Schemat sekwencji terapii genowej. Drugie przyjście terapii genowej

Terapia genowa

Baranow V.S. Terapia genowa – medycyna XXI wieku // Czasopismo edukacyjne Sorosa. – 1999. – nr 3. – s. 63–68. (Uniwersytet Państwowy w Petersburgu)

© Baranov V.S., tekst

© Soros Educational Journal, 1999

© A. Afonin, opracowanie i publikacja wersji html, 2006

<http:// afonina-59- życiorys. ludzie. ru>

<http:// afonina-59- saliks. ludzie. ru>

WSTĘP

Decydujące osiągnięcia biologii molekularnej i genetyki w badaniu delikatnej struktury genów eukariotycznych, ich mapowaniu na chromosomach ssaków, a zwłaszcza ludzi, imponujące sukcesy Human Genome Project w identyfikacji i klonowaniu genów, których mutacje prowadzą do liczne choroby dziedziczne i wreszcie Szybki wzrost w dziedzinie biotechnologii i Inżynieria genetyczna były niezbędnym warunkiem do podjęcia pierwszych prób leczenia chorób monogenowych na podstawie doświadczeń na zwierzętach i konstrukcji teoretycznych już w 1989 roku.

Czym jest terapia genowa? Czy oznacza to leczenie przy użyciu genu jako leku, czy jedynie leczenie poprzez korekcję zmutowanego genu? Te i wiele innych pytań nieuchronnie pojawiają się, gdy rozważa się tak obiecujący, a być może potencjalnie niebezpieczny dla ludzkości kierunek medycyny nadchodzącego XXI wieku, jakim jest terapia genowa.

KRÓTKIE TŁO HISTORYCZNE

Terapia genowa dla nowoczesna scena można zdefiniować jako leczenie chorób dziedzicznych, wieloczynnikowych i niedziedzicznych (zakaźnych) poprzez wprowadzanie genów do komórek pacjentów w celu specyficznej zmiany defektów genów lub nadania komórkom nowych funkcji. Pierwszy Badania kliniczne Techniki terapii genowej zapoczątkowano 22 maja 1989 roku w celu genetycznego oznaczenia limfocytów naciekających nowotwór w przypadkach zaawansowanego czerniaka. Pierwszą monogenową chorobą dziedziczną, w leczeniu której zastosowano metody terapii genowej, był wrodzony niedobór odporności spowodowany mutacją w genie deaminazy adenozynowej (ADA). 14 września 1990 roku w Bethesda (USA) czteroletniej dziewczynce cierpiącej na tę dość rzadką chorobę (1:100 000) przeszczepiono własne limfocyty, wcześniej przekształcone poza organizmem (były życie) genom ADA (gen ADA + gen ludzie + wektor retrowirusowy). Efekt terapeutyczny utrzymywał się przez kilka miesięcy, po czym zabieg powtarzano w odstępach 3...5 miesięcy. W ciągu trzech lat terapii wykonano łącznie 23 transfuzje dożylne. ADA- transformowanych limfocytów T bez widocznych działań niepożądanych. W wyniku leczenia stan pacjentki poprawił się na tyle, że mogła prowadzić normalne życie i nie bać się przypadkowych infekcji. Równie skuteczne było leczenie drugiego pacjenta z tą chorobą. Obecnie badania kliniczne terapii genowej tej choroby prowadzone są we Włoszech, Francji, Wielkiej Brytanii i Japonii.

W 1997 roku liczba protokołów dopuszczonych do badań klinicznych wynosiła już 175, w ich realizacji wzięło udział ponad 2000 pacjentów. Najwięcej takich projektów (ok. 80%) dotyczy leczenia nowotworów, a także zakażenia wirusem HIV (AIDS). Jednocześnie we współczesnych badaniach nad terapią genową należy wziąć pod uwagę, że konsekwencje manipulacji genami lub rekombinowanym DNA W życie niedostatecznie zbadany.

W krajach o najbardziej zaawansowanym poziomie badań w tym zakresie, zwłaszcza w Stanach Zjednoczonych, protokoły medyczne wykorzystujące sensowne sekwencje DNA podlegają obowiązkowej weryfikacji przez odpowiednie komitety i komisje. W USA są to Komitet Doradczy ds. Rekombinacji DNA (RAC) oraz Agencja ds. Żywności i Leków (FDA), z późniejszym obowiązkowym zatwierdzeniem projektu przez dyrektora Narodowego Instytutu Zdrowia. W Europie takie protokoły są opracowywane i zatwierdzane zgodnie z zaleceniami Europejskiej Grupy Roboczej ds. Transferu i Terapii Genu Człowieka.

METODY TRANSFEKCJI GENETYCZNEJ W TERAPII GENOWEJ

Decydującym warunkiem powodzenia terapii genowej jest zapewnienie skutecznego dostarczenia, czyli transfekcji (w szerokim znaczeniu) lub transdukcji (przy wykorzystaniu wektorów wirusowych) obcego genu do komórek docelowych, zapewniając jego długotrwałe funkcjonowanie w tych komórkach i tworząc warunki pełnego funkcjonowania genu (jego ekspresji). Transfekcję można przeprowadzić przy użyciu czystego (nagiego) DNA domieszkowanego (zintegrowanego) z odpowiednim plazmidem lub DNA skompleksowanego (plazmidowy DNA połączony z solami, białkami (transferyną), polimerami organicznymi (DEAE-dekstran, polilizyna, liposomy lub cząsteczki złota), lub DNA zawarty w cząsteczkach wirusa pozbawionych wcześniej zdolności do replikacji.

Główne metody dostarczania obcych genów do komórek dzielą się na chemiczne, fizyczne i biologiczne. Wydajność transfekcji i zdolność integracji transdukowanego obcego DNA podczas na różne sposoby transfekcja do docelowych komórek DNA nie jest taka sama. Tylko wektory wirusowe lub konstrukty genetyczne zawierające sekwencje wirusowe są zdolne do aktywnej transdukcji, a w niektórych przypadkach długotrwałej ekspresji obcych genów. Spośród ponad 175 zatwierdzonych już protokołów badań klinicznych terapii genowej ponad 120 obejmuje zastosowanie transdukcji wirusowej, a około 100 z nich opiera się na wykorzystaniu wektorów retrowirusowych.

Przegląd danych pozwala nam dojść do wniosku, że pomimo wysiłków wielu laboratoriów na całym świecie, wszystko już znane i przetestowane W życie I W in vitro systemy wektorowe są dalekie od doskonałości. Jeżeli jest problem z dostarczeniem obcego DNA W in vitro praktycznie rozwiązany i jego dostarczanie do komórek docelowych różnych tkanek W życie pomyślnie rozwiązane (głównie poprzez stworzenie konstruktów przenoszących białka receptorowe, zawierające antygeny specyficzne dla określonych tkanek), wówczas inne cechy istniejących układów wektorowych – stabilność integracji, regulowana ekspresja, bezpieczeństwo – nadal wymagają poważnych udoskonaleń.

Przede wszystkim dotyczy to stabilności integracji. Do tej pory integrację z genomem osiągano jedynie przy użyciu wektorów retrowirusowych lub związanych z adenowirusami. Skuteczność stabilnej integracji można zwiększyć poprzez ulepszenie konstruktów genowych, takich jak systemy, w których pośredniczy receptor, lub poprzez utworzenie wystarczająco stabilnych wektorów episomalnych (tj. struktur DNA zdolnych do długotrwałego utrzymywania się w jądrach).

Transfer genów za pośrednictwem receptora przebiega następująco. Sekwencja DNA pożądanego genu jest połączona z pewną substancją (na przykład glikoproteiną), która ma wysokie powinowactwo do określonego receptora błonowego transformowanej komórki (na przykład hepatocytu). Powstały kompleks łączy się z adenowirusem, co zapewnia penetrację konstruktu genowego do jądra komórkowego. Taki połączony wektor zapewnia skuteczne ukierunkowane dostarczanie genu do określonych komórek.

Ostatnio szczególną uwagę poświęcono tworzeniu wektorów opartych na sztucznych chromosomach ssaków (sztuczne chromosomy ssaków). Dzięki obecności podstawowych elementów strukturalnych zwykłych chromosomów, takie minichromosomy utrzymują się w komórkach przez długi czas i są w stanie przenosić pełnowymiarowe (genomowe) geny i ich naturalne elementy regulatorowe, niezbędne do prawidłowego funkcjonowania genu, we właściwej tkance i we właściwym czasie.

ZASADY TERAPII GENOWEJ

W zależności od metody wprowadzenia egzogennego DNA do genomu pacjenta, terapię genową można prowadzić albo w hodowli komórkowej (ex vivo) lub bezpośrednio w organizmie (W życie). Komórkowa terapia genowa lub terapia ex vivo polega na izolowaniu i hodowaniu typów komórek specyficznych dla pacjenta W in vitro, wprowadzając do nich obce geny (na przykład te, które wzmacniają odpowiedź immunologiczną organizmu), wybierając klony transfekowanych komórek i ponownie wprowadzając je do organizmu tego samego pacjenta. Obecnie większość programów terapii genowej zatwierdzonych do badań klinicznych wykorzystuje to podejście.

Terapia genowa W życie polega na bezpośrednim wprowadzeniu sklonowanych i spakowanych sekwencji DNA do konkretnych tkanek pacjenta. Szczególnie obiecujący w leczeniu chorób genetycznych invivo wprowadzenie genów za pomocą szczepionek w aerozolu lub wstrzykniętych wydaje się możliwe. Terapia genowa w aerozolu jest z reguły opracowywana w celu leczenia chorób płuc (mukowiscydoza, rak płuc).

Opracowanie programu terapii genowej poprzedza dokładna analiza tkankowo-specyficznej ekspresji odpowiedniego genu, identyfikacja pierwotnego defektu biochemicznego, badanie jego struktury, funkcji i dystrybucji wewnątrzkomórkowej produkt białkowy, I analiza biochemiczna proces patologiczny. Wszystkie te dane są brane pod uwagę przy sporządzaniu odpowiedniego protokołu lekarskiego. Testowanie procedury korekcji genu choroby dziedzicznej przeprowadza się na pierwotnych hodowlach komórkowych pacjenta, w których gen ten jest zwykle funkcjonalnie aktywny. Za pomocą tych modeli komórkowych ocenia się efektywność wybranego egzogennego układu transferu DNA, określa się ekspresję wprowadzonego konstruktu genetycznego, analizuje jego oddziaływanie z genomem komórki i opracowuje metody korekcji na poziomie biochemicznym.

Wykorzystując hodowle komórkowe możliwe jest opracowanie systemu ukierunkowanego dostarczania rekombinowanego DNA, jednakże badanie wiarygodności działania tego systemu można przeprowadzić jedynie na poziomie całego organizmu. Dlatego tak dużą uwagę przywiązuje się do eksperymentów w programach terapii genowej. W życie na naturalnych lub sztucznie uzyskanych modelach odpowiednich chorób dziedzicznych u zwierząt. Najważniejszym warunkiem dopuszczenia do badań klinicznych jest pomyślna korekta defektów genetycznych u tych zwierząt oraz brak niepożądanych skutków ubocznych terapii genowej.

Zatem standardowy schemat korekcji genu wady dziedzicznej obejmuje szereg kolejnych etapów. Rozpoczyna się od stworzenia w pełni funkcjonującego (eksprymowanego) konstruktu genetycznego zawierającego semantyczną (kodującą białko) i regulacyjną część genu. W kolejnym etapie rozwiązywany jest problem wektora, zapewniający sprawne i w miarę możliwości ukierunkowane dostarczenie genu do komórek docelowych. Następnie przeprowadza się transfekcję (przeniesienie powstałego konstruktu) do komórek docelowych, ocenia się skuteczność transfekcji oraz stopień możliwości skorygowania pierwotnego defektu biochemicznego w warunkach hodowli komórkowej (W in vitro) i co najważniejsze, W życie na zwierzęcych modelach biologicznych. Dopiero po tym będzie można rozpocząć program badań klinicznych.

GENOTERAPIA MONOGENNYCH CHORÓB DZIEDZICZNYCH

Sukces pierwszych badań klinicznych był potężną zachętą do przyspieszenia rozwoju nowych metod terapii genowej innych chorób dziedzicznych. Poniżej znajduje się lista chorób, w przypadku których zasadniczo możliwa jest terapia genowa i w przypadku których korekcja genów prawdopodobnie zostanie przeprowadzona w dającej się przewidzieć przyszłości, a także chorób, dla których istnieją już oficjalnie zatwierdzone protokoły i które znajdują się na różnych etapach badań klinicznych.

Tabela 1– Choroby dziedziczne, których korekta genu znajduje się na etapie badań klinicznych (CT), rozwoju eksperymentalnego (ED) i jest zasadniczo możliwa (PV)

GENOTERAPIA CHORÓB NIEDZIEDZICZNYCH

Równolegle z rozwojem badań w zakresie genowej korekcji wad dziedzicznych, sukcesem okazały się także poszukiwania metod terapeutycznego wykorzystania sensownych sekwencji DNA w leczeniu wad. choroby dziedziczne i głównie nowotwory złośliwe oraz infekcje wirusowe. Znamienne jest, że to właśnie w tych sekcjach patologii poszukiwania sposobów korekcji genów prowadzone są szczególnie intensywnie, a liczba zatwierdzonych już protokołów badań klinicznych jest wielokrotnie większa niż liczba protokołów leczenia chorób monogenowych.

Poniżej wymieniono główne podejścia metodologiczne do terapii genowej różnych nowotworów, które zostały opracowane i są już szeroko stosowane. Wiele z tych podejść ma również zastosowanie w zwalczaniu najpoważniejszych chorób zakaźnych, takich jak zakażenie wirusem HIV (AIDS).

Wyniki pierwszych badań klinicznych tych podejść były najwyższy stopień obiecujące, szczególnie w leczeniu chorób neurodegeneracyjnych i onkologicznych układu nerwowego.

Tabela 2 - Podstawowe podejścia do korekcji genów chorób nowotworowych

NIEKTÓRE KWESTIE ETYCZNE I SPOŁECZNE

TERAPIA GENOWA

Pojawienie się zasadniczo nowych technologii, które umożliwiają aktywną manipulację genami i ich fragmentami oraz zapewniają ukierunkowane dostarczanie nowych bloków informacji genetycznej do określonych regionów genomu, stało się ważnym wydarzeniem w biologii i medycynie.

Już teraz, przy obecnym poziomie wiedzy o ludzkim genomie, teoretycznie całkiem możliwe są takie modyfikacje, mające na celu poprawę niektórych parametrów fizycznych (np. wzrostu), psychicznych i intelektualnych. Tym samym współczesna nauka o człowieku w swojej nowej rundzie rozwoju powróciła do idei udoskonalenia rodzaju ludzkiego, postulowanej niegdyś przez wybitnego angielskiego genetyka F. Galtona, a rozwiniętej przez jego uczniów i naśladowców w Wielkiej Brytanii (K. Pearson , L. Penrose, J. Haldane), w Rosji (N.K. Koltsov, F.P. Filipchenko), w USA (G. Möller). Jak wiemy, dalszy bieg historii całkowicie zdyskredytował samą ideę udoskonalenia rodzaju ludzkiego. Jednak przyszła wszechmoc człowieka nad własnym genomem zmusza nas do ciągłego powracania do tego tematu, czyniąc go przedmiotem nieustannych ożywionych dyskusji w prasie powszechnej i naukowej. Nie ma wątpliwości, że początkowe obawy związane z inżynierią genetyczną człowieka były nieuzasadnione. Stosowanie terapii genowej w leczeniu wielu chorób uznano już za wskazane. Jedynym i niezbędnym ograniczeniem, które pozostaje aktualne we współczesnych warunkach, jest to, że wszelkie działania terapii genowej powinny być skierowane tylko do konkretnego pacjenta i dotyczyć go wyłącznie komórki somatyczne.

Obecny stan wiedzy nie pozwala na korekcję defektów genetycznych na poziomie komórek rozrodczych i komórek wczesnych przedimplantacyjnych zarodków ludzkich ze względu na prawdziwe niebezpieczeństwo zanieczyszczenie puli genowej niechcianymi, sztucznymi konstruktami genowymi lub wprowadzenie mutacji o nieprzewidywalnych konsekwencjach dla przyszłości ludzkości. Jednocześnie w literaturze naukowej coraz częściej i uporczywie pojawiają się wezwania do wznowienia dyskusji na temat celowości korekcji genów ludzkich komórek płciowych i zarodkowych.

Oto niektóre z pytań, którymi należy się zająć w ramach szerszej debaty na temat terapii genowej proponowanej przez genetyków.

1. Czy w przyszłości terapia genowa będzie w stanie zapewnić taką całkowitą korektę genu, że nie będzie stanowić zagrożenia dla potomstwa?

2. W jakim stopniu korzyść i konieczność przeprowadzenia terapii genowej dla jednej pary przewyższają ryzyko takiej interwencji dla całej ludzkości?

3. Na ile uzasadnione będą te procedury w kontekście nadchodzącego przeludnienia planety?

4. Jak działania inżynierii genetycznej na człowieku będą się odnosić do problemów homeostazy społeczeństwa i biosfery?

Tym samym rewolucja genetyczna, której apoteozą była terapia genowa, nie tylko oferuje realne sposoby leczenia ciężkich chorób dziedzicznych i niedziedzicznych, ale także w swoim szybkim rozwoju stawia przed społeczeństwem nowe problemy, których rozwiązanie jest pilnie konieczne w bliska przyszłość.

Wstęp

Co roku w czasopism naukowych Artykułów o tematyce medycznej jest coraz więcej studia kliniczne, w którym w ten czy inny sposób stosowano leczenie polegające na wprowadzaniu różnych genów - terapię genową. Kierunek ten wyrósł z tak dobrze rozwijających się dziedzin biologii, jak genetyka molekularna i biotechnologia.

Często, gdy wypróbowano już konwencjonalne (konserwatywne) metody, to właśnie terapia genowa może pomóc pacjentom przeżyć, a nawet w pełni wyzdrowieć. Dotyczy to na przykład dziedzicznych chorób monogenowych, czyli takich, które są spowodowane defektem pojedynczego genu, a także wielu innych. Lub na przykład terapia genowa może pomóc i uratować kończynę u pacjentów, którzy zwężyli światło naczyń krwionośnych w dolne kończyny w wyniku czego rozwija się trwałe niedokrwienie otaczających tkanek, to znaczy tkanki te doświadczają poważnego niedoboru składniki odżywcze i tlen, które normalnie są przenoszone przez krew po całym organizmie. Manipulacje chirurgiczne i często nie da się takich pacjentów leczyć lekami, ale jeśli komórki zostaną lokalnie zmuszone do uwolnienia większej ilości czynników białkowych, które wpływają na proces tworzenia i kiełkowania nowych naczyń, wówczas niedokrwienie stanie się znacznie mniej wyraźne, a życie stanie się znacznie łatwiejsze dla pacjentów.

Terapia genowa obecnie można zdefiniować jako leczenie chorób poprzez wprowadzanie genów do komórek pacjentów w celu specyficznej zmiany defektów genów lub nadania komórkom nowych funkcji. Pierwsze badania kliniczne metod terapii genowej podjęto całkiem niedawno – 22 maja 1989 roku, w celu diagnostyki nowotworów. Pierwszą chorobą dziedziczną, w leczeniu której zastosowano terapię genową, był wrodzony niedobór odporności.

Co roku liczba udanych badań klinicznych leczenia różne choroby osób korzystających z terapii genowej rośnie i w styczniu 2014 r. osiągnęło 2 tys.

Jednocześnie we współczesnych badaniach nad terapią genową należy wziąć pod uwagę, że konsekwencje manipulacji genami lub „przetasowania” (rekombinowanego) DNA na żywo(łac. dosłownie „w żywych”) nie zostały wystarczająco zbadane. W krajach o najbardziej zaawansowanym poziomie badań w tym zakresie, szczególnie w Stanach Zjednoczonych, protokoły medyczne wykorzystujące sensowne sekwencje DNA podlegają obowiązkowej weryfikacji przez odpowiednie komitety i komisje. W USA są to Komitet Doradczy ds. Rekombinacji DNA (RAC) i Agencja ds. Leków. produkty żywieniowe(Agencja ds. Żywności i Leków, FDA), po czym następuje obowiązkowe zatwierdzenie projektu przez dyrektora Narodowego Instytutu Zdrowia.

Tak zdecydowaliśmy to leczenie opiera się na tym, że jeśli w niektórych tkankach organizmu brakuje pewnych indywidualnych czynników białkowych, to można to skorygować wprowadzając do tych tkanek odpowiednie geny kodujące białka i wszystko stanie się mniej więcej cudowne. Nie będzie możliwości wprowadzenia samych białek, gdyż nasz organizm od razu zareaguje silną reakcją immunologiczną, a czas działania będzie niewystarczający. Teraz musisz zdecydować o sposobie dostarczenia genu do komórek.

Transfekcja komórki

Na początek warto wprowadzić definicje niektórych terminów.

Transport genów odbywa się dzięki wektor to cząsteczka DNA używana jako „ pojazd„w celu sztucznego przeniesienia informacji genetycznej do komórki. Istnieje wiele rodzajów wektorów: plazmidowe, wirusowe, a także kosmidy, straszmidy, sztuczne chromosomy itp. Zasadnicze znaczenie ma to, aby wektory (w szczególności plazmidowe) posiadały charakterystyczne dla siebie właściwości:

1. Pochodzenie replikacji (ori)- sekwencja nukleotydów, od której rozpoczyna się duplikacja DNA. Jeśli wektor DNA nie będzie mógł się podwoić (replikować), to nie zostanie osiągnięty niezbędny efekt terapeutyczny, ponieważ zostanie po prostu szybko rozłożony przez wewnątrzkomórkowe enzymy nukleazy, a z powodu braku matryc ostatecznie powstanie znacznie mniej cząsteczek białka. Należy zaznaczyć, że punkty te są specyficzne dla każdego gatunku biologicznego, czyli jeśli DNA wektora ma zostać uzyskane w drodze namnażania go w hodowli bakteryjnej (a nie tylko poprzez syntezę chemiczną, która jest zwykle znacznie droższa), to dwa wymagane będą oddzielne źródła replikacji - dla ludzi i bakterii;

2. Miejsca z ograniczeniami- specyficzne krótkie sekwencje (zwykle palindromiczne), które są rozpoznawane przez specjalne enzymy (endonukleazy restrykcyjne) i cięte przez nie w określony sposób - z utworzeniem „lepkich końcówek” (ryc. 1).

Ryc.1 Tworzenie „lepkich końcówek” przy udziale enzymów restrykcyjnych

Miejsca te są niezbędne do połączenia DNA wektora (który w istocie jest „pusty”) z pożądanymi genami terapeutycznymi w pojedynczą cząsteczkę. Taka cząsteczka usieciowana z dwóch lub więcej części nazywana jest „rekombinowaną”;

3. Oczywiste jest, że chcielibyśmy uzyskać miliony kopii rekombinowanej cząsteczki DNA. Ponownie, jeśli mamy do czynienia z kulturą komórek bakteryjnych, to DNA należy wyizolować. Problem w tym, że nie wszystkie bakterie połkną potrzebną nam cząsteczkę; niektóre tego nie zrobią. Aby rozróżnić te dwie grupy, wstawiają markery selektywne- obszary odporności na pewne chemikalia; Jeśli teraz dodamy te same substancje do środowiska, to przetrwają tylko te, które są na nie odporne, a reszta umrze.

Wszystkie te trzy składniki można zaobserwować w pierwszym sztucznie zsyntetyzowanym plazmidzie (ryc. 2).

Ryc.2

Nazywa się proces wprowadzania wektora plazmidowego do określonych komórek transfekcja. Plazmid to dość krótka i zwykle okrągła cząsteczka DNA, która znajduje się w cytoplazmie komórki bakteryjnej. Plazmidy nie są związane z chromosomem bakteryjnym, mogą replikować się niezależnie od niego i mogą być uwalniane przez bakterię do środowisko lub odwrotnie, zostać wchłoniętym (proces wchłaniania polega na transformacja). Za pomocą plazmidów bakterie mogą wymieniać informacje genetyczne, na przykład przekazując oporność na niektóre antybiotyki.

Plazmidy występują naturalnie w bakteriach. Ale nikt nie może powstrzymać badacza przed sztuczną syntezą plazmidu, który będzie miał potrzebne mu właściwości, wprowadzeniem do niego wstawki genowej i wprowadzeniem go do komórki. Do tego samego plazmidu można wstawić różne wstawki .

Metody terapii genowej

Istnieją dwa główne podejścia, różniące się charakterem komórek docelowych:

1. Płód, w którym obcy DNA zostaje wprowadzony do zygoty (zapłodnionego jaja) lub zarodka wczesna faza rozwój; w tym przypadku oczekuje się, że wprowadzony materiał przedostanie się do wszystkich komórek biorcy (a nawet komórek rozrodczych, zapewniając w ten sposób transmisję na następne pokolenie). W naszym kraju jest to wręcz zabronione;

2. Somatyczny, w którym materiał genetyczny jest wprowadzany do komórek niereprodukcyjnych już narodzonej osoby i nie jest przekazywany do komórek rozrodczych.

Terapia genowa na żywo oparte na bezpośrednie wprowadzenie klonowane (namnażane) i pakowane w określony sposób sekwencje DNA do określonych tkanek pacjenta. Szczególnie obiecujące w leczeniu chorób genowych in vivo jest wprowadzanie genów za pomocą szczepionek w aerozolu lub wstrzykiwanych. Opracowywana jest terapia genowa w aerozolu, przeznaczona zazwyczaj do leczenia choroby płuc(mukowiscydoza, rak płuc).

Opracowanie programu terapii genowej składa się z wielu etapów. Obejmuje to dokładną analizę tkankowo-specyficznej ekspresji odpowiedniego genu (tj. syntezę na matrycy genu jakiegoś białka w określonej tkance) i identyfikację pierwotnego defektu biochemicznego oraz badanie struktury, funkcji i wewnątrzkomórkową dystrybucję produktu białkowego, a także analizę biochemiczną procesu patologicznego. Wszystkie te dane są brane pod uwagę przy sporządzaniu odpowiedniego protokołu lekarskiego.

Ważne jest, aby podczas opracowywania schematów korekcji genów ocenić skuteczność transfekcji i stopień korekcji pierwotnego defektu biochemicznego w warunkach hodowli komórkowej ( in vitro,„in vitro”) i, co najważniejsze, na żywo na zwierzęcych modelach biologicznych. Dopiero po tym będzie można rozpocząć program badań klinicznych .

Bezpośrednie dostarczanie i komórkowe nośniki genów terapeutycznych

Istnieje wiele metod wprowadzania obcego DNA do komórki eukariotycznej: niektóre zależą od obróbki fizycznej (elektroporacja, magnetofekcja itp.), inne zależą od zastosowania materiały chemiczne lub cząstki biologiczne (na przykład wirusy), które są używane jako wektory. Warto od razu wspomnieć o tej substancji chemicznej i metody fizyczne(np. elektroporacja + otoczenie DNA liposomami)

Metody bezpośrednie

1. Transfekcję chemiczną można podzielić na kilka typów: z wykorzystaniem substancji cyklodekstrynowej, polimerów, liposomów lub nanocząstek (z lub bez funkcjonalizacji chemicznej lub wirusowej, tj. modyfikacji powierzchni).
a) Jedną z najtańszych metod jest użycie fosforanu wapnia. Zwiększa skuteczność inkorporacji DNA do komórek 10-100 razy. DNA tworzy silny kompleks z wapniem, co zapewnia jego efektywne wchłanianie. Wada - tylko około 1 - 10% DNA dociera do jądra. Zastosowana metoda in vitro do przenoszenia DNA do komórek ludzkich (ryc. 3);

Ryc.3

b) Zastosowanie silnie rozgałęzionych cząsteczek organicznych – dendrymerów, do wiązania DNA i przeniesienia go do komórki (ryc. 4);

Ryc.4

c) Bardzo skuteczną metodą transfekcji DNA jest jego wprowadzenie poprzez liposomy – małe, otoczone błoną ciałka, które mogą łączyć się z błoną cytoplazmatyczną komórki (CPM), która jest podwójną warstwą lipidów. Dla komórki eukariotyczne transfekcja jest bardziej wydajna przy użyciu liposomów kationowych, ponieważ komórki są na nie bardziej wrażliwe. Proces ma swoją nazwę - lipofekcja. Metoda ta jest obecnie uważana za jedną z najbezpieczniejszych. Liposomy są nietoksyczne i nieimmunogenne. Skuteczność transferu genów za pomocą liposomów jest jednak ograniczona, ponieważ DNA wprowadzane przez nie do komórek jest zwykle natychmiastowo wychwytywane przez lizosomy i niszczone. Wprowadzenie DNA do komórek ludzkich za pomocą liposomów jest dziś podstawą terapii. na żywo(ryc. 5);

Ryc.5

d) Inną metodą jest zastosowanie polimerów kationowych, takich jak dietyloaminoetylodekstran lub polietylenoimina. Ujemnie naładowane cząsteczki DNA wiążą się z dodatnio naładowanymi polikationami, a kompleks ten dalej wnika do komórki na drodze endocytozy. DEAE-dekstran zmienia właściwości fizyczne błony komórkowej i stymuluje wchłanianie tego kompleksu do wnętrza komórki. Główną wadą tej metody jest to, że DEAE-dekstran jest toksyczny w wysokich stężeniach. Metoda ta nie stała się powszechna w terapii genowej;

e) Za pomocą histonów i innych białek jądrowych. Białka te, zawierające wiele dodatnio naładowanych aminokwasów (Lys, Arg), w warunkach naturalnych pomagają kompaktowo upakować długi łańcuch DNA w stosunkowo małym jądrze komórkowym.

2. Metody fizyczne:

a) Bardzo popularną metodą jest elektroporacja; Natychmiastowy wzrost przepuszczalności błony osiąga się poprzez poddanie komórek krótkiej ekspozycji na intensywne pole elektryczne. Wykazano, że w optymalnych warunkach liczba transformantów może osiągnąć 80% komórek, które przeżyły. Nie jest obecnie stosowany u ludzi (ryc. 6).

Ryc.6

b) „Wyciskanie komórek” to metoda wynaleziona w 2013 roku. Pozwala ona na dostarczenie cząsteczek do komórek poprzez „delikatne ściskanie” błony komórkowej. Metoda eliminuje możliwość wystąpienia toksyczności lub błędnego ukierunkowania, ponieważ nie opiera się na materiałach zewnętrznych ani polach elektrycznych;

c) Sonoporacja to metoda sztucznego przenoszenia obcego DNA do komórek poprzez wystawienie ich na działanie ultradźwięków, powodując otwarcie porów w błonie komórkowej;
d) Transfekcja optyczna – metoda polegająca na wykonaniu w membranie maleńkiego otworu (o średnicy około 1 μm) za pomocą silnie skupionego lasera;
e) Transfekcja hydrodynamiczna – metoda dostarczania konstruktów genetycznych, białek itp. poprzez kontrolowany wzrost ciśnienia w naczyniach włosowatych i płynie międzykomórkowym, co powoduje krótkotrwały wzrost przepuszczalności błon komórkowych i powstawanie w nich przejściowych porów. Przeprowadza się ją poprzez szybkie wstrzyknięcie do tkanki, a podanie jest nieswoiste. Wydajność dostarczania do mięśni szkieletowych - od 22 do 60% ;

f) Mikroiniekcja DNA - wprowadzenie do jądra komórki zwierzęcej przy użyciu cienkich szklanych mikrotubul (d=0,1-0,5 µm). Wadą jest złożoność metody, istnieje duże prawdopodobieństwo zniszczenia jądra lub DNA; transformowana może być ograniczona liczba komórek. Nie do użytku przez ludzi.

3. Metody cząstkowe.

a) Bezpośrednim podejściem do transfekcji jest pistolet genowy, w którym DNA łączy się w nanocząstkę z obojętnymi ciałami stałymi (najczęściej złotem, wolframem), która następnie jest „wstrzeliwana” w kierunku jąder komórek docelowych. Ta metoda jest stosowana in vitro I na żywo do wprowadzania genów, w szczególności do komórek tkanki mięśniowej, na przykład w chorobie takiej jak dystrofia mięśniowa Duchenne'a. Wielkość cząstek złota wynosi 1-3 mikrony (ryc. 7).

Ryc.7

b) Magnetofekcja to metoda wykorzystująca siły magnetyzmu w celu dostarczenia DNA do komórek docelowych. Najpierw kwasy nukleinowe (NA) kojarzone są z nanocząsteczkami magnetycznymi, a następnie pod ich wpływem pole magnetyczne, cząsteczki są wprowadzane do komórki. Skuteczność wynosi prawie 100%, odnotowano oczywistą nietoksyczność. W ciągu 10-15 minut cząstki zostają zarejestrowane w komórce – jest to znacznie szybciej niż innymi metodami.
c) Impalefekcja; „przebicie”, dosł. „przebicie” + „infekcja”) – metoda dostarczania wykorzystująca nanomateriały, takie jak nanorurki i nanowłókna węglowe. W tym przypadku komórki są dosłownie przebijane warstwą nanowłókien. Przedrostkiem „nano” określa się ich bardzo małe rozmiary (w zakresie miliardowych części metra) (ryc. 8).

Ryc.8

Osobno warto wyróżnić taką metodę, jak transfekcja RNA: do komórki dostarczany jest nie DNA, ale cząsteczki RNA - ich „następcy” w łańcuchu biosyntezy białek; w tym przypadku aktywowane są specjalne białka, które tną RNA na krótkie fragmenty – tzw. mały interferujący RNA (siRNA). Fragmenty te wiążą się z innymi białkami, co ostatecznie prowadzi do zahamowania ekspresji odpowiednich genów w komórce. W ten sposób możliwe jest zablokowanie działania tych genów w komórce, które potencjalnie na nie wpływają ten moment wyrządzić więcej szkody niż pożytku. Szerokie zastosowanie Transfekcję RNA stwierdzono zwłaszcza w onkologii.

Omówiono podstawowe zasady dostarczania genów za pomocą wektorów plazmidowych. Teraz możemy przejść do rozważań nad metodami wirusowymi. Wirusy to niekomórkowe formy życia, składające się najczęściej z cząsteczki kwasu nukleinowego (DNA lub RNA) owiniętej w powłoka proteinowa. Jeśli wytniemy z materiału genetycznego wirusa wszystkie sekwencje wywołujące choroby, wówczas cały wirus również będzie można z powodzeniem zamienić w „nośnik” dla naszego genu.

Nazywa się proces wprowadzania DNA do komórki za pośrednictwem wirusa transdukcja.
W praktyce najczęściej stosowane są retrowirusy, adenowirusy i wirusy powiązane z adenowirusami (AAV). Na początek warto dowiedzieć się, jaki powinien być idealny kandydat do transdukcji pomiędzy wirusami. Kryteria są takie, że musi to być:

Stabilny;
. pojemny, to znaczy mieszczący Wystarczającą ilość DNA;
. obojętny wobec szlaki metaboliczne komórki;
. precyzyjny – w idealnym przypadku powinien integrować swój genom z określonym locus genomu jądra gospodarza itp.

W prawdziwe życie bardzo trudno jest połączyć przynajmniej kilka punktów, dlatego zazwyczaj wyboru dokonuje się rozpatrując każdy indywidualny przypadek z osobna (ryc. 9).

Ryc.9

Spośród wszystkich trzech wymienionych najczęściej używanych wirusów, najbezpieczniejsze i jednocześnie najdokładniejsze są AAV. Niemal jedyną ich wadą jest stosunkowo mała pojemność (około 4800 pz), która jednak okazuje się wystarczająca dla wielu genów .

Oprócz wymienionych metod terapię genową często stosuje się w połączeniu z terapią komórkową: najpierw hodowlę niektórych komórek ludzkich sadzi się w pożywce, po czym w taki czy inny sposób wprowadza się do komórek niezbędne geny, hoduje się przez pewien czas i ponownie przeszczepiane do ciała żywiciela. W rezultacie komórki mogą powrócić do swoich normalnych właściwości. I tak na przykład ludzkie białe krwinki (leukocyty) zmodyfikowano pod kątem białaczki (ryc. 10).

Ryc.10

Los genu po wejściu do komórki

Ponieważ w przypadku wektorów wirusowych wszystko jest mniej więcej jasne ze względu na ich zdolność do skuteczniejszego dostarczania genów do ostatecznego celu - jądra, zastanowimy się nad losem wektora plazmidowego.

NA na tym etapie Udało nam się osiągnąć, że DNA przekroczyło pierwszą dużą barierę – błonę cytoplazmatyczną komórki.

Następnie w połączeniu z innymi substancjami, otoczonymi lub nie, musi dotrzeć do jądra komórkowego, aby specjalny enzym – polimeraza RNA – zsyntetyzował cząsteczkę informacyjnego RNA (mRNA) na matrixie DNA (proces ten nazywa się transkrypcja). Dopiero po tym mRNA zostanie uwolniony do cytoplazmy, utworzy kompleks z rybosomami i wg kod genetyczny syntezowany jest polipeptyd – na przykład czynnik wzrostu naczyń (VEGF), który zacznie pełnić określoną funkcję terapeutyczną (w w tym przypadku- rozpocznie proces tworzenia się rozgałęzionych naczyń w tkance podatnej na niedokrwienie).

Jeśli chodzi o ekspresję wprowadzonych genów w wymaganym typie komórki, problem ten rozwiązuje się za pomocą elementów regulujących transkrypcję. Tkankę, w której zachodzi ekspresja, często określa się poprzez połączenie specyficznego tkankowo wzmacniacza („sekwencja wzmacniająca”) ze specyficznym promotorem (sekwencja nukleotydów, od którego rozpoczyna się synteza polimerazy RNA), który może być indukowany . Wiadomo, że aktywność genów można modulować na żywo sygnały zewnętrzne, a ponieważ wzmacniacze mogą współpracować z dowolnym genem, do wektorów można wprowadzić izolatory, które pomagają wzmacniaczowi działać niezależnie od jego położenia i mogą działać jako bariery funkcjonalne między genami. Każdy wzmacniacz zawiera zestaw miejsc wiązania dla aktywujących lub hamujących czynników białkowych. Promotory można również stosować do regulowania poziomu ekspresji genów. Na przykład, istnieją promotory metalotioneiny lub wrażliwe na temperaturę; promotory kontrolowane przez hormony.

Ekspresja genu zależy od jego pozycji w genomie. W większości przypadków istniejące metody wirusowe skutkują jedynie przypadkowym wprowadzeniem genu do genomu. Aby wyeliminować taką zależność, przy konstruowaniu wektorów do genu dostarczane są znane sekwencje nukleotydowe, które pozwalają na ekspresję genu niezależnie od miejsca jego wstawienia do genomu.

Najprostszym sposobem regulacji ekspresji transgenu jest dostarczenie mu promotora wskaźnikowego, który jest wrażliwy na sygnał fizjologiczny, taki jak uwolnienie glukozy lub niedotlenienie. Takie „endogenne” systemy kontroli mogą być przydatne w niektórych sytuacjach, takich jak zależna od glukozy kontrola produkcji insuliny. „Egzogenne” systemy kontroli są bardziej niezawodne i uniwersalne, gdy ekspresja genów jest kontrolowana farmakologicznie poprzez wprowadzenie małej cząsteczki leku. Obecnie znane są 4 główne systemy kontroli - regulowane przez tetracyklinę (Tet), steroid owadzi, ekdyson lub jego analogi, lek przeciwprogestynowy mayfpriston (RU486) oraz chemiczne dimeryzatory, takie jak rapamycyna i jej analogi. Wszystkie obejmują zależne od leku przyciąganie domeny aktywacji transkrypcji do głównego promotora prowadzącego pożądany gen, różnią się jednak mechanizmami tego przyciągania .

Wniosek

Przegląd danych pozwala nam dojść do wniosku, że pomimo wysiłków wielu laboratoriów na całym świecie, wszystko już znane i przetestowane na żywo I in vitro systemy wektorowe są dalekie od doskonałości . Jeżeli jest problem z dostarczeniem obcego DNA in vitro praktycznie rozwiązany i jego dostarczanie do komórek docelowych różnych tkanek na żywo pomyślnie rozwiązane (głównie poprzez stworzenie konstruktów przenoszących białka receptorowe, zawierające antygeny specyficzne dla określonych tkanek), wówczas inne cechy istniejących układów wektorowych – stabilność integracji, regulowana ekspresja, bezpieczeństwo – nadal wymagają poważnych udoskonaleń.

Przede wszystkim dotyczy to stabilności integracji. Do tej pory integrację z genomem osiągano jedynie przy użyciu wektorów retrowirusowych lub związanych z adenowirusami. Skuteczność stabilnej integracji można zwiększyć poprzez ulepszenie konstruktów genowych, takich jak systemy, w których pośredniczy receptor, lub poprzez utworzenie wystarczająco stabilnych wektorów episomalnych (tj. struktur DNA zdolnych do długi pobyt wewnątrz jąder). Ostatnio szczególną uwagę poświęcono tworzeniu wektorów opartych na sztucznych chromosomach ssaków. Dzięki obecności podstawowych elementy konstrukcyjne W zwykłych chromosomach takie minichromosomy utrzymują się w komórkach przez długi czas i są zdolne do przenoszenia pełnowymiarowych (genomowych) genów i ich naturalnych elementów regulatorowych, niezbędnych do prawidłowego działania genu, we właściwej tkance i we właściwym czasie.

Terapia genowa i komórkowa otwiera wspaniałe perspektywy odbudowy utraconych komórek i tkanek oraz projektowania inżynierii genetycznej narządów, co niewątpliwie znacząco poszerzy arsenał metod badań biomedycznych i stworzy nowe możliwości zachowania i przedłużenia życia ludzkiego.

Terapia genowa to leczenie chorób dziedzicznych, niedziedzicznych, które polega na wprowadzeniu innych genów do komórek pacjenta. Celem terapii jest wyeliminowanie defektów genowych lub nadanie komórkom nowych funkcji. O wiele łatwiej jest wprowadzić do komórki zdrowy, w pełni funkcjonujący gen, niż korygować defekty w już istniejącym.

Terapia genowa ogranicza się do badań w tkankach somatycznych. Wynika to z faktu, że jakakolwiek interwencja w zarodek i komórki rozrodcze może dać całkowicie nieprzewidywalny wynik.

Obecnie stosowana technika jest skuteczna w leczeniu zarówno chorób jednogenowych, jak i wieloczynnikowych ( nowotwory złośliwe, niektóre rodzaje ciężkich chorób sercowo-naczyniowych, choroby wirusowe).

Około 80% wszystkich projektów terapii genowej dotyczy zakażenia wirusem HIV, a obecnie trwają badania nad hemofilią B, mukowiscydozą i hipercholesterolemią.

Leczenie obejmuje:

· izolacja i namnażanie poszczególnych typów komórek pacjenta;

· wprowadzenie obcych genów;

· selekcja komórek, w których „zapuścił korzenie” obcy gen;

· wszczepienie ich pacjentowi (np. poprzez transfuzję krwi).

Terapia genowa polega na wprowadzeniu sklonowanego DNA do tkanki pacjenta. Za najskuteczniejsze metody uważa się szczepionki iniekcyjne i aerozolowe.

Terapia genowa działa na dwa sposoby:

1. Leczenie chorób jednogenowych. Należą do nich zaburzenia w funkcjonowaniu mózgu, które wiążą się z jakimkolwiek uszkodzeniem komórek wytwarzających neuroprzekaźniki.

2. Leczenie Główne podejścia stosowane w tym obszarze:

· Genetyczne doskonalenie komórek odpornościowych;

Zwiększona immunoreaktywność nowotworu;

blok ekspresji onkogenu;

· ochrona zdrowych komórek przed chemioterapią;

· wprowadzenie genów supresorowych nowotworów;

wytwarzanie substancji przeciwnowotworowych zdrowe komórki;

· produkcja szczepionek przeciwnowotworowych;

· Lokalna reprodukcja normalnych tkanek przy pomocy przeciwutleniaczy.

Stosowanie terapii genowej ma wiele zalet i w niektórych przypadkach jest jedyną szansą normalne życie dla chorych. Jednak ta dziedzina nauki nie została w pełni zbadana. Istnieje międzynarodowy zakaz testowania komórek rozrodczych i komórek rozrodczych przedimplantacyjnych. Ma to na celu zapobieganie niepożądanym konstruktom genów i mutacjom.

Opracowano i ogólnie przyjęto kilka warunków, pod którymi dozwolone są badania kliniczne:

Gen przeniesiony do komórek docelowych musi być aktywny przez długi czas.

W obcym środowisku gen musi zachować swoją skuteczność.

Transfer genów nie powinien powodować reakcje negatywne w organizmie.

Istnieje wiele pytań, które pozostają aktualne dla wielu naukowców na całym świecie:

Czy naukowcom zajmującym się terapią genową uda się opracować kompletną korektę genu, która nie będzie stanowić zagrożenia dla potomstwa?

Czy potrzeba i korzyść z zabiegu terapii genowej dla pojedynczej pary przeważą ryzyko dla przyszłości ludzkości?

Czy są one uzasadnione? podobne procedury, biorąc pod uwagę przyszłość?

Jak takie zabiegi na ludziach będą się odnosić do zagadnień homeostazy biosfery i społeczeństwa?

Podsumowując, można zauważyć, że terapia genetyczna na obecnym etapie oferuje ludzkości najwięcej sposobów leczenia poważna choroba, które do niedawna uważane były za nieuleczalne i śmiertelne. Jednak jednocześnie rozwój tej nauki stawia przed naukowcami nowe problemy, które należy dziś rozwiązać.

Dystrofia mięśniowa Duchenne’a jest jedną z rzadkich, ale wciąż stosunkowo powszechnych chorób choroby genetyczne. Chorobę rozpoznaje się w wieku od trzech do pięciu lat, zwykle u chłopców, początkowo objawiającą się jedynie trudnymi ruchami; w wieku dziesięciu lat osoba cierpiąca na taką dystrofię mięśniową nie może już chodzić, a w wieku 20 lat – 22 jego życie dobiegło końca. Jest to spowodowane mutacją w genie dystrofiny, który znajduje się na chromosomie X. Koduje białko, które łączy błonę komórkową mięśnia z włóknami kurczliwymi. Funkcjonalnie jest to rodzaj sprężyny zapewniającej płynny skurcz i integralność błony komórkowej. Mutacje w genie prowadzą do dystrofii tkanki mięśni szkieletowych, przepony i serca. Leczenie choroby ma charakter paliatywny i może jedynie nieznacznie złagodzić cierpienie. Jednak wraz z rozwojem inżynierii genetycznej pojawiło się światło w tunelu.

O wojnie i pokoju

Terapia genowa polega na dostarczaniu konstruktów opartych na kwasach nukleinowych do komórek w celu leczenia chorób genetycznych. Za pomocą takiej terapii możliwa jest korekta problemu genetycznego na poziomie DNA i RNA, zmieniając proces ekspresji pożądanego białka. Na przykład DNA o skorygowanej sekwencji można dostarczyć do komórki, z którą syntetyzuje się funkcjonalne białko. Lub odwrotnie, możliwe jest usunięcie pewnych sekwencji genetycznych, co pomoże również zmniejszyć szkodliwe skutki mutacji. W teorii jest to proste, jednak w praktyce terapia genowa opiera się na najbardziej złożonych technologiach pracy z obiektami mikroskopowymi i stanowi zbiór zaawansowanego know-how z zakresu biologii molekularnej.

Wstrzykiwanie DNA do przedjądra zygoty jest jedną z najwcześniejszych i najbardziej tradycyjnych technologii tworzenia transgenów. Wstrzyknięcie wykonuje się ręcznie przy użyciu ultracienkich igieł pod mikroskopem o powiększeniu 400x.

„Gen dystrofiny, którego mutacje powodują dystrofię mięśniową Duchenne’a, jest ogromny” – mówi Vadim Zhernovkov, dyrektor ds. rozwoju firmy biotechnologicznej Marlin Biotech, kandydat nauk biologicznych. „Zawiera 2,5 miliona par nukleotydów, co można porównać z liczbą liter w powieści Wojna i pokój”. I wyobraźmy sobie, że wyrwaliśmy z epopei kilka ważnych stron. Gdyby te strony opisywały istotne wydarzenia, to zrozumienie książki byłoby już trudne. Ale w przypadku genu wszystko jest bardziej skomplikowane. Nietrudno byłoby znaleźć kolejny egzemplarz Wojny i pokoju, a wtedy można byłoby odczytać brakujące strony. Ale gen dystrofiny znajduje się na chromosomie X, a u mężczyzn jest tylko jeden. Zatem tylko jedna kopia genu jest przechowywana w chromosomach płci chłopców po urodzeniu. Nie ma gdzie dostać drugiego.

Wreszcie, podczas syntezy białek z RNA ważne jest utrzymanie ramki odczytu. Ramka odczytu określa, która grupa trzech nukleotydów jest odczytywana jako kodon, odpowiadający jednemu aminokwasowi w białku. Jeśli w genie zostanie usunięty fragment DNA, który nie jest wielokrotnością trzech nukleotydów, ramka odczytu ulega przesunięciu – zmianie ulega kodowanie. Można to porównać do sytuacji, gdy po wyrwanych kartkach całej pozostałej księgi wszystkie litery alfabetu zastępowane są kolejnymi. Rezultatem będzie abrakadabra. To samo dzieje się z niewłaściwie syntetyzowanym białkiem.

Plaster biomolekularny

Jeden z skuteczne metody terapia genowa mająca na celu przywrócenie prawidłowej syntezy białek - pominięcie egzonów przy użyciu krótkich sekwencji nukleotydowych. Marlin Biotech opracował już technologię pracy z genem dystrofiny tą metodą. Jak wiadomo, w procesie transkrypcji (syntezy RNA) najpierw powstaje tzw. prematryca RNA, która zawiera zarówno regiony kodujące białka (eksony), jak i regiony niekodujące (introny). Następnie rozpoczyna się proces splicingu, podczas którego introny i eksony zostają rozdzielone i powstaje „dojrzały” RNA, składający się wyłącznie z eksonów. W tym momencie niektóre eksony można zablokować, „zapieczętować” za pomocą specjalnych cząsteczek. W rezultacie dojrzały RNA nie będzie zawierał tych regionów kodujących, których wolelibyśmy się pozbyć, a tym samym ramka odczytu zostanie przywrócona i białko zostanie zsyntetyzowane.

„Debugowaliśmy tę technologię in vitro” – mówi Vadim Zhernovkov, czyli in hodowle komórkowe wyhodowanych z komórek pacjentów z dystrofią mięśniową Duchenne’a. Ale poszczególne komórki- to nie jest organizm. Atakując procesy komórkowe, musimy obserwować konsekwencje na żywo, ale nie jest możliwe angażowanie ludzi w badania z powodu różne powody- od etycznego do organizacyjnego. Dlatego istniała potrzeba uzyskania laboratoryjnego modelu zwierzęcego dystrofii mięśniowej Duchenne’a z pewnymi mutacjami.”

Jak wstrzyknąć mikrokosmos

Zwierzęta transgeniczne to zwierzęta uzyskane w laboratorium, w których celowo i celowo dokonano zmian w ich genomie. Już w latach 70. ubiegłego wieku stało się jasne, że powstawanie transgenów jest najważniejsza metoda badania funkcji genów i białek. Jedną z najwcześniejszych metod uzyskania całkowicie genetycznie zmodyfikowanego organizmu było wstrzyknięcie DNA do przedjądra („prekursora jądra”) zygoty zapłodnionych jaj. Jest to logiczne, gdyż najłatwiej jest modyfikować genom zwierzęcia już na samym początku jego rozwoju.

Diagram przedstawia proces CRISPR/Cas9, który obejmuje subgenomowy RNA (sgRNA), jego region pełniący rolę kierującego RNA, oraz białko nukleazy Cas9, które przecina obie nici genomowego DNA w miejscu określonym przez kierujący RNA.

Wstrzyknięcie do jądra zygoty jest zabiegiem bardzo nietrywialnym, gdyż mówimy o mikroskali. Jajo myszy ma średnicę 100 mikronów, a przedjądro ma 20 mikronów. Operacja odbywa się pod mikroskopem o powiększeniu 400x, jednak wstrzyknięcie jest pracą najbardziej ręczną. Oczywiście do „wstrzyknięcia” nie używa się tradycyjnej strzykawki, ale specjalną szklaną igłę z wydrążonym wewnątrz kanałem, do którego zbiera się materiał genowy. Jeden koniec można trzymać w dłoni, a drugi – ultracienki i ostry – jest praktycznie niewidoczny gołym okiem. Oczywiście tak delikatnej konstrukcji wykonanej ze szkła borokrzemianowego nie można długo przechowywać, dlatego laboratorium dysponuje zestawem półfabrykatów, które bezpośrednio przed pracą są wyciągane na specjalnej maszynie. Stosowany jest specjalny system wizualizacji kontrastowej komórki bez barwienia – interwencja w przedjądrzu jest sama w sobie traumatyczna i stanowi czynnik ryzyka dla przeżycia komórki. Farba byłaby kolejnym takim czynnikiem. Na szczęście jaja są dość odporne, ale liczba zygot, z których powstają zwierzęta transgeniczne, stanowi zaledwie kilka procent całkowitej liczby jaj, do których wstrzyknięto DNA.

Kolejnym etapem jest zabieg chirurgiczny. Przeprowadzana jest operacja polegająca na przeszczepieniu zygot, do których wstrzyknięto mikroiniekcję, do jajowodu myszy biorcy, która stanie się matką zastępczą dla przyszłych transgenów. Następne zwierzę laboratoryjne naturalnie cykl ciąży trwa i rodzi się potomstwo. Zazwyczaj w miocie znajduje się około 20% myszy transgenicznych, co również wskazuje na niedoskonałość metody, gdyż jest w niej duży element losowości. Po wstrzyknięciu badacz nie może dokładnie kontrolować, w jaki sposób wprowadzone fragmenty DNA zostaną zintegrowane z genomem przyszłego organizmu. Istnieje duże prawdopodobieństwo wystąpienia takich kombinacji, które doprowadzą do śmierci zwierzęcia w stadium embrionalnym. Niemniej jednak metoda działa i jest całkiem odpowiednia do wielu celów naukowych.

Rozwój technologii transgenicznych umożliwia produkcję białek zwierzęcych, na które istnieje zapotrzebowanie przemysłu farmaceutycznego. Białka te ekstrahuje się z mleka transgenicznych kóz i krów. Istnieją również technologie pozyskiwania określonych białek z jaj kurzych.

Nożyczki DNA

Ale jest coś więcej skuteczna metoda w oparciu o ukierunkowaną edycję genomu przy użyciu technologii CRISPR/Cas9. „Dzisiaj biologia molekularna przypomina nieco erę długodystansowych wypraw morskich pod żaglami” – mówi Vadim Zhernovkov. — Niemal co roku w tej nauce dochodzi do znaczących odkryć, które mogą zmienić nasze życie. Na przykład kilka lat temu mikrobiolodzy odkryli odporność na infekcje wirusowe u pozornie długo badanego gatunku bakterii. W wyniku dalszych badań okazało się, że bakteryjny DNA zawiera specjalne loci (CRISPR), z których syntetyzowane są fragmenty RNA mogące wiązać się komplementarnie z kwasami nukleinowymi elementy obce na przykład z wirusami DNA lub RNA. Z takim RNA wiąże się białko Cas9, które jest enzymem nukleazą. RNA służy jako przewodnik dla Cas9, zaznaczając określoną sekcję DNA, w której nukleaza wykonuje cięcie. Około trzech do pięciu lat temu pierwszy prace naukowe, która opracowała technologię CRISPR/Cas9 do edycji genomu.”

Transgeniczne myszy umożliwiają tworzenie żywych modeli poważnych chorób genetycznych człowieka. Ludzie powinni być wdzięczni tym maleńkim stworzeniom.

W porównaniu do metody wprowadzania konstruktu do losowej insercji, nowa metoda pozwala na selekcję elementów systemu CRISPR/Cas9 w taki sposób, aby precyzyjnie skierować przewodniki RNA do pożądanych regionów genomu i osiągnąć celową delecję lub insercję pożądaną sekwencję DNA. Metoda ta również obarczona jest błędami (RNA przewodnie czasami wiąże się w niewłaściwym miejscu, w którym jest docelowy), jednak przy zastosowaniu CRISPR/Cas9 skuteczność tworzenia transgenów wynosi już około 80%. „Ta metoda ma szerokie perspektywy nie tylko w tworzeniu transgenów, ale także w innych obszarach, w szczególności w terapii genowej” – mówi Vadim Zhernovkov. „Jednak technologia jest dopiero na początku swojej drogi i dość trudno sobie wyobrazić, że w niedalekiej przyszłości kod genetyczny człowieka zostanie poprawiony za pomocą CRISPR/Cas9. Chociaż istnieje możliwość popełnienia błędu, istnieje również niebezpieczeństwo, że dana osoba utraci ważną część kodującą genomu.

Lek na mleko

Rosyjskiej firmie Marlin Biotech udało się stworzyć transgeniczną mysz, u której całkowicie powiela się mutacja prowadząca do dystrofii mięśniowej Duchenne’a, a kolejnym etapem będą testy technologii terapii genowej. Jednak tworzenie modeli chorób genetycznych człowieka na podstawie zwierząt laboratoryjnych to nie jedyne możliwe wykorzystanie transgenów. Tym samym w Rosji i laboratoriach zachodnich trwają prace z zakresu biotechnologii, umożliwiające otrzymanie białek leczniczych pochodzenia zwierzęcego, ważnych dla przemysłu farmaceutycznego. Krowy lub kozy mogą pełnić rolę producentów, w których można zmienić aparat komórkowy do produkcji białek zawartych w mleku. Z mleka można wyekstrahować białko lecznicze, które uzyskuje się nie metodą chemiczną, a naturalnym mechanizmem, co zwiększy skuteczność leku. Obecnie opracowano technologie produkcji białek leczniczych takich jak laktoferyna ludzka, prourokinaza, lizozym, atryna, antytrombina i inne.

14943 0

Ustalenie lokalizacji i sekwencji genu, którego mutacje powodują określone choroby, a także sama mutacja i nowoczesne metody jego badanie pozwala na rozpoznanie choroby w okresie neo-, a nawet prenatalnym rozwoju organizmu. Dzięki temu możliwe jest złagodzenie manifestacji wada genetyczna poprzez leki, dietę, transfuzję krwi itp.

Jednak takie podejście nie prowadzi do skorygowania samej wady i z reguły chorób dziedzicznych nie leczy się. Sytuację dodatkowo komplikuje fakt, że najwięcej może dać mutacja w jednym genie różne konsekwencje na ciele. Jeśli mutacja genu powoduje zmiany w aktywności kodowanego przez niego enzymu, może to prowadzić do akumulacji toksycznego substratu lub odwrotnie, do niedoboru związku niezbędnego do prawidłowego funkcjonowania komórki.

Dobrze znanym przykładem takiej choroby jest fenyloketonuria. Jest to spowodowane mutacją w genie enzymu wątrobowego dehydroksylazy fenyloalaniny, który katalizuje konwersję fenyloalaniny do tyrozyny. W efekcie wzrasta poziom endogennej fenyloalaniny we krwi, co powoduje nieprawidłowe tworzenie się osłonki mielinowej wokół aksonów komórki nerwowe centralnego układu nerwowego i w rezultacie poważne upośledzenie umysłowe.

Jeśli mutacja wpływa na gen białka strukturalnego, może to prowadzić do poważne naruszenia na poziomie komórek, tkanek lub narządów. Przykładem takiej choroby jest mukowiscydoza.

Delecja w genie kodującym białko zwane transporterem mukowiscydoza, prowadzi do syntezy wadliwego białka (brak fenyloalaniny 508) i zakłócenia transportu jonów chloru przez błony komórkowe. Jeden z najbardziej szkodliwe skutki Dzieje się tak dlatego, że śluz wyściełający i chroniący płuca staje się nienormalnie gęsty. Utrudnia to dostęp do komórek płuc i sprzyja ich gromadzeniu szkodliwe mikroorganizmy. Komórki wyściełające drogi oddechowe płuc obumierają i są zastępowane włóknistą tkanką bliznowatą (stąd nazwa choroby). W rezultacie pacjent umiera z powodu niewydolności oddechowej.

Choroby dziedziczne mają złożone objawy kliniczne, a ich tradycyjne leczenie ma głównie charakter objawowy: w leczeniu fenyloketonurii przepisuje się dietę bez alaniny, wadliwe białka zastępuje się funkcjonalnym podawaniem dożylnym oraz przeprowadza się przeszczep szpiku kostnego lub innego narządu w celu zrekompensowania utraconych funkcji . Wszystkie te środki są zwykle nieskuteczne, drogie, czasochłonne, a tylko nieliczni pacjenci dożywają starości. Dlatego bardzo ważny jest rozwój całkowicie nowych rodzajów terapii.

Terapia genowa

W 1990 roku w Stanach Zjednoczonych dr W. French Andrson podjął pierwszą próbę zastosowania terapii genowej w leczeniu ciężkiego złożonego niedoboru odporności (SCID) u trzyletniej dziewczynki Ashanti da Silva. Choroba ta spowodowana jest mutacją w genie kodującym adenosanadenylazę (ADA). Niedobór tego enzymu przyczynia się do gromadzenia się adenozyny i deoksyadenozyny we krwi, efekt toksyczny co prowadzi do śmierci limfocytów B i T krew obwodowa i w konsekwencji niedobór odporności.

Dzieci chore na tę chorobę należy chronić przed wszelkimi infekcjami (przechowywać w specjalnych sterylnych komorach), ponieważ każda choroba może być śmiertelna. Cztery lata od rozpoczęcia leczenia u dziecka wykazano prawidłowo funkcjonującą ADA i złagodzenie objawów SCID, co pozwoliło jej opuścić sterylną komorę i żyć normalnie.

Zatem podstawowa możliwość odniesienia sukcesu terapii genetycznej komórki somatyczne. Od lat 90. Terapia genowa jest testowana pod kątem szeregu chorób genetycznych, w tym tak poważnych jak hemofilia, AIDS, różne rodzaje nowotwory złośliwe, mukowiscydoza itp. Obecnie za pomocą transgenezy można wyleczyć około 10 chorób człowieka.

Różnorodność chorób genetycznych doprowadziła do opracowania wielu podejść do terapii genowej. W tym przypadku rozwiązano 2 główne problemy: sposób dostarczenia genu terapeutycznego; sposób zapewnienia ukierunkowanego dostarczania do komórek przeznaczonych do korekcji. Do chwili obecnej wszystkie podejścia do terapii genowej komórek somatycznych można podzielić na dwie kategorie: terapię ex vivo i terapię in vivo (ryc. 3.15).

Ryż. 3.15. Schemat terapii genowej ex vivo (a) i in vivo (a)

Terapia genowa in vivo polega na dostarczaniu genu terapeutycznego bezpośrednio do komórek określonej tkanki pacjenta. Przyjrzyjmy się tym podejśćom bardziej szczegółowo.

Terapia genowa ex vivo obejmuje następujące etapy:
1) pobranie od pacjenta wadliwych komórek i ich hodowanie;
2) przeniesienie pożądanego genu do izolowanych komórek przy użyciu transfekcji konstruktu genu terapeutycznego;
3) selekcja i namnażanie komórek poprawionych genetycznie;
4) przeszczepienie lub transfuzja tych komórek pacjentowi.

Wykorzystanie własnych komórek pacjenta gwarantuje, że po zwróceniu nie rozwinie się u nich odpowiedź immunologiczna. Procedura przenoszenia konstruktu genowego musi być skuteczna, a normalny gen musi być stabilnie utrzymywany i stale wyrażany.

Stworzonym przez samą naturę środkiem przenoszenia genów są wirusy. W celu uzyskania skutecznych wektorów do dostarczania genów wykorzystuje się głównie dwie grupy wirusów – adenowirusy i retrowirusy (ryc. 3.16). W terapii genowej wykorzystuje się warianty wirusów zneutralizowanych genetycznie.

Ryż. 3.16. Wirusy wykorzystywane do tworzenia wektorów terapeutycznych

Ryż. 3.17. Mapa genetyczna typowego retrowirusa (a) i mapa wektora retrowirusowego (a)

Podczas uzyskiwania wektora retrowirusowego do plazmidu wprowadza się pełnej długości DNA retrowirusa, usuwa się większość genu gag oraz całe geny pol i env, a zamiast nich „terapeutyczny” gen T i, jeśli to konieczne, , wstawiany jest selektywny gen markerowy Rg z własnym promotorem (ryc. 3.17, b ). Transkrypcja genu T będzie kontrolowana przez ten sam silny promotor zlokalizowany w regionie 5"-LTR. W oparciu o ten schemat stworzono różne wektory retrowirusowe i maksymalną wielkość wstawki DNA wynoszącą około 8 tys. bp.

Otrzymany w ten sposób konstrukt może sam zostać wykorzystany do transformacji, ale jego wydajność i późniejsza integracja z genomem komórki gospodarza jest wyjątkowo niska. Dlatego opracowano technikę pakowania pełnej długości RNA wektora retrowirusowego w nienaruszone cząstki wirusa, które z dużą częstotliwością przenikają do komórki i gwarantują integrację z genomem gospodarza. W tym celu stworzono tzw. linię komórkową „pakującą”. W dwóch różnych odcinkach chromosomów tych komórek osadzone są retrowirusowe geny gag i pol-env, pozbawione zdolności do pakowania ze względu na brak sekwencji + (84*+) (ryc. 3.18).

Ryż. 3.18. Schemat otrzymywania opakowanego wektora wirusowego

Retrowirusy aktywnie infekują tylko szybko dzielące się komórki. Aby przenieść geny, poddaje się je działaniu oczyszczonych cząstek opakowanego wektora retrowirusowego lub hoduje się wspólnie z linią komórkową, która je wytwarza, a następnie selekcjonuje w celu oddzielenia komórek docelowych od komórek pakujących.

Transdukowane komórki są dokładnie sprawdzane pod kątem poziomu syntezy produktu genu terapeutycznego, braku retrowirusów kompetentnych do replikacji i braku zmian w zdolności komórek do wzrostu lub funkcjonowania.

Komórki szpiku kostnego są najbardziej odpowiednie do terapii genowej. Dzieje się tak dzięki obecności w nim totipotencjalnych embrionalnych komórek macierzystych, które potrafią się proliferować i różnicować Różne rodzaje komórki - limfocyty B i T, makrofagi, erytrocyty, płytki krwi i osteoklasty. To właśnie te komórki wykorzystuje się w leczeniu szeregu chorób dziedzicznych, m.in. wspomnianego już ciężkiego złożonego niedoboru odporności, choroby Gauchera, anemia sierpowata, talasemia, osteoporoza itp.

Oprócz totipotencjalnych komórek macierzystych szpiku kostnego, które są trudne do izolacji i hodowli, w leczeniu hipercholesterolemii wykorzystuje się komórki macierzyste z krwi pępowinowej (preferowane zastosowanie w terapii genowej u noworodków), a także komórki wątroby – hepatocyty.

W terapii genowej in vivo szczególnie ważne jest zapewnienie dostarczenia genu terapeutycznego do uszkodzonych komórek. Takie ukierunkowane dostarczanie można zapewnić za pomocą zmodyfikowanych wektorów stworzonych na bazie wirusów zdolnych do infekowania określonych typów komórek. Rozważmy podejście opracowane do leczenia mukowiscydozy wspomniane już powyżej. Ponieważ płuca są otwartą jamą, stosunkowo łatwo jest dostarczyć do nich geny terapeutyczne. Sklonowaną wersję zdrowego genu wprowadzono do inaktywowanego adenowirusa (ryc. 3.19). Specyfika tego typu wirusa polega na tym, że infekuje on błonę śluzową płuc, powodując przeziębienie.

Ryż. 3.19. Schemat otrzymywania wektora na bazie adenowirusa

Oprócz retro- i adenowirusów w eksperymentach terapii genowej wykorzystuje się także inne typy wirusów, na przykład wirus opryszczki pospolitej. Szczególną cechą tego dwuniciowego wirusa DNA (152 kb) jest jego zdolność do specyficznego infekowania neuronów. Znanych jest wiele chorób genetycznych dotykających ośrodkowy i obwodowy układ nerwowy system nerwowy- nowotwory, Zaburzenia metaboliczne, choroby neurodegeneracyjne (choroba Alzheimera, choroba Parkinsona).

Wirus opryszczki pospolitej typu I (HSV) jest bardzo odpowiednim wektorem do leczenia takich chorób. Kapsyd tego wirusa łączy się z błoną neuronu, a jego DNA jest transportowane do jądra. Zaproponowano kilka metod przenoszenia genu terapeutycznego przy użyciu wektorów HSV i przeprowadzono udane testy na zwierzętach doświadczalnych.

Wektory wirusowe mają kilka wad: wysoki koszt, ograniczoną zdolność klonowania i możliwą reakcję zapalną. I tak w 1999 roku w wyniku rozwoju niezwykle silnej odpowiedzi immunologicznej na wprowadzenie wektora adenowirusowego zmarła 18-letnia ochotniczka, która brała udział w badaniach leków. W 2002 r. u dwójki dzieci we Francji podczas leczenia niedoborów odporności (poprzez wprowadzenie genów terapeutycznych do komórek macierzystych przy użyciu retrowirusów) rozwinęła się choroba przypominająca białaczkę.

Dlatego opracowywane są niewirusowe systemy dostarczania genów. Najprostszym i najbardziej nieskutecznym sposobem jest wstrzyknięcie plazmidowego DNA do tkanek. Drugie podejście polega na bombardowaniu tkanek mikrocząsteczkami złota (1-3 mikronów) sprzężonymi z DNA. W tym przypadku geny terapeutyczne ulegają ekspresji w tkankach docelowych, a ich produkty – białka terapeutyczne – przedostają się do krwi. Główną wadą tego podejścia jest przedwczesna inaktywacja lub zniszczenie tych białek przez składniki krwi.

DNA można dostarczyć pakując je w sztuczną otoczkę lipidową. Otrzymane w ten sposób sferyczne cząstki liposomów z łatwością przenikają przez błonę komórkową. Powstały liposomy o różnorodnych właściwościach, jednak jak dotąd skuteczność takiego dostarczania jest niska, gdyż większość DNA ulega zniszczeniu lizosomalnemu. Ponadto, aby dostarczyć konstrukt genetyczny, koniugaty DNA syntetyzuje się z różnymi cząsteczkami, które mogą zapewnić jego bezpieczeństwo, ukierunkowane dostarczanie i przenikanie do komórki.

W ostatnich latach prowadzone są intensywne eksperymenty mające na celu stworzenie sztucznego chromosomu 47, który umożliwiłby włączenie dużej ilości materiału genetycznego z pełnym zestawem elementów regulatorowych dla jednego lub większej liczby genów terapeutycznych. Umożliwiłoby to wykorzystanie genomowego wariantu genu terapeutycznego, a tym samym zapewnienie jego stabilności i skutecznej, długotrwałej ekspresji. Eksperymenty wykazały, że stworzenie sztucznego ludzkiego chromosomu zawierającego geny terapeutyczne jest całkiem możliwe, jednak nie jest jeszcze jasne, jak wprowadzić tak ogromną cząsteczkę do jądra komórki docelowej.

Główne wyzwania stojące przed terapią genową, oprócz ryzyka ciężkiego reakcja immunologiczna, to trudności w długotrwałym przechowywaniu i funkcjonowaniu terapeutycznego DNA w organizmie pacjenta, wielogenowy charakter wielu chorób, czyniący je trudnymi celami terapii genowej, a także ryzyko wykorzystania wirusów jako wektorów.

NA. Voinov, T.G. Volova