Trasferimento genico vettoriale. Vettori virali

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Questo lavoro è stato presentato al concorso di articoli scientifici divulgativi nella categoria “Miglior recensione”.

Artigli mortali

L’umanità si trova di fronte a questo malattia misteriosa anche prima della nostra era. Scienziati in varie parti del mondo hanno cercato di capirlo e curarlo: in Antico Egitto- Ebers, in India - Sushruta, Grecia - Ippocrate. Tutti loro e molti altri medici hanno combattuto contro un nemico pericoloso e serio: il cancro. E sebbene questa battaglia continui ancora oggi, è difficile determinare se esiste una possibilità di vittoria completa e definitiva. Dopotutto, più studiamo la malattia, più spesso sorgono domande: è possibile curare completamente il cancro? Come evitare la malattia? È possibile rendere il trattamento rapido, accessibile ed economico?

Grazie a Ippocrate e al suo spirito di osservazione (fu lui a vedere la somiglianza tra un tumore e i tentacoli del cancro), il termine comparve negli antichi trattati di medicina carcinoma(greco carcinos) o cancro(lat. cancro). IN pratica medica le neoplasie maligne sono classificate diversamente: carcinomi (da tessuti epiteliali), sarcomi (da tessuti connettivi, muscolari), leucemia (nel sangue e midollo osseo), linfoma (in sistema linfatico) e altri (si sviluppano in altri tipi di cellule, ad esempio il glioma - cancro al cervello). Ma nella vita di tutti i giorni il termine "cancro" è più popolare, il che significa qualsiasi cosa tumore maligno.

Mutazioni: morire o vivere per sempre?

Numerose ricerca genetica scoperto che la presenza di cellule tumorali è il risultato di cambiamenti genetici. Errori nella replicazione (copia) e nella riparazione (correzione degli errori) del DNA portano a cambiamenti nei geni, compresi quelli che controllano la divisione cellulare. I principali fattori che contribuiscono al danno genomico, e successivamente all’acquisizione di mutazioni, sono endogeni (attack i radicali liberi formati durante il metabolismo, instabilità chimica di alcune basi del DNA) ed esogeni (radiazioni ionizzanti e UV, cancerogeni chimici). Quando le mutazioni si stabiliscono nel genoma, promuovono la trasformazione delle cellule normali in cellule tumorali. Tali mutazioni si verificano principalmente nei proto-oncogeni, che normalmente stimolano la divisione cellulare. Di conseguenza, il gene può essere costantemente "attivo" e la mitosi (divisione) non si ferma, il che, di fatto, significa degenerazione maligna. Se si verificano mutazioni inattivanti nei geni che normalmente inibiscono la proliferazione (geni oncosoppressori), si perde il controllo sulla divisione e la cellula diventa “immortale” (Fig. 1).

Figura 1. Modello genetico del cancro: cancro del colon. Il primo passo è la perdita o l'inattivazione di due alleli del gene APS sul quinto cromosoma. Quando cancro familiare(poliposi adenomatosa familiare, FAP) viene ereditata una mutazione del gene APC. La perdita di entrambi gli alleli porta alla formazione di adenomi benigni. Le successive mutazioni dei geni sui cromosomi 12, 17, 18 di un adenoma benigno possono portare alla trasformazione in un tumore maligno. Fonte: .

È ovvio che lo sviluppo alcuni tipi i tumori comportano cambiamenti nella maggior parte o addirittura in tutti questi geni e possono progredire in vari modi. Ne consegue che ogni tumore dovrebbe essere considerato come un oggetto biologicamente unico. Oggi esistono speciali database di informazioni genetiche sul cancro contenenti dati su 1,2 milioni di mutazioni provenienti da 8207 campioni di tessuto relativi a 20 tipi di tumori: il Cancer Genome Atlas e il Catalogo delle mutazioni somatiche nel cancro in cancro (COSMIC)).

Il risultato di un malfunzionamento dei geni è la divisione cellulare incontrollata e, nelle fasi successive, la metastasi vari organi e parti del corpo da vasi sanguigni e vasi linfatici. Questo è un processo piuttosto complesso e attivo che consiste in diverse fasi. Separato cellule cancerogene separati dal fuoco primario e si diffondono attraverso il sangue in tutto il corpo. Quindi, utilizzando recettori speciali, si attaccano alle cellule endoteliali ed esprimono proteinasi, che scompongono le proteine ​​della matrice e formano pori nella membrana basale. Dopo aver distrutto la matrice extracellulare, le cellule tumorali migrano in profondità nei tessuti sani. A causa della stimolazione autocrina, si dividono per formare un nodo (1-2 mm di diametro). Con la mancanza di nutrizione, alcune cellule del nodo muoiono e tali micrometastasi “dormienti” possono rimanere latenti nei tessuti dell'organo per un periodo piuttosto lungo. IN condizioni favorevoli il nodo cresce, il gene per il fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF) e il fattore di crescita dei fibroblasti (FGFb) viene attivato nelle cellule e viene avviata l'angiogenesi (formazione vasi sanguigni) (figura 2).

Tuttavia, le cellule sono dotate di meccanismi speciali che proteggono dallo sviluppo di tumori:

Metodi tradizionali e loro svantaggi

Se i sistemi di difesa dell’organismo falliscono e il tumore comincia comunque a svilupparsi, solo l’intervento medico può salvarlo. Per lungo periodo I medici utilizzano tre principali terapie “classiche”:

• chirurgico ( rimozione completa tumori). Utilizzato quando il tumore è piccolo e ben localizzato. Rimuovere anche alcuni dei tessuti con cui entrano in contatto neoplasia maligna. La metodica non viene utilizzata in presenza di metastasi;
• radiazione - irradiazione del tumore con particelle radioattive per fermare e prevenire la divisione delle cellule tumorali. Anche le cellule sane sono sensibili a queste radiazioni e spesso muoiono;
• chemioterapia: i farmaci vengono utilizzati per inibire la crescita delle cellule che si dividono rapidamente. Vengono forniti medicinali impatto negativo e sulle cellule normali.

Gli approcci sopra descritti non possono sempre salvare un paziente dal cancro. Spesso quando trattamento chirurgico rimangono singole cellule tumorali e il tumore può ripresentarsi e con la chemioterapia e la radioterapia si verificano effetti collaterali (diminuzione dell'immunità, anemia, perdita di capelli, ecc.), che portano a conseguenze serie, e spesso fino alla morte del paziente. Tuttavia, ogni anno i trattamenti tradizionali migliorano e emergono nuovi trattamenti in grado di sconfiggere il cancro, come la terapia biologica, terapia ormonale, l’uso di cellule staminali, trapianto di midollo osseo e varie terapie di supporto. La terapia genica è considerata la più promettente, poiché mira alla causa principale del cancro: la compensazione per il malfunzionamento di alcuni geni.

La terapia genica come prospettiva

Secondo PubMed, l'interesse per terapia genetica(GT) malattie tumorali sta crescendo rapidamente e oggi la GT combina una serie di tecniche che operano sulle cellule tumorali nel corpo ( in vivo) e al di fuori di esso ( ex vivo) (figura 3).

Figura 3. Due principali strategie di terapia genica. Ex-vivo- il materiale genetico viene trasferito mediante vettori in cellule coltivate in coltura (trasduzione), quindi le cellule transgeniche vengono introdotte nel ricevente; in vivo- introduzione di un vettore con il gene desiderato in un tessuto o organo specifico. Immagine da.

Terapia genetica in vivo comporta il trasferimento genico: l'introduzione di costrutti genetici nelle cellule tumorali o nei tessuti che circondano il tumore. Terapia genetica ex vivo consiste nell’isolare le cellule tumorali di un paziente, inserendovi un gene terapeutico “sano”. genoma del cancro e reintroducendo le cellule trasdotte nel corpo del paziente. Per tali scopi vengono utilizzati vettori speciali creati con metodi Ingegneria genetica. Di norma, si tratta di virus che identificano e distruggono le cellule tumorali, pur rimanendo innocui per i tessuti sani del corpo o per i vettori non virali.

Vettori virali

Come vettori virali vengono utilizzati retrovirus, adenovirus, virus adeno-associati, lentivirus, virus dell'herpes e altri. Questi virus differiscono per efficienza di trasduzione, interazione con le cellule (riconoscimento e infezione) e DNA. Il criterio principale è la sicurezza e l'assenza del rischio di diffusione incontrollata del DNA virale: se i geni vengono inseriti nel posto sbagliato nel genoma umano, possono creare mutazioni dannose e avviare lo sviluppo di un tumore. È anche importante considerare il livello di espressione dei geni trasferiti al fine di prevenire processi infiammatori o reazioni immunitarie organismo durante l'ipersintesi delle proteine ​​​​bersaglio (Tabella 1).

Vettori non virali

I vettori non virali vengono utilizzati anche per trasferire il DNA transgenico. Supporti polimerici medicinali- progetti realizzati con nanoparticelle - vengono utilizzati per la somministrazione di farmaci a basso peso molecolare, ad esempio oligonucleotidi, peptidi, siRNA. Grazie a piccole dimensioni, le nanoparticelle vengono assorbite dalle cellule e possono penetrare nei capillari, il che è molto conveniente per fornire molecole "medicinali" nei luoghi più inaccessibili del corpo. Questa tecnica spesso utilizzato per inibire l’angiogenesi tumorale. Ma esiste il rischio che le particelle si accumulino in altri organi, come nel midollo osseo, il che può portare a conseguenze imprevedibili. I metodi non virali più popolari per trasportare il DNA sono i liposomi e l’elettroporazione.

Sintetico liposomi cationici sono attualmente riconosciuti come un metodo promettente per fornire geni funzionali. La carica positiva sulla superficie delle particelle garantisce la fusione con quelle caricate negativamente membrane cellulari. I liposomi cationici neutralizzano la carica negativa della catena del DNA, rendono la sua struttura spaziale più compatta e favoriscono un'efficace condensazione. Il complesso plasmide-liposoma presenta una serie di importanti vantaggi: può ospitare costrutti genetici di dimensioni quasi illimitate, non vi è alcun rischio di replicazione o ricombinazione e praticamente non provoca una risposta immunitaria nel corpo ospite. Lo svantaggio di questo sistema è la breve durata effetto terapeutico, e con la somministrazione ripetuta possono comparire effetti collaterali.

Elettroporazioneè un metodo popolare di consegna del DNA non virale che è abbastanza semplice e non induce una risposta immunitaria. Con l'aiuto dell'indotto impulsi elettrici I pori si formano sulla superficie delle cellule e il DNA plasmidico penetra facilmente nello spazio intracellulare. Terapia genetica in vivo l'uso dell'elettroporazione ha dimostrato la sua efficacia in numerosi esperimenti sui tumori dei topi. In questo caso, qualsiasi gene può essere trasferito, ad esempio i geni delle citochine (IL-12) e i geni citotossici (TRAIL), il che contribuisce allo sviluppo di un'ampia gamma di strategie terapeutiche. Inoltre, questo approccio può essere efficace per il trattamento sia dei tumori metastatici che primari.

Selezione dell'attrezzatura

A seconda del tipo di tumore e della sua progressione, viene selezionato il metodo di trattamento più efficace per il paziente. Ad oggi sono state sviluppate nuove promettenti tecniche di terapia genica contro il cancro, tra cui l'HT oncolitica virale, l'HT profarmaco (terapia con profarmaco), l'immunoterapia, l'HT utilizzando cellule staminali.

Terapia genica virale oncolitica

Questa tecnica utilizza virus che, con l'aiuto di speciali manipolazioni genetiche, diventano oncolitici: smettono di riprodursi nelle cellule sane e colpiscono solo le cellule tumorali. Un buon esempio Tale terapia è ONYX-015, un adenovirus modificato che non esprime la proteina E1B. In assenza di questa proteina, il virus non può replicarsi nelle cellule con un gene p53 normale. Due vettori basati sul virus dell’herpes simplex (HSV-1) – G207 e NV1020 – portano anche mutazioni in diversi geni per replicarsi solo nelle cellule tumorali. Il grande vantaggio della tecnica è che durante l'esecuzione iniezioni endovenose I virus oncolitici vengono trasportati nel sangue in tutto il corpo e possono combattere le metastasi. I principali problemi che sorgono quando si lavora con i virus sono possibile rischio il verificarsi di una risposta immunitaria nel corpo del ricevente, nonché l’integrazione incontrollata di costrutti genetici nel genoma delle cellule sane e, di conseguenza, la comparsa di un tumore canceroso.

Terapia profarmaco enzimatica mediata dai geni

Si basa sull’introduzione di geni “suicidi” nel tessuto tumorale, a seguito dei quali le cellule tumorali muoiono. Questi transgeni codificano per enzimi che attivano i citostatici intracellulari, i recettori del TNF e altri componenti importanti per l'attivazione dell'apoptosi. La combinazione suicida dei geni del profarmaco dovrebbe idealmente corrispondere seguenti requisiti: espressione genica controllata; corretta conversione del profarmaco selezionato in un agente antitumorale attivo; attivazione completa del profarmaco senza ulteriori enzimi endogeni.

Lo svantaggio della terapia è che i tumori contengono tutto meccanismi di difesa, caratteristico cellule sane, e si adattano gradualmente ai fattori dannosi e ai profarmaci. Il processo di adattamento è facilitato dall'espressione di citochine (regolazione autocrina), fattori regolatori ciclo cellulare(selezione dei cloni tumorali più resistenti), gene MDR (responsabile della sensibilità ad alcuni farmaci).

Immunoterapia

Grazie alla terapia genica Ultimamente L'immunoterapia ha iniziato a svilupparsi attivamente - nuovo approccio per il trattamento del cancro utilizzando vaccini antitumorali. La strategia principale del metodo è immunizzazione attiva corpo contro antigeni tumorali (TAA) utilizzando la tecnologia di trasferimento genico [?18].

La principale differenza tra i vaccini ricombinanti e gli altri farmaci è che aiutano il sistema immunitario del paziente a riconoscere le cellule tumorali e a distruggerle. Nella prima fase, le cellule tumorali vengono ottenute dal corpo del ricevente (cellule autologhe) o da linee cellulari speciali (cellule allogeniche), e poi coltivate in vitro. Affinché queste cellule possano essere riconosciute dal sistema immunitario, vengono introdotti uno o più geni che producono molecole immunostimolanti (citochine) o proteine ​​con un numero maggiore di antigeni. Dopo queste modifiche, le cellule continuano ad essere coltivate, quindi lisate e si ottiene il vaccino finito.

Un'ampia varietà di vettori virali e non virali per i transgeni consente la sperimentazione vari tipi cellule immunitarie (ad esempio, cellule T citotossiche e cellule dendritiche) per inibire la risposta immunitaria e la regressione delle cellule tumorali. Negli anni 90, è stato proposto che i linfociti infiltranti il ​​tumore (TIL) fossero una fonte di linfociti T citotossici (CTL) e di cellule natural killer (NK) per le cellule tumorali. Poiché TIL può essere facilmente manipolato ex vivo, sono diventati i primi geneticamente modificati cellule immunitarie, che sono stati utilizzati per l'immunoterapia antitumorale. Nelle cellule T rimosse dal sangue di un malato di cancro, i geni responsabili dell’espressione dei recettori per gli antigeni del cancro vengono modificati. Possono anche essere aggiunti geni per aumentare le probabilità che le cellule T modificate sopravvivano e entrino nel tumore in modo più efficiente. Con l'aiuto di tali manipolazioni vengono creati "assassini" altamente attivi di cellule tumorali.

Quando fu dimostrato che la maggior parte dei tumori possiede antigeni specifici ed è in grado di indurre propri meccanismi di difesa, si ipotizzò che bloccando sistema immunitario le cellule tumorali faciliteranno il rigetto del tumore. Pertanto, per la produzione della maggior parte dei vaccini antitumorali, come fonte di antigeni vengono utilizzate cellule tumorali del paziente o cellule allogeniche speciali. I principali problemi dell’immunoterapia tumorale sono la probabilità di reazioni autoimmuni nel corpo del paziente, l’assenza di una risposta antitumorale, l’immunostimolazione della crescita del tumore e altri.

Cellule staminali

Un potente strumento per la terapia genica è l'uso di cellule staminali come vettori per il trasferimento di agenti terapeutici: citochine immunostimolanti, geni suicidi, nanoparticelle e proteine ​​antiangiogeniche. Le cellule staminali (SC), oltre alla capacità di autorinnovarsi e differenziarsi, hanno un enorme vantaggio rispetto alle altre sistemi di trasporto(nanopolimeri, virus): l'attivazione del profarmaco avviene direttamente nei tessuti tumorali, evitando la tossicità sistemica (l'espressione dei transgeni contribuisce alla distruzione delle sole cellule tumorali). Un'ulteriore qualità positiva è lo stato “privilegiato” delle SC autologhe: le cellule proprie utilizzate garantiscono la compatibilità al 100% e aumentano il livello di sicurezza della procedura. Tuttavia, l'efficacia della terapia dipende dalla correttezza ex vivo trasferimento del gene modificato al CS e successivo trasferimento delle cellule trasdotte nel corpo del paziente. Inoltre, prima di utilizzare la terapia su larga scala, è necessario studiarla in dettaglio modi possibili trasformazione delle SC in cellule tumorali e sviluppare misure di sicurezza per prevenire la trasformazione cancerogena delle SC.

Conclusione

In sintesi, possiamo affermare con sicurezza che sta arrivando l'era della medicina personalizzata, in cui verrà selezionato un farmaco specifico per il trattamento di ciascun malato di cancro. terapia efficace. Già in fase di sviluppo programmi individuali trattamenti che forniscono tempestivo e cura adeguata e portare ad un miglioramento significativo delle condizioni dei pazienti. Approcci evolutivi per l'oncologia personalizzata, come l'analisi genomica, la produzione di farmaci mirati, la terapia genica contro il cancro e diagnostica molecolare l’utilizzo dei biomarcatori sta già dando i suoi frutti.

Particolarmente metodo promettente La cura per il cancro è la terapia genica. SU questo momento Vengono condotti attivamente studi clinici, che spesso confermano l'efficacia dell'HT nei casi in cui è standard trattamento antitumorale- chirurgia, radioterapia e la chemioterapia non aiuta. Lo sviluppo di metodi innovativi di HT (immunoterapia, viroterapia oncolitica, terapia “suicida”, ecc.) potrà risolvere il problema dell’elevata mortalità per cancro e, forse, in futuro, la diagnosi di “cancro” non sarà più suona come una condanna a morte.

Cancro: riconoscere, prevenire ed eliminare la malattia.

Letteratura

1. Williams S. Klug, Michael R. Cummingm. Mondo della biologia e della medicina. Nozioni di base di genetica. Mosca: Tekhnosfera, 2007. - 726 p.;
2. Bioinformatica: grandi database contro Big P;
3. Cui H., Cruz-Correa M. et al. (2003).

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Vettori retrovirali

L'esperienza derivante da studi clinici condotti su più di 200 pazienti mostra che i vettori retrovirali con replicazione difettosa non causano alcun effetto avverso. effetti collaterali. Tuttavia, la sicurezza del loro utilizzo continua a essere presa in considerazione Grande importanza. È stato creato un costrutto chiamato plasmavirus che contiene geni retrovirali bavaglio E poh sotto il controllo di 5"-LTR-npoMOTopa, nonché di un gene “terapeutico” e di un gene ambiente, guidato dal promotore del citomegalovirus. Dopo la trasfezione, il plasmavirus innesca la formazione di particelle virali difettose nella replicazione e la probabilità di ricombinazione per formare retrovirus competenti per la replicazione è molto bassa. Il vettore non può trasportare più di 3,5 kb. Il DNA, ma anche la lunghezza della maggior parte dei potenziali cDNA “terapeutici” e dei geni oncosoppressori è di 0,5–2 kb.

Ulteriori miglioramenti sono stati apportati al sistema del vettore retrovirale: il numero delle particelle virali risultanti è stato aumentato, l'efficienza della trasduzione è stata aumentata, è stata effettuata una modificazione dell'ingegneria genetica per garantire la loro penetrazione nelle cellule che non si dividono e la specificità dei vettori retrovirali. il contagio è aumentato. IN quest'ultimo caso il genoma del vettore retrovirale ricombinante è racchiuso nell'involucro di un altro virus, la cui proteina determina la specificità di legame del retrovirus e la gamma di cellule che infetta. Questo fenomeno è chiamato mescolamento fenotipico (formazione di pseudotipi). Il virus fenotipicamente misto è prodotto mediante cotrasfezione linea cellulare, che sintetizza i prodotti genetici bavaglio E pol vettore retrovirale ricombinante e vettore di espressione genica ambiente un altro virus. Cambiando un gene ambiente,è possibile restringere lo spettro delle cellule infette dal virus a un tipo strettamente definito oppure espanderlo. Inoltre, nel gene ambiente retrovirus, è possibile inserire una sequenza nucleotidica che codifica un peptide che si lega ad uno specifico recettore cellulare e garantisce l'introduzione di un retrovirus ricombinante nell'organismo celle richieste. Infine, la specificità dell'espressione genica terapeutica può essere ottenuta sotto il controllo di un promotore cellula-specifico.

Vettori adenovirali

Gli adenovirus infettano le cellule umane che non si dividono e sono ampiamente utilizzati come vaccini vivi che prevengono Infezioni respiratorie e gastroenterite, senza fornire effetto collaterale. Queste proprietà rendono gli adenovirus promettenti per la consegna di geni alle cellule bersaglio.

Per ottenere un vettore adenovirale, una linea cellulare che sintetizza i prodotti del gene adenovirale E1 è stata cotrasfettata con due sezioni del genoma dell'adenovirus (Fig. 21.7). Uno di loro potrebbe esistere come gatasmide Escherichia coli e contiene, al posto della regione E1, un gene “terapeutico”, fiancheggiato da sequenze nucleotidiche dell'adenovirus, e il secondo è una molecola di DNA di adenovirus priva della regione terminale 5" comprendente la regione El, e presenta una regione sovrapposta con il plasmide che trasporta il gene terapeutico. La ricombinazione tra i due frammenti di DNA trasfettanti nell'area della loro sovrapposizione porta al ripristino del gene adenovirale a lunghezza intera, in cui si trova il gene terapeutico al posto della regione E1 i prodotti forniti dalla cellula ospite avviano la formazione di particelle virali rilasciate dalla cellula a seguito della lisi. In assenza di ricombinazione, le molecole di DNA trasfettante che sono di lunghezza insufficiente non possono essere impacchettate in particelle virali tra la regione E1 nel genoma della cellula ospite e il DNA di un adenovirus ricombinante per formare virus competenti per la replicazione è estremamente bassa.

Dopo che un adenovirus ricombinante ha infettato una cellula bersaglio, il suo DNA entra nel nucleo, dove viene espresso il gene “terapeutico”. DNA ricombinante non si integra nel cromosoma e persiste per un breve periodo, pertanto, quando si effettua la terapia genica utilizzando vettori adenovirali, è necessario somministrarli a determinati intervalli.

I vettori adenovirali sono stati utilizzati in test clinici sulla terapia genica per la fibrosi cistica.

Vettori basati su virus animali (retrovirus, poliomavirus) e loro utilizzo nella terapia genica.

Vettori retrovirali

L'esperienza derivante da studi clinici che hanno coinvolto più di 200 pazienti mostra che i vettori retrovirali con replicazione difettosa non causano effetti collaterali avversi. Tuttavia, si continua ad attribuire grande importanza alla sicurezza del loro utilizzo. È stato creato un costrutto chiamato plasmavirus che contiene geni retrovirali bavaglio E poh sotto il controllo di 5"-LTR-npoMOTopa, nonché di un gene “terapeutico” e di un gene ambiente, guidato dal promotore del citomegalovirus. Dopo la trasfezione, il plasmavirus innesca la formazione di particelle virali difettose nella replicazione e la probabilità di ricombinazione per formare retrovirus competenti per la replicazione è molto bassa. Il vettore non può trasportare più di 3,5 kb. DNA, ma anche la lunghezza della maggior parte dei cDNA potenzialmente “terapeutici” e dei geni oncosoppressori è di 0,5-2 kb.

Ulteriori miglioramenti sono stati apportati al sistema del vettore retrovirale: il numero delle particelle virali risultanti è stato aumentato, l'efficienza della trasduzione è stata aumentata, è stata effettuata una modificazione dell'ingegneria genetica per garantire la loro penetrazione nelle cellule che non si dividono e la specificità dei vettori retrovirali. il contagio è aumentato. In quest'ultimo caso, il genoma del vettore retrovirale ricombinante viene impacchettato nell'involucro di un altro virus, la cui proteina determina la specificità di legame del retrovirus e la gamma di cellule che infetta. Questo fenomeno è chiamato mescolamento fenotipico (formazione di pseudotipi). Un virus fenotipicamente misto viene prodotto mediante cotrasfezione di una linea cellulare che sintetizza i prodotti genici bavaglio E pol vettore retrovirale ricombinante e vettore di espressione genica ambiente un altro virus. Cambiando un gene ambiente,è possibile restringere lo spettro delle cellule infette dal virus a un tipo strettamente definito oppure espanderlo. Inoltre, nel gene ambiente retrovirus, è possibile inserire una sequenza nucleotidica codificante un peptide che si lega ad uno specifico recettore cellulare e garantisce l'introduzione del retrovirus ricombinante nelle cellule desiderate. Infine, la specificità dell'espressione genica terapeutica può essere ottenuta sotto il controllo di un promotore cellula-specifico.

Vettori adenovirali

Gli adenovirus infettano le cellule umane che non si dividono e sono ampiamente utilizzati come vaccini vivi che prevengono le infezioni respiratorie e la gastroenterite senza causare effetti collaterali. Queste proprietà rendono gli adenovirus promettenti per la consegna di geni alle cellule bersaglio.

Per ottenere un vettore adenovirale, una linea cellulare che sintetizza i prodotti del gene adenovirale E1 è stata cotrasfettata con due sezioni del genoma dell'adenovirus (Fig. 21.7). Uno di loro potrebbe esistere come gatasmide Escherichia coli e contiene, al posto della regione E1, un gene “terapeutico”, fiancheggiato da sequenze nucleotidiche dell'adenovirus, e il secondo è una molecola di DNA di adenovirus priva della regione terminale 5" comprendente la regione El, e presenta una regione sovrapposta con il plasmide che trasporta il gene terapeutico. La ricombinazione tra i due frammenti di DNA trasfettanti nell'area della loro sovrapposizione porta al ripristino del gene adenovirale a lunghezza intera, in cui si trova il gene terapeutico al posto della regione E1 i prodotti forniti dalla cellula ospite avviano la formazione di particelle virali rilasciate dalla cellula a seguito della lisi. In assenza di ricombinazione, le molecole di DNA trasfettante che sono di lunghezza insufficiente non possono essere impacchettate in particelle virali tra la regione E1 nel genoma della cellula ospite e il DNA di un adenovirus ricombinante per formare virus competenti per la replicazione è estremamente bassa.

Dopo che un adenovirus ricombinante ha infettato una cellula bersaglio, il suo DNA entra nel nucleo, dove viene espresso il gene “terapeutico”. Il DNA ricombinante non si integra nel cromosoma e persiste per un breve periodo, pertanto, quando si effettua la terapia genica utilizzando vettori adenovirali, è necessario introdurli a determinati intervalli.

I vettori adenovirali sono stati utilizzati negli studi clinici per la terapia genica per la fibrosi cistica.

Poiché negli eucarioti (animali) non sono stati trovati plasmidi nucleari, gli unici “donatori” per il trasferimento di vettori possono essere i virus. I virus animali sono dannosi da usare perché:

1. Non ci sono regioni non essenziali nel loro genoma che potrebbero essere sostituite con DNA clonato. => i vettori costruiti sulla base di tali virus sono difettosi.

2. La capacità dei vettori virali è limitata, perché solo una certa quantità di DNA può essere impacchettata nel capside (e i geni eucariotici sono molto grandi, 30 o più coppie di nucleotidi).

Virus SV-40.

Si sviluppano in cellule di scimmia. Poiché ha un effetto oncotrasformante e può alterare la struttura dei geni, viene utilizzato raramente per integrare i geni clonati nei cromosomi cellulari. Utilizzando tali vettori, è possibile osservare l'espressione.

Virus vaccinico.

Ha un DNA a doppio filamento, che ha una struttura unica. È una molecola lineare con forcine ad entrambe le estremità che collegano covalentemente entrambi i filamenti di DNA. Attraente come vettore perché:

1. vasta gamma cellule ospiti. Dagli invertebrati ai vertebrati.

2. Permette l'introduzione di grandi frammenti di DNA estraneo (fino a 25 kb), il virus stesso ha un genoma di 187 kb.

3. Sicuro da usare.

Sono utilizzati per creare virus ricombinanti, nel cui genoma sono incorporati geni che codificano antigeni proteici di vari virus patogeni (microbi), creando così l'immunità alle malattie infettive.

Retrovirus.

Hanno RNA a filamento singolo. Loro ciclo vitale passa necessariamente attraverso la formazione del DNA a doppio filamento. Vantaggi:

1. Una gamma di host eccezionalmente ampia.

2. La struttura del DNA integrato esclude la possibilità di riarrangiamento del gene in esso clonato.

3. Le cellule non muoiono, ma producono virus per molte generazioni.

Utilizzato anche:

Adenovirus;

Baculovirus (infettano gli insetti).

Vettori basati sul batteriofago λ

I vettori basati sul fago λ sono apparsi nel 1974. Il DNA del fago λ è a doppio filamento, lineare, di dimensioni 48.502 bp. Le estremità hanno estremità GC a filamento singolo lunghe 12 nt

I vettori fagici vengono solitamente creati sulla base del batteriofago temperato λ, contenente una molecola di DNA lineare a doppio filamento. I bracci sinistro e destro del fago contengono tutti i geni necessari per il ciclo litico (replicazione, riproduzione). La parte centrale del genoma del batteriofago λ (contiene geni che controllano la lisogenia, cioè la sua integrazione nel DNA di una cellula batterica) non è essenziale per la sua riproduzione ed è di circa 25mila paia di basi. Questa parte può essere sostituita con un frammento di DNA estraneo. Tali fagi modificati subiscono un ciclo litico, ma la lisogenia non avviene. I vettori basati sul batteriofago λ vengono utilizzati per clonare frammenti di DNA

Il fago M13 è un colifago filamentoso con un genoma ssDNA circolare. Per ottenere il DNA ricombinante viene utilizzata una forma replicativa del fago, ovvero un DNA circolare a doppio filamento di 6400 bp di dimensione, nel quale è inserito il gene lacZ, contenente siti polilinker per alcuni enzimi di restrizione. I fagi ricombinanti vengono selezionati dalle zone di lisi batterica del prato che hanno Colore bianco. L'uso di vettori basati sul fago M13 presenta numerosi aspetti positivi. Pertanto, una clonazione produce due tipi di fagi con un genoma di DNA a filamento singolo. Ogni tipo di fago contiene solo uno dei filamenti di inserzione del DNA, che può avere orientamenti diversi. A questo proposito, la clonazione utilizzando il fago M13 è conveniente per generare sonde di DNA a filamento singolo e sequenziamento del DNA.

7. Vettori basati su virus animali

I vettori di espressione extracromosomica dei mammiferi vengono utilizzati per studiare la funzione e la regolazione dei geni dei mammiferi. Inoltre, possono essere utilizzati per produrre autentiche proteine ​​ricombinanti, che possono potenzialmente essere utilizzate per scopi medici per curare alcune malattie umane. Esistono molti vettori di espressione dei mammiferi già costruiti, ma tutti hanno proprietà simili e sono simili ad altri vettori di espressione eucariotici. I promotori di geni marcatori clonati e selezionabili, così come i loro segnali di terminazione della trascrizione (segnali di poliadenilazione; devono essere derivati ​​da cellule eucariotiche; di solito utilizzano sequenze regolatrici di DNA di virus animali (ad esempio, citomegolovirus umano, SV40 o HSV) o geni di mammiferi (per ad esempio, gene (3-actina, metallotioneina, timidina chinasi o ormone della crescita bovino). Sono preferiti promotori forti e segnali di poliadenilazione efficienti. Le sequenze richieste per la selezione e l'amplificazione di un vettore di espressione di mammifero in E. coli sono derivate da un gene standard di E. coli (ad esempio, plasmide pBR322).

Geni marcatori selettivi. Per selezionare cellule di mammifero trasfettate, viene spesso utilizzato il gene batterico Neor che codifica la neomicina fosfotransferasi. Questo sistema utilizza il composto tossico genetico (G-418) per bloccare la traduzione nelle cellule di mammifero non trasfettate. Nelle cellule trasfettate, il G-418 viene fosforilato dalla neomicina fosfotransferasi e inattivato. Di conseguenza, solo le cellule che sintetizzano il prodotto del gene Neor sopravvivono e proliferano.

Un altro sistema per selezionare cellule di mammifero trasfettate si basa sull'utilizzo del gene che codifica per l'enzima diidrofolato reduttasi (DHFR). Questo sistema utilizza cellule con un gene DHFR difettoso, cioè cellule in cui la DHFR funzionale non viene sintetizzata. Dopo la trasfezione delle cellule DHFR con un vettore di espressione di mammifero con un gene DHFR funzionante, al terreno viene aggiunto metotrexato. Le cellule non trasfettate non crescono in sua presenza e le cellule che sintetizzano la diidrofolato reduttasi sopravvivono. Dopo la selezione preliminare delle cellule con il gene DHFR, la concentrazione di metotrexato nel mezzo viene aumentata e le cellule con un gran numero di copie del vettore che sintetizzano in grandi quantità proteina ricombinante.

I geni per una varietà di proteine ​​sono già stati inseriti nei vettori di espressione dei mammiferi e sono espressi nelle cellule ospiti. A volte la resa del prodotto aumentava se veniva inserito un introne tra il promotore e il gene clonato. Il meccanismo di questo fenomeno è sconosciuto. È possibile che la trascrizione primaria del gene clonato contenga siti di splicing nascosti, in cui parte della regione codificante del gene clonato viene asportata e, in presenza di un introne aggiuntivo, lo splicing in essi è meno probabile. Un elevato livello di espressione del gene clonato è stato raggiunto quando è stato coordinato con l'espressione di un gene marcatore selettivo. Per fare questo, ad esempio, il gene DHFR è stato inserito vicino al gene clonato, in modo che entrambi i geni fossero sotto il controllo dello stesso promotore e avessero un segnale di poliadenilazione comune, e il gene DHFR era fiancheggiato da siti di giunzione intronale. La DHFR e la proteina ricombinante sono state tradotte rispettivamente dal trascritto primario e dall'mRNA di splicing.

Espressione di due geni clonati in una cellula di mammifero

Alcune proteine ​​di valore commerciale sono composte da diverse catene polipeptidiche nella loro forma attiva. Ad esempio, l'ormone stimolante la tiroide umano è un eterodimero e l'emoglobina è un tetramero costituito da due subunità, due copie ciascuna (a2(32). Per ottenere una proteina multimerica attiva, si può provare a clonare il gene o il cDNA di ciascuna di le subunità, sintetizzano e purificano le subunità, quindi le mescolano in vitro. Tuttavia, solo poche proteine ​​multimeriche possono essere ottenute in questo modo, poiché in vitro si ottiene raramente il corretto ripiegamento delle catene polipeptidiche, ma in vivo l'assemblaggio di dimeri. e le proteine ​​tetrameriche si verificano in modo molto efficiente. Pertanto, sono state sviluppate strategie per la sintesi di due diverse proteine ​​ricombinanti in una gabbia.

Per fare ciò, le cellule ospiti sono state trasfettate simultaneamente con due vettori di espressione di mammifero, ciascuno contenente il gene o il cDNA di una delle subunità e diversi geni marcatori selezionabili. Le cellule trasfettate sono state sottoposte a doppia selezione e le cellule sopravvissute portavano entrambi i vettori. I sistemi a doppio vettore sono stati utilizzati con successo per sintetizzare autentiche proteine ​​ricombinanti dimeriche e tetrameriche. Sfortunatamente, le cellule doppiamente trasfettate spesso perdono uno dei due vettori. Inoltre, il numero di copie di ciascun vettore non è sempre lo stesso, quindi una subunità può essere sintetizzata in quantità maggiore di un'altra e la resa del prodotto finale può essere ridotta. Per superare questi problemi, sono stati costruiti vettori contenenti entrambi i geni clonati. In alcuni casi sono stati posti sotto il controllo di promotori indipendenti e segnali di poliadenilazione. E per garantire la sintesi di proteine ​​ricombinanti nella stessa quantità, sono stati creati i cosiddetti vettori due cistronici, in cui i geni clonati erano separati da un segmento di DNA contenente un sito di legame ribosomiale interno. Tali siti sono stati trovati nei genomi dei virus dei mammiferi; assicurano la traduzione simultanea di varie proteine ​​dall'mRNA policistronico. La trascrizione del costrutto gene-sito di legame del ribosoma interno-gene è regolata da un promotore e da un segnale di poliadenilazione. Viene sintetizzata una trascrizione con due geni, la traduzione inizia dall'estremità 5" dell'mRNA e dal sito interno.

In sintesi, i vettori di espressione dei mammiferi sono versatili ed efficienti quanto i vettori di altri sistemi di espressione eucariotici quando si tratta di produrre autentiche proteine ​​ricombinanti per scopi medici e di ricerca. Tuttavia, la sintesi industriale di proteine ​​ricombinanti utilizzando cellule di mammifero modificate è troppo costosa.