione. Un plasmide è una molecola di DNA abbastanza corta e solitamente circolare che si trova nel citoplasma di una cellula batterica. I plasmidi non sono associati al cromosoma batterico, possono replicarsi indipendentemente da esso e possono essere rilasciati dal batterio ambiente o, al contrario, essere assorbito (il processo di assorbimento è trasformazione). Con l'aiuto dei plasmidi, i batteri possono scambiarsi informazioni genetiche, ad esempio trasmettendo resistenza a determinati antibiotici.

I plasmidi esistono naturalmente nei batteri. Ma nessuno può impedire a un ricercatore di sintetizzare artificialmente un plasmide che avrà le proprietà di cui ha bisogno, inserendovi un inserto genetico e introducendolo nella cellula. Nello stesso plasmide possono essere inseriti diversi inserti .

Metodi di terapia genica

Esistono due approcci principali, che differiscono nella natura delle cellule bersaglio:

1. Fetale, in cui il DNA estraneo viene introdotto nello zigote (uovo fecondato) o nell'embrione fase iniziale sviluppo; in questo caso si prevede che il materiale introdotto penetri in tutte le cellule del ricevente (e anche nelle cellule germinali, garantendo così la trasmissione alla generazione successiva). Nel nostro Paese è addirittura vietato;

2. Somatico, in cui il materiale genetico viene introdotto nelle cellule non riproduttive di una persona già nata e non viene trasmesso alle cellule germinali.

Terapia genetica in vivo basato su introduzione diretta sequenze di DNA clonate (moltiplicate) e impacchettate in un certo modo in determinati tessuti del paziente. Particolarmente promettente per il trattamento delle malattie genetiche in vivo è l'introduzione di geni mediante aerosol o vaccini iniettati. È in fase di sviluppo la terapia genica aerosolizzata, tipicamente per il trattamento malattie polmonari(fibrosi cistica, cancro ai polmoni).

Ci sono molti passaggi coinvolti nello sviluppo di un programma di terapia genica. Ciò include un'analisi approfondita dell'espressione tessuto-specifica del gene corrispondente (cioè la sintesi sulla matrice di un gene di alcune proteine ​​in un determinato tessuto), l'identificazione di un difetto biochimico primario e uno studio della struttura, della funzione e distribuzione intracellulare del suo prodotto proteico, nonché un'analisi biochimica del processo patologico. Tutti questi dati vengono presi in considerazione durante la stesura del protocollo medico appropriato.

È importante che quando si elaborano schemi di correzione genetica, vengano valutati l'efficienza della trasfezione e il grado di correzione del difetto biochimico primario in condizioni di coltura cellulare ( in vitro,"in vitro") e, soprattutto, in vivo su modelli biologici animali. Solo dopo potrà iniziare il programma di sperimentazione clinica .

Consegna diretta e portatori cellulari di geni terapeutici

Esistono molti metodi per introdurre DNA estraneo in una cellula eucariotica: alcuni dipendono dal trattamento fisico (elettroporazione, magnetofezione, ecc.), altri dipendono dall'applicazione materiali chimici o particelle biologiche (ad esempio virus) utilizzate come vettori. Vale la pena menzionare subito quella sostanza chimica e metodi fisici(ad esempio elettroporazione + avvolgimento del DNA con liposomi)

Metodi diretti

1. La trasfezione su base chimica può essere classificata in diversi tipi: utilizzando una sostanza ciclodestrina, polimeri, liposomi o nanoparticelle (con o senza funzionalizzazione chimica o virale, cioè modificazione della superficie).
a) Uno dei metodi più economici è utilizzare il fosfato di calcio. Aumenta l’efficienza dell’incorporazione del DNA nelle cellule di 10-100 volte. Il DNA forma un forte complesso con il calcio, che ne garantisce l'assorbimento efficace. Svantaggio: solo circa l'1-10% del DNA raggiunge il nucleo. Metodo utilizzato in vitro per trasferire il DNA nelle cellule umane (Fig. 3);

Fig.3

b) L'uso di molecole organiche altamente ramificate - dendrimero, per legare il DNA e trasferirlo nella cellula (Fig. 4);

Fig.4

c) Un metodo molto efficace per la trasfezione del DNA è la sua introduzione attraverso i liposomi - piccoli corpi circondati da membrana che possono fondersi con la membrana citoplasmatica cellulare (CPM), che è un doppio strato di lipidi. Per cellule eucariotiche la trasfezione è più efficiente utilizzando i liposomi cationici perché le cellule sono più sensibili ad essi. Il processo ha il suo nome: lipofezione. Questo metodo è considerato uno dei più sicuri oggi. I liposomi sono non tossici e non immunogenici. Tuttavia, l’efficienza del trasferimento genico mediante liposomi è limitata, poiché il DNA che essi introducono nelle cellule viene solitamente immediatamente catturato dai lisosomi e distrutto. L'introduzione del DNA nelle cellule umane utilizzando i liposomi è oggi il pilastro della terapia. in vivo(figura 5);

Fig.5

d) Un altro metodo è l'uso di polimeri cationici come il dietilamminoetil destrano o la polietilenimmina. Le molecole di DNA caricate negativamente si legano a policationi caricati positivamente e questo complesso entra ulteriormente nella cellula per endocitosi. Il DEAE-destrano modifica le proprietà fisiche della membrana plasmatica e stimola l'assorbimento di questo complesso nella cellula. Lo svantaggio principale del metodo è che il DEAE-destrano è tossico in alte concentrazioni. Il metodo non si è diffuso nella terapia genica;

e) Con l'aiuto di istoni e altre proteine ​​nucleari. Queste proteine, contenenti molti amminoacidi caricati positivamente (Lys, Arg), in condizioni naturali aiutano a compattare una lunga catena di DNA in un nucleo cellulare relativamente piccolo.

2. Metodi fisici:

a) L'elettroporazione è un metodo molto diffuso; Un immediato aumento della permeabilità della membrana si ottiene sottoponendo le cellule a brevi esposizioni ad un intenso campo elettrico. È stato dimostrato che in condizioni ottimali il numero di trasformanti può raggiungere l'80% delle cellule sopravvissute. Attualmente non è utilizzato negli esseri umani (Fig. 6).

Fig.6

b) Il “Cell squeezing” è un metodo inventato nel 2013. Permette di trasportare molecole nelle cellule “comprimendo delicatamente” la membrana cellulare. Il metodo elimina la possibilità di tossicità o di targeting errato poiché non si basa su materiali esterni o campi elettrici;

c) La sonoporazione è un metodo per trasferire artificialmente il DNA estraneo nelle cellule esponendole agli ultrasuoni, provocando l'apertura dei pori nella membrana cellulare;
d) Trasfezione ottica - un metodo in cui viene praticato un minuscolo foro nella membrana (circa 1 μm di diametro) utilizzando un laser altamente focalizzato;
e) Trasfezione idrodinamica - un metodo per fornire costrutti genetici, proteine, ecc. da un aumento controllato della pressione nei capillari e nel fluido intercellulare, che provoca un aumento a breve termine della permeabilità delle membrane cellulari e la formazione di pori temporanei in esse. Viene effettuato mediante iniezione rapida nel tessuto e il rilascio non è specifico. Efficienza di consegna per il muscolo scheletrico - dal 22 al 60% ;

f) Microiniezione di DNA - introduzione nel nucleo di una cellula animale utilizzando sottili microtubuli di vetro (d=0,1-0,5 µm). Lo svantaggio è la complessità del metodo, esiste un'alta probabilità di distruzione del nucleo o del DNA; è possibile trasformare un numero limitato di celle. Non per uso umano.

3. Metodi basati su particelle.

a) Un approccio diretto alla trasfezione è una pistola genetica, in cui il DNA viene concatenato in una nanoparticella con solidi inerti (solitamente oro, tungsteno), che viene poi “sparato” diretto nei nuclei delle cellule bersaglio. Questo metodo viene applicato in vitro E in vivo per introdurre geni, in particolare, nelle cellule del tessuto muscolare, ad esempio, in una malattia come la distrofia muscolare di Duchenne. La dimensione delle particelle d'oro è 1-3 micron (Fig. 7).

Fig.7

b) La magnetofezione è un metodo che utilizza le forze del magnetismo per fornire il DNA alle cellule bersaglio. Innanzitutto, gli acidi nucleici (NA) sono associati a nanoparticelle magnetiche e poi sotto l'influenza campo magnetico, le particelle vengono spinte nella cellula. L'efficacia è quasi del 100%, si nota evidente non tossicità. Entro 10-15 minuti, le particelle vengono registrate nella cella: questo è molto più veloce rispetto ad altri metodi.
c) Impalamento; "impalamento", lett. "impalamento" + "infezione") - un metodo di consegna che utilizza nanomateriali come nanotubi di carbonio e nanofibre. In questo caso le cellule vengono letteralmente forate da uno strato di nanofibrille. Il prefisso “nano” viene utilizzato per denotare le loro dimensioni molto piccole (entro i miliardesimi di metro) (Fig. 8).

Fig.8

Separatamente, vale la pena evidenziare un metodo come la trasfezione dell'RNA: non è il DNA che viene consegnato nella cellula, ma le molecole di RNA - i loro "successori" nella catena di biosintesi delle proteine; in questo caso vengono attivate speciali proteine ​​che tagliano l'RNA in brevi frammenti - i cosiddetti. piccolo RNA interferente (siRNA). Questi frammenti si legano ad altre proteine ​​e, in definitiva, ciò porta all'inibizione dell'espressione cellulare dei geni corrispondenti. In questo modo è possibile bloccare l’azione di quei geni nella cellula che potenzialmente influiscono questo momento fare più male che bene. Ampia applicazione La trasfezione dell'RNA è stata riscontrata, in particolare, in oncologia.

Vengono esaminati i principi di base della consegna genica utilizzando vettori plasmidici. Ora possiamo passare a considerare i metodi virali. I virus sono forme di vita non cellulari, il più delle volte costituiti da una molecola di acido nucleico (DNA o RNA) avvolta in rivestimento proteico. Se eliminiamo dal materiale genetico del virus tutte quelle sequenze che causano malattie, allora anche l'intero virus può essere trasformato con successo in un "veicolo" per il nostro gene.

Viene chiamato il processo di introduzione del DNA in una cellula, mediato da un virus trasduzione.
In pratica, i più comunemente utilizzati sono i retrovirus, gli adenovirus e i virus adeno-associati (AAV). Innanzitutto, vale la pena capire quale dovrebbe essere il candidato ideale per la trasduzione tra i virus. I criteri sono che deve essere:

Stabile;
. capiente, cioè da contenere quantità sufficiente DNA;
. inerte verso percorsi metabolici cellule;
. preciso - idealmente, dovrebbe integrare il suo genoma in un locus specifico del genoma del nucleo ospite, ecc.

IN vita realeè molto difficile combinare almeno diversi punti, quindi di solito la scelta viene fatta considerando ogni singolo caso separatamente (Fig. 9).

Fig.9

Dei tre virus più utilizzati elencati, il più sicuro e allo stesso tempo il più accurato è AAV. Quasi il loro unico inconveniente è la loro capacità relativamente piccola (circa 4800 bp), che, tuttavia, risulta essere sufficiente per molti geni .

Oltre ai metodi elencati, la terapia genica viene spesso utilizzata in combinazione con la terapia cellulare: in primo luogo, una coltura di alcune cellule umane viene piantata in un mezzo nutritivo, dopo di che i geni necessari vengono introdotti nelle cellule in un modo o nell'altro, coltivati per qualche tempo e ancora trapiantati nel corpo dell'ospite. Di conseguenza, le cellule possono essere riportate alle loro proprietà normali. Quindi, ad esempio, i globuli bianchi umani (leucociti) sono stati modificati per la leucemia (Fig. 10).

Fig.10

Il destino del gene dopo che è entrato nella cellula

Poiché tutto è più o meno chiaro con i vettori virali a causa della loro capacità di fornire in modo più efficiente i geni all'obiettivo finale: il nucleo, ci soffermeremo sul destino del vettore plasmidico.

SU in questa fase Siamo riusciti a far sì che il DNA abbia superato la prima grande barriera: la membrana citoplasmatica della cellula.

Successivamente, in combinazione con altre sostanze, avvolte o meno, deve raggiungere il nucleo della cellula affinché uno speciale enzima - l'RNA polimerasi - sintetizzi una molecola di RNA messaggero (mRNA) su una matrice di DNA (questo processo è chiamato trascrizione). Solo allora l'mRNA verrà rilasciato nel citoplasma, formerà un complesso con i ribosomi e, secondo codice genetico viene sintetizzato un polipeptide, ad esempio il fattore di crescita vascolare (VEGF), che inizierà a svolgere una certa funzione terapeutica (in in questo caso- avvierà il processo di formazione delle ramificazioni vascolari nei tessuti soggetti ad ischemia).

Per quanto riguarda l'espressione dei geni introdotti nel tipo cellulare richiesto, questo problema viene risolto con l'aiuto di elementi regolatori della trascrizione. Il tessuto in cui avviene l'espressione è spesso determinato dalla combinazione di un potenziatore tessuto-specifico (sequenza “potenziante”) con un promotore specifico (una sequenza di nucleotidi da cui l'RNA polimerasi inizia la sintesi), che può essere inducibile . È noto che l'attività genetica può essere modulata in vivo segnali esterni e poiché gli potenziatori possono funzionare con qualsiasi gene, nei vettori possono essere introdotti degli isolanti che aiutano l'potenziatore a funzionare indipendentemente dalla sua posizione e possono agire come barriere funzionali tra i geni. Ciascun potenziatore contiene una serie di siti di legame per l'attivazione o la soppressione dei fattori proteici. I promotori possono essere utilizzati anche per regolare il livello di espressione genica. Ad esempio, ci sono metallotioneina o promotori sensibili alla temperatura; promotori controllati dagli ormoni.

L'espressione di un gene dipende dalla sua posizione nel genoma. Nella maggior parte dei casi, i metodi virali esistenti comportano solo l’inserimento casuale di un gene nel genoma. Per eliminare tale dipendenza, durante la costruzione dei vettori, il gene viene fornito con sequenze nucleotidiche note, che consentono al gene di esprimersi indipendentemente da dove è inserito nel genoma.

Il modo più semplice per regolare l'espressione del transgene è dotarlo di un promotore indicatore sensibile a un segnale fisiologico, come il rilascio di glucosio o l'ipossia. Tali sistemi di controllo "endogeni" possono essere utili in alcune situazioni, come il controllo glucosio-dipendente della produzione di insulina. I sistemi di controllo “esogeni” sono più affidabili e universali, quando l’espressione genica è controllata farmacologicamente mediante l’introduzione di una piccola molecola di farmaco. Attualmente sono noti 4 principali sistemi di controllo: regolati dalla tetraciclina (Tet), dallo steroide insetto, dall'ecdisone o dai suoi analoghi, dal farmaco antiprogestinico mayfpristone (RU486) e dai dimerizzatori chimici come la rapamicina e i suoi analoghi. Tutti includono l'attrazione farmaco-dipendente del dominio di attivazione della trascrizione al promotore principale che porta il gene desiderato, ma differiscono nei meccanismi di questa attrazione .

Conclusione

Un esame dei dati ci permette di giungere alla conclusione che, nonostante gli sforzi di numerosi laboratori in tutto il mondo, tutto ciò che è già noto e testato in vivo E in vitro i sistemi vettoriali sono tutt’altro che perfetti . Se c'è un problema con la consegna di DNA estraneo in vitro praticamente risolto e la sua consegna alle cellule bersaglio di diversi tessuti in vivo risolto con successo (principalmente creando costrutti che trasportano proteine ​​recettoriali, compresi antigeni specifici per determinati tessuti), allora altre caratteristiche dei sistemi vettoriali esistenti - stabilità dell'integrazione, espressione regolata, sicurezza - richiedono ancora seri miglioramenti.

Si tratta innanzitutto della stabilità dell’integrazione. Finora l'integrazione nel genoma è stata ottenuta solo utilizzando vettori retrovirali o adeno-associati. L’efficienza dell’integrazione stabile può essere aumentata migliorando i costrutti genici come i sistemi mediati dai recettori o creando vettori episomali sufficientemente stabili (cioè strutture di DNA capaci di lungo soggiorno all'interno dei nuclei). Recentemente, particolare attenzione è stata prestata alla creazione di vettori basati su cromosomi artificiali di mammiferi. Grazie alla presenza di basic elementi strutturali Nei cromosomi ordinari, tali mini-cromosomi vengono trattenuti nelle cellule per lungo tempo e sono in grado di trasportare geni a grandezza naturale (genomici) e i loro elementi regolatori naturali, necessari per il corretto funzionamento del gene, nel tessuto giusto e al momento giusto.

La terapia genica e cellulare apre brillanti prospettive per il ripristino di cellule e tessuti perduti e per la progettazione di organi con l'ingegneria genetica, che senza dubbio amplierà in modo significativo l'arsenale di metodi per la ricerca biomedica e creerà nuove opportunità per preservare ed estendere la vita umana.

La terapia genica è un trattamento per malattie ereditarie e non ereditarie, che viene effettuato introducendo altri geni nelle cellule del paziente. L’obiettivo della terapia è eliminare i difetti genetici o conferire alle cellule nuove funzioni. È molto più semplice introdurre in una cellula un gene sano e perfettamente funzionante che correggere i difetti di una cellula già esistente.

La terapia genica è limitata agli studi sui tessuti somatici. Ciò è dovuto al fatto che qualsiasi intervento sul germe e sulle cellule germinali può dare un risultato completamente imprevedibile.

La tecnica attualmente utilizzata è efficace nel trattamento di malattie sia monogeniche che multifattoriali ( tumore maligno, alcuni tipi di malattie cardiovascolari gravi, malattie virali).

Circa l’80% di tutti i progetti di terapia genica riguardano l’infezione da HIV e attualmente sono in corso ricerche sull’emofilia B, sulla fibrosi cistica e sull’ipercolesterolemia.

Il trattamento prevede:

· isolamento e propagazione dei singoli tipi cellulari del paziente;

· introduzione di geni estranei;

· selezione delle cellule in cui il gene estraneo ha “attecchito”;

· impiantarli in un paziente (ad esempio, attraverso una trasfusione di sangue).

La terapia genica si basa sull'introduzione di DNA clonato nel tessuto del paziente. I vaccini per iniezione e aerosol sono considerati i metodi più efficaci.

La terapia genica funziona in due modi:

1. Trattamento delle malattie monogeniche. Questi includono disturbi nel funzionamento del cervello associati a qualsiasi danno alle cellule che producono neurotrasmettitori.

2. Trattamento I principali approcci utilizzati in quest'area:

· miglioramento genetico delle cellule immunitarie;

Aumento dell'immunoreattività del tumore;

blocco dell'espressione dell'oncogene;

· protezione delle cellule sane dalla chemioterapia;

· introduzione di geni oncosoppressori;

produzione di sostanze antitumorali cellule sane;

· produzione di vaccini antitumorali;

· riproduzione locale dei tessuti normali con l'aiuto di antiossidanti.

L’uso della terapia genica presenta numerosi vantaggi e in alcuni casi rappresenta l’unica possibilità vita normale per i malati. Tuttavia, quest’area della scienza non è stata completamente studiata. Esiste un divieto internazionale di test sulle cellule germinali e sulle cellule germinali preimpianto. Questo viene fatto per prevenire costrutti e mutazioni genetiche indesiderate.

Sono state sviluppate e generalmente accettate diverse condizioni in base alle quali sono consentiti gli studi clinici:

Il gene trasferito alle cellule bersaglio deve essere attivo per molto tempo.

In un ambiente estraneo, il gene deve mantenere la sua efficacia.

Il trasferimento genico non dovrebbe causare reazioni negative nell'organismo.

Ci sono una serie di domande che rimangono rilevanti oggi per molti scienziati di tutto il mondo:

Gli scienziati che lavorano nel campo della terapia genica saranno in grado di sviluppare una correzione genetica completa che non rappresenti una minaccia per la prole?

La necessità e il beneficio di una procedura di terapia genica per una singola coppia supereranno il rischio per il futuro dell’umanità?

Sono giustificati? procedure simili, considerando in futuro?

In che modo tali procedure sugli esseri umani si relazioneranno alle questioni di omeostasi della biosfera e della società?

In conclusione, si può notare che la terapia genetica nella fase attuale offre all'umanità i modi per curare di più malattie gravi, che fino a poco tempo fa erano considerati incurabili e mortali. Tuttavia, allo stesso tempo, lo sviluppo di questa scienza pone nuovi problemi agli scienziati che devono essere risolti oggi.

La distrofia muscolare di Duchenne è una delle malattie rare, ma ancora relativamente comune malattie genetiche. La malattia viene diagnosticata all'età di tre-cinque anni, di solito nei ragazzi, inizialmente si manifesta solo con movimenti difficili, all'età di dieci anni una persona affetta da tale distrofia muscolare non può più camminare, e all'età di 20 anni; 22 la sua vita finisce. È causata da una mutazione nel gene della distrofina, che si trova sul cromosoma X. Codifica per una proteina che collega la membrana cellulare muscolare alle fibre contrattili. Funzionalmente, è una sorta di molla che garantisce una contrazione regolare e l'integrità della membrana cellulare. Le mutazioni nel gene portano alla distrofia del tessuto muscolare scheletrico, del diaframma e del cuore. Il trattamento della malattia è palliativo e può alleviare solo leggermente la sofferenza. Tuttavia, con lo sviluppo dell’ingegneria genetica, si vede la luce alla fine del tunnel.

A proposito di guerra e pace

La terapia genica è la somministrazione di costrutti a base di acido nucleico nelle cellule per trattare le malattie genetiche. Con l'aiuto di tale terapia è possibile correggere un problema genetico a livello di DNA e RNA, modificando il processo di espressione della proteina desiderata. Ad esempio, il DNA con una sequenza corretta può essere consegnato in una cellula, con la quale viene sintetizzata una proteina funzionale. Oppure, al contrario, è possibile rimuovere alcune sequenze genetiche, il che aiuterà anche a ridurre gli effetti dannosi della mutazione. In teoria questo è semplice, ma in pratica la terapia genica si basa sulle tecnologie più complesse per lavorare con oggetti microscopici e rappresenta un insieme di know-how avanzato nel campo della biologia molecolare.

L'iniezione di DNA nel pronucleo dello zigote è una delle prime e più tradizionali tecnologie per la creazione di transgeni. L'iniezione viene eseguita manualmente utilizzando aghi ultrasottili al microscopio con ingrandimento 400x.

"Il gene della distrofina, le cui mutazioni danno origine alla distrofia muscolare di Duchenne, è enorme", afferma Vadim Zhernovkov, direttore dello sviluppo della società di biotecnologia Marlin Biotech, candidato alle scienze biologiche. “Include 2,5 milioni di coppie di nucleotidi, che potrebbero essere paragonate al numero di lettere nel romanzo Guerra e pace”. E immaginiamo di aver strappato alcune pagine importanti dell’epopea. Se queste pagine descrivessero eventi significativi, allora già comprendere il libro sarebbe difficile. Ma con il gene tutto è più complicato. Non sarebbe difficile trovare un'altra copia di Guerra e pace, e poi si potrebbero leggere le pagine mancanti. Ma il gene della distrofina si trova sul cromosoma X e negli uomini ce n'è solo uno. Pertanto, alla nascita, nei cromosomi sessuali dei maschi è conservata solo una copia del gene. Non c'è nessun posto dove trovarne un altro.

Infine, quando si sintetizzano proteine ​​dall'RNA, è importante mantenere la cornice di lettura. La cornice di lettura determina quale gruppo di tre nucleotidi viene letto come un codone, corrispondente a un amminoacido in una proteina. Se in un gene viene cancellato un frammento di DNA che non è multiplo di tre nucleotidi, la cornice di lettura cambia: la codifica cambia. Ciò potrebbe essere paragonato alla situazione in cui, dopo aver strappato le pagine dell'intero libro rimanente, tutte le lettere vengono sostituite con quelle successive dell'alfabeto. Il risultato sarà abracadabra. La stessa cosa accade con le proteine ​​sintetizzate in modo improprio”.

Cerotto biomolecolare

Uno di metodi efficaci terapia genica per ripristinare la normale sintesi proteica - salto dell'esone utilizzando brevi sequenze nucleotidiche. Marlin Biotech ha già sviluppato la tecnologia per lavorare con il gene della distrofina utilizzando questo metodo. Come è noto, nel processo di trascrizione (sintesi dell'RNA), si forma prima il cosiddetto RNA pre-template, che contiene sia regioni codificanti proteine ​​(esoni) che regioni non codificanti (introni). Successivamente inizia il processo di splicing, durante il quale gli introni e gli esoni vengono separati e si forma un RNA “maturo”, costituito solo da esoni. In questo momento alcuni esoni possono essere bloccati, “sigillati” con l'aiuto di molecole speciali. Di conseguenza, l'RNA maturo non conterrà quelle regioni codificanti di cui preferiremmo eliminare, e quindi la cornice di lettura verrà ripristinata e la proteina sarà sintetizzata.

"Abbiamo eseguito il debug di questa tecnologia in vitro", afferma Vadim Zhernovkov, cioè in colture cellulari coltivate da cellule di pazienti affetti da distrofia muscolare di Duchenne. Ma singole cellule- questo non è un organismo. Invadendo i processi cellulari, dobbiamo osservare le conseguenze dal vivo, ma non è possibile coinvolgere le persone nei test a causa di questo ragioni varie- dall'etico all'organizzativo. Pertanto, era necessario ottenere un modello animale da laboratorio della distrofia muscolare di Duchenne con determinate mutazioni”.

Come iniettare un microcosmo

Gli animali transgenici sono animali ottenuti in laboratorio in cui sono state apportate intenzionalmente e deliberatamente modifiche al loro genoma. Negli anni '70 del secolo scorso, divenne chiaro che la creazione di transgeni lo è il metodo più importante studi sulle funzioni dei geni e delle proteine. Uno dei primi metodi per ottenere un organismo completamente geneticamente modificato è stata l'iniezione di DNA nel pronucleo ("precursore del nucleo") degli zigoti delle uova fecondate. Ciò è logico, poiché è più facile modificare il genoma di un animale all’inizio del suo sviluppo.

Il diagramma mostra il processo CRISPR/Cas9, che coinvolge un RNA subgenomico (sgRNA), una sua regione che funge da RNA guida e una proteina nucleasi Cas9 che taglia entrambi i filamenti del DNA genomico nella posizione specificata dall'RNA guida.

L'iniezione nel nucleo di uno zigote è una procedura molto non banale, perché stiamo parlando di microscala. L'uovo del topo ha un diametro di 100 micron e il pronucleo è di 20 micron. L'operazione avviene al microscopio con ingrandimento 400x, ma l'iniezione è il lavoro più manuale. Naturalmente, per l'“iniezione” non viene utilizzata una siringa tradizionale, ma uno speciale ago di vetro con un canale cavo all'interno, nel quale viene raccolto il materiale genetico. Un'estremità può essere tenuta in mano e l'altra, ultrasottile e affilata, è praticamente invisibile ad occhio nudo. Naturalmente, una struttura così fragile in vetro borosilicato non può essere conservata a lungo, quindi il laboratorio ha a disposizione una serie di grezzi, che vengono estratti su una macchina speciale immediatamente prima del lavoro. Viene utilizzato uno speciale sistema di visualizzazione con contrasto della cellula senza colorazione: l'intervento nel pronucleo è di per sé traumatico ed è un fattore di rischio per la sopravvivenza della cellula. La vernice sarebbe un altro fattore simile. Fortunatamente, le uova sono abbastanza resistenti, ma il numero di zigoti che danno origine ad animali transgenici rappresenta solo una piccola percentuale del numero totale di uova in cui è stato iniettato il DNA.

La fase successiva è chirurgica. È in corso un'operazione per trapiantare zigoti microiniettati nell'ovidotto del topo ricevente, che diventerà una madre surrogata per i futuri transgeni. Il prossimo animale da laboratorio naturalmente il ciclo della gravidanza si completa e nasce la prole. Tipicamente, una lettiera contiene circa il 20% di topi transgenici, il che indica anche l'imperfezione del metodo, poiché contiene un ampio elemento di casualità. Una volta iniettati, il ricercatore non può controllare esattamente come i frammenti di DNA introdotti verranno integrati nel genoma del futuro organismo. Esiste un'alta probabilità di tali combinazioni che porteranno alla morte dell'animale nella fase embrionale. Tuttavia, il metodo funziona ed è abbastanza adatto per una serie di scopi scientifici.

Lo sviluppo di tecnologie transgeniche rende possibile la produzione di proteine ​​animali richieste dall'industria farmaceutica. Queste proteine ​​vengono estratte dal latte di capre e mucche transgeniche. Esistono anche tecnologie per ottenere proteine ​​specifiche dalle uova di gallina.

Forbici per DNA

Ma c'è di più metodo efficace basato sull’editing mirato del genoma utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9. "Oggi la biologia molecolare è in qualche modo simile all'era delle spedizioni marittime a lunga distanza a vela", afferma Vadim Zhernovkov. — Quasi ogni anno in questa scienza si verificano scoperte significative che possono cambiare le nostre vite. Ad esempio, diversi anni fa i microbiologi scoprirono l’immunità alle infezioni virali in una specie di batteri apparentemente studiata da molto tempo. Come risultato di ulteriori ricerche, si è scoperto che il DNA batterico contiene loci speciali (CRISPR), da cui vengono sintetizzati frammenti di RNA che possono legarsi in modo complementare agli acidi nucleici elementi estranei, ad esempio con virus a DNA o RNA. La proteina Cas9, che è un enzima nucleasi, si lega a tale RNA. L'RNA funge da guida per Cas9, contrassegnando una sezione specifica del DNA in cui la nucleasi effettua un taglio. Circa tre o cinque anni fa il primo lavori scientifici, che ha sviluppato la tecnologia CRISPR/Cas9 per l'editing del genoma."

I topi transgenici consentono la creazione di modelli viventi di gravi malattie genetiche umane. Le persone dovrebbero essere grate a queste piccole creature.

Rispetto al metodo che prevede l'introduzione di un costrutto per l'inserimento casuale, il nuovo metodo consente di selezionare elementi del sistema CRISPR/Cas9 in modo tale da indirizzare con precisione le guide RNA alle regioni desiderate del genoma e ottenere l'eliminazione o l'inserimento mirato di la sequenza di DNA desiderata. Anche questo metodo è soggetto a errori (l'RNA guida a volte si lega al sito sbagliato dove viene preso di mira), ma quando si utilizza CRISPR/Cas9, l'efficienza nella creazione di transgeni è già di circa l'80%. "Questo metodo ha ampie prospettive, non solo per la creazione di transgeni, ma anche in altri settori, in particolare nella terapia genica", afferma Vadim Zhernovkov. “Tuttavia, la tecnologia è solo all’inizio del suo viaggio ed è abbastanza difficile immaginare che nel prossimo futuro il codice genetico delle persone verrà corretto utilizzando CRISPR/Cas9. Sebbene esista la possibilità di errore, esiste anche il pericolo che una persona perda alcune importanti parti codificanti del genoma”.

Medicina del latte

L'azienda russa Marlin Biotech è riuscita a creare un topo transgenico in cui è riprodotta completamente la mutazione che porta alla distrofia muscolare di Duchenne, e la fase successiva sarà quella di testare le tecnologie di terapia genica. Tuttavia, la creazione di modelli di malattie genetiche umane basati su animali da laboratorio non è l’unico utilizzo possibile dei transgeni. Pertanto, in Russia e nei laboratori occidentali, si lavora nel campo della biotecnologia, consentendo di ottenere proteine ​​medicinali di origine animale importanti per l'industria farmaceutica. Mucche o capre possono fungere da produttori, in cui è possibile modificare l'apparato cellulare per la produzione delle proteine ​​contenute nel latte. È possibile estrarre proteine ​​medicinali dal latte, che si ottiene non con un metodo chimico, ma con un meccanismo naturale, che aumenterà l'efficacia del medicinale. Attualmente sono state sviluppate tecnologie per la produzione di proteine ​​medicinali come lattoferrina umana, prourochinasi, lisozima, atrina, antitrombina e altre.

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Stabilire la posizione e la sequenza del gene le cui mutazioni causano malattie specifiche, così come la mutazione stessa e metodi moderni i suoi test permettono di diagnosticare la malattia nel periodo neo- e anche prenatale dello sviluppo del corpo. Ciò consente di mitigare la manifestazione difetto genetico attraverso farmaci, dieta, trasfusioni di sangue, ecc.

Tuttavia, questo approccio non porta alla correzione del difetto stesso e, di norma, le malattie ereditarie non vengono curate. La situazione è ulteriormente complicata dal fatto che una mutazione in un gene può produrre di più conseguenze diverse sul corpo. Se una mutazione genetica provoca cambiamenti nell'attività dell'enzima che codifica, ciò può portare all'accumulo di un substrato tossico o, al contrario, alla carenza di un composto necessario per il normale funzionamento cellulare.

Un noto esempio di tale malattia è la fenilchetonuria. È causata da una mutazione nel gene dell’enzima epatico fenilalanina deidrossilasi, che catalizza la conversione della fenilalanina in tirosina. Di conseguenza, il livello di fenilalanina endogena nel sangue aumenta, causando una formazione impropria della guaina mielinica attorno agli assoni cellule nervose sistema nervoso centrale e, di conseguenza, grave ritardo mentale.

Se una mutazione colpisce un gene della proteina strutturale, ciò può portare a gravi violazioni a livello di cellule, tessuti o organi. Un esempio di tale malattia è la fibrosi cistica.

Una delezione in un gene che codifica per una proteina chiamata trasportatore fibrosi cistica, porta alla sintesi di proteine ​​difettose (mancanza di fenilalanina 508) e all'interruzione del trasporto degli ioni cloro attraverso le membrane cellulari. Una delle più conseguenze dannose Questo perché il muco che riveste e protegge i polmoni diventa anormalmente denso. Ciò rende difficile l'accesso alle cellule polmonari e ne favorisce l'accumulo microrganismi dannosi. Le cellule che rivestono le vie aeree dei polmoni muoiono e vengono sostituite da tessuto fibroso cicatrizzato (da cui il nome della malattia). Di conseguenza, il paziente muore per insufficienza respiratoria.

Le malattie ereditarie hanno manifestazioni cliniche complesse e il loro trattamento tradizionale è principalmente sintomatico: per trattare la fenilchetonuria viene prescritta una dieta priva di alanina, le proteine ​​difettose vengono sostituite con somministrazione endovenosa funzionale e viene eseguito il trapianto di midollo osseo o di altri organi per compensare le funzioni perse. . Tutte queste misure sono generalmente inefficaci, costose, richiedono molto tempo e solo pochi pazienti vivono fino alla vecchiaia. Pertanto, lo sviluppo di tipi di terapia fondamentalmente nuovi è molto importante.

Terapia genetica

Nel 1990, negli Stati Uniti, il dottor W. French Andrson fece il primo tentativo di terapia genica per curare l'immunodeficienza combinata grave (SCID) in una bambina di tre anni, Ashanti da Silva. Questa malattia è causata da una mutazione nel gene che codifica per l'adenosanadenilasi (ADA). La carenza di questo enzima contribuisce all'accumulo di adenosina e deossiadenosina nel sangue, effetto tossico che porta alla morte dei linfociti B e T sangue periferico e, di conseguenza, immunodeficienza.

I bambini affetti da questa malattia devono essere protetti da eventuali infezioni (tenuti in apposite camere sterili), poiché qualsiasi malattia può essere fatale. Quattro anni dopo l'inizio del trattamento, la bambina ha mostrato l'espressione di un ADA normalmente funzionante e un sollievo dai sintomi della SCID, permettendole di lasciare la camera sterile e vivere una vita normale.

Quindi, la possibilità fondamentale di successo terapia genetica cellule somatiche. Dagli anni '90. La terapia genica viene sperimentata per una serie di malattie genetiche, comprese quelle gravi come l’emofilia, l’AIDS, tipi diversi neoplasie maligne, fibrosi cistica, ecc. Al momento, circa 10 malattie umane possono essere curate utilizzando la transgenesi.

La diversità delle malattie genetiche ha portato allo sviluppo di numerosi approcci di terapia genica. In questo caso vengono risolti 2 problemi principali: un mezzo per fornire il gene terapeutico; un metodo per garantire la somministrazione mirata alle cellule destinate alla correzione. Ad oggi, tutti gli approcci alla terapia genica delle cellule somatiche possono essere suddivisi in due categorie: terapia ex vivo e terapia in vivo (Fig. 3.15).

Riso. 3.15. Schema di terapia genica ex vivo (a) e in vivo (a)

La terapia genica in vivo prevede la somministrazione di un gene terapeutico direttamente nelle cellule di uno specifico tessuto del paziente. Diamo un'occhiata a questi approcci in modo più dettagliato.

La terapia genica ex vivo comprende le seguenti fasi:
1) ottenere cellule difettose dal paziente e coltivarle;
2) trasferimento del gene desiderato in cellule isolate mediante trasfezione di un costrutto genetico terapeutico;
3) selezione ed espansione di cellule geneticamente corrette;
4) trapianto o trasfusione di queste cellule al paziente.

L'utilizzo delle cellule del paziente garantisce che non sviluppino una risposta immunitaria quando vengono restituite. La procedura di trasferimento del costrutto genetico deve essere efficiente e il gene normale deve essere mantenuto stabilmente ed espresso in modo continuo.

I mezzi di trasferimento genico creati dalla natura stessa sono i virus. Per ottenere vettori efficaci per la consegna dei geni, vengono utilizzati principalmente due gruppi di virus: adenovirus e retrovirus (Fig. 3.16). Nella terapia genica vengono utilizzate varianti di virus geneticamente neutralizzati.

Riso. 3.16. Virus utilizzati per creare vettori terapeutici

Riso. 3.17. Mappa genetica di un tipico retrovirus (a) e mappa di un vettore retrovirale (a)

Quando si ottiene un vettore retrovirale, il DNA a lunghezza intera del retrovirus viene inserito in un plasmide, la maggior parte del gene gag e tutti i geni pol ed env vengono rimossi e al loro posto viene inserito un gene T "terapeutico" e, se necessario , viene inserito un gene marcatore selettivo Rg con il proprio promotore (Fig. 3.17, b ). La trascrizione del gene T sarà controllata dallo stesso forte promotore localizzato nella regione 5"-LTR. Sulla base di questo schema sono stati creati vari vettori retrovirali e una dimensione massima dell'inserto di DNA di circa 8 mila bp.

Il costrutto così ottenuto può essere esso stesso utilizzato per la trasformazione, ma la sua efficienza e la successiva integrazione nel genoma della cellula ospite sono estremamente basse. Pertanto, è stata sviluppata una tecnica per impacchettare l'RNA a lunghezza intera di un vettore retrovirale in particelle virali intatte, che penetrano nella cellula con alta frequenza e sono garantite per essere integrate nel genoma ospite. A questo scopo è stata creata una linea cellulare cosiddetta “packaging”. In due diverse sezioni dei cromosomi di queste cellule sono incorporati i geni retrovirali gag e pol-env, privati ​​della capacità di impaccarsi per la mancanza della sequenza + (84*+) (Fig. 3.18).

Riso. 3.18. Schema per ottenere un vettore virale confezionato

I retrovirus infettano attivamente solo le cellule che si dividono rapidamente. Per trasferire i geni, questi vengono trattati con particelle purificate del vettore retrovirale confezionato o co-coltivate con la linea cellulare che li produce, e quindi selezionate per separare le cellule bersaglio dalle cellule confezionate.

Le cellule trasdotte vengono attentamente controllate per quanto riguarda il livello di sintesi del prodotto genetico terapeutico, l'assenza di retrovirus competenti per la replicazione e l'assenza di cambiamenti nella capacità delle cellule di crescere o funzionare.

Le cellule del midollo osseo sono le più adatte per la terapia genica. Ciò è dovuto alla presenza in esso di cellule staminali embrionali totipotenti, che possono proliferare e differenziarsi Vari tipi cellule - linfociti B e T, macrofagi, eritrociti, piastrine e osteoclasti. Sono queste cellule che vengono utilizzate per trattare una serie di malattie ereditarie, tra cui la già menzionata immunodeficienza combinata grave, la malattia di Gaucher, anemia falciforme, talassemia, osteoporosi, ecc.

Oltre alle cellule staminali totipotenti del midollo osseo, difficili da isolare e coltivare, vengono utilizzate cellule staminali del sangue del cordone ombelicale (l'uso preferito per la terapia genica nei neonati) e cellule del fegato - epatociti - per trattare l'ipercolesterolemia.

Nella terapia genica in vivo è particolarmente importante garantire la consegna del gene terapeutico alle cellule difettose. Tale consegna mirata può essere fornita da vettori modificati creati sulla base di virus in grado di infettare tipi specifici di cellule. Consideriamo l'approccio sviluppato per il trattamento della fibrosi cistica già menzionato sopra. Poiché i polmoni sono una cavità aperta, è relativamente facile fornire loro geni terapeutici. La versione clonata del gene sano è stata introdotta in un adenovirus inattivato (Fig. 3.19). La specificità di questo tipo di virus è che infetta il rivestimento dei polmoni provocando il raffreddore.

Riso. 3.19. Schema per ottenere un vettore basato sull'adenovirus

Oltre ai retrovirus e agli adenovirus, negli esperimenti di terapia genica vengono utilizzati anche altri tipi di virus, ad esempio il virus Herpes simplex. Una caratteristica speciale di questo virus del DNA a doppio filamento (152 kb) è la sua capacità di infettare specificamente i neuroni. Sono molte le malattie genetiche conosciute che colpiscono il sistema centrale e periferico sistema nervoso- tumori, disturbi metabolici, malattie neurodegenerative (morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson).

Il virus dell’herpes simplex di tipo I (HSV) è un vettore molto adatto per il trattamento di tali malattie. Il capside di questo virus si fonde con la membrana del neurone e il suo DNA viene trasportato nel nucleo. Sono stati proposti diversi metodi per trasferire un gene terapeutico utilizzando vettori HSV e sono stati condotti test con successo su animali da esperimento.

I vettori virali presentano diversi svantaggi: costo elevato, capacità di clonazione limitata e possibile risposta infiammatoria. Così, nel 1999, a seguito dello sviluppo di una risposta immunitaria insolitamente forte all'introduzione di un vettore adenovirale, morì un volontario di 18 anni che prese parte a studi farmacologici. Nel 2002, due bambini in Francia hanno sviluppato una condizione simile alla leucemia mentre erano in cura per un’immunodeficienza (introducendo geni terapeutici nelle cellule staminali utilizzando retrovirus).

Pertanto, si stanno sviluppando sistemi di rilascio di geni non virali. Il modo più semplice e inefficace è iniettare il DNA plasmidico nei tessuti. Il secondo approccio consiste nel bombardare i tessuti con microparticelle d'oro (1-3 micron) coniugate al DNA. In questo caso, i geni terapeutici vengono espressi nei tessuti bersaglio e i loro prodotti, le proteine ​​terapeutiche, entrano nel sangue. Lo svantaggio principale di questo approccio è l’inattivazione o la distruzione prematura di queste proteine ​​da parte dei componenti del sangue.

Il DNA può essere consegnato confezionandolo in un guscio lipidico artificiale. Le particelle sferiche di liposomi così ottenute penetrano facilmente nella membrana cellulare. Sono stati creati liposomi con diverse proprietà, ma finora l’efficienza di tale rilascio è bassa, poiché la maggior parte del DNA è soggetta alla distruzione lisosomiale. Inoltre, per fornire un costrutto genetico, i coniugati del DNA vengono sintetizzati con varie molecole che possono garantirne la sicurezza, la consegna mirata e la penetrazione nella cellula.

Negli ultimi anni sono stati condotti intensi esperimenti per creare un cromosoma artificiale 47, che consentirebbe di includere una grande quantità di materiale genetico con un set completo di elementi regolatori per uno o più geni terapeutici. Ciò consentirebbe di utilizzare una variante genomica di un gene terapeutico e di garantirne così la stabilità e l'efficace espressione a lungo termine. Gli esperimenti hanno dimostrato che la creazione di un cromosoma umano artificiale contenente geni terapeutici è del tutto possibile, ma non è ancora chiaro come introdurre una molecola così enorme nel nucleo di una cellula bersaglio.

Le principali sfide che deve affrontare la terapia genica, oltre al rischio di gravi danni reazione immunitaria, sono le difficoltà di conservazione e funzionamento a lungo termine del DNA terapeutico nel corpo del paziente, la natura multigenica di molte malattie, che le rende bersagli difficili per la terapia genica, nonché il rischio di utilizzare virus come vettori.

SUL. Voinov, T.G. Volova