Vektör gen transferi. Viral vektörler

Not!

Bu çalışma, popüler bilim makaleleri yarışmasına “En İyi İnceleme” kategorisinde sunuldu.

Ölümcül pençeler

İnsanlık bununla karşı karşıya gizemli hastalıkçağımızdan önce bile. Dünyanın çeşitli yerlerindeki bilim insanları bunu anlamaya ve tedavi etmeye çalıştı: Antik Mısır- Ebers, Hindistan'da - Sushruta, Yunanistan - Hipokrat. Hepsi ve diğer birçok doktor, tehlikeli ve ciddi bir düşman olan kansere karşı savaştı. Ve bu savaş bugüne kadar devam etse de, tam ve nihai bir zafer şansının olup olmadığını belirlemek zor. Sonuçta, hastalığı ne kadar çok incelersek, o kadar sık ​​\u200b\u200bsoru ortaya çıkıyor: Kanseri tamamen iyileştirmek mümkün mü? Hastalıktan nasıl kaçınılır? Tedaviyi hızlı, erişilebilir ve ucuz hale getirmek mümkün mü?

Hipokrat ve gözlem gücü sayesinde (bir tümör ile kanserin dokunaçları arasındaki benzerliği gören oydu), bu terim eski tıbbi incelemelerde de yer aldı. karsinom(Yunan karsinosu) veya kanser(enlem. kanser). İÇİNDE tıbbi uygulama malign neoplazmalar farklı şekilde sınıflandırılır: karsinomlar (epitel dokulardan), sarkomlar (bağ, kas dokularından), lösemi (kanda ve kemik iliği), lenfoma (içinde lenf sistemi) ve diğerleri (diğer hücre türlerinde gelişir, örneğin glioma - beyin kanseri). Ancak günlük yaşamda "kanser" terimi daha popülerdir, bu da herhangi bir şey anlamına gelir. kötü huylu tümör.

Mutasyonlar: ölmek mi yoksa sonsuza kadar yaşamak mı?

Çeşitli genetik araştırma kanser hücrelerinin oluşumunun genetik değişikliklerin sonucu olduğunu keşfetti. DNA replikasyonu (kopyalama) ve onarımındaki (hata düzeltme) hatalar, hücre bölünmesini kontrol edenler de dahil olmak üzere genlerde değişikliklere yol açar. Genom hasarına ve ardından mutasyonların edinilmesine katkıda bulunan ana faktörler endojendir (saldırı). serbest radikaller metabolizma sırasında oluşan, bazı DNA bazlarının kimyasal kararsızlığı) ve eksojen (iyonlaştırıcı ve UV radyasyonu, kimyasal kanserojenler). Genomda mutasyonlar oluştuğunda normal hücrelerin kanser hücrelerine dönüşmesini teşvik ederler. Bu tür mutasyonlar esas olarak normalde hücre bölünmesini uyaran proto-onkogenlerde meydana gelir. Bunun sonucunda gen sürekli “açık” olabilir ve mitoz (bölünme) durmaz, bu da aslında kötü huylu dejenerasyon anlamına gelir. Normalde çoğalmayı engelleyen genlerde (tümör baskılayıcı genler) inaktive edici mutasyonlar meydana gelirse, bölünme üzerindeki kontrol kaybolur ve hücre "ölümsüz" hale gelir (Şekil 1).

Şekil 1. Kanserin genetik modeli: kolon kanseri.İlk adım, beşinci kromozomdaki APS geninin iki alelinin kaybı veya inaktivasyonudur. Ne zaman ailesel kanser(tanıdık adenomatöz polipozis, FAP) APC geninin bir mutasyonu kalıtsaldır. Her iki alelin kaybı iyi huylu adenomların oluşumuna yol açar. İyi huylu bir adenomun 12, 17, 18 numaralı kromozomlarındaki genlerin müteakip mutasyonları, kötü huylu bir tümöre dönüşmeye yol açabilir. Kaynak: .

Kalkınmanın olduğu açıktır belirli türler kanserler bu genlerin çoğunda veya hatta tamamında değişiklikler içerir ve ilerleyebilir çeşitli şekillerde. Buradan her tümörün biyolojik olarak benzersiz bir nesne olarak değerlendirilmesi gerektiği sonucu çıkmaktadır. Bugün, 20 tip tümörle ilgili 8207 doku örneğinden alınan 1,2 milyon mutasyona ilişkin verileri içeren kansere ilişkin özel genetik bilgi veritabanları bulunmaktadır: Kanser Genom Atlası ve Kanserde Kanserde Somatik Mutasyonlar Kataloğu (COSMIC)).

Genlerdeki bir arızanın sonucu kontrolsüz hücre bölünmesidir ve sonraki aşamalarda metastazdır. çeşitli organlar ve vücudun bazı kısımları kan damarları tarafından ve lenf damarları. Bu, birkaç aşamadan oluşan oldukça karmaşık ve aktif bir süreçtir. Ayırmak kanser hücreleri birincil odak noktasından ayrılır ve kan yoluyla tüm vücuda yayılır. Daha sonra, özel reseptörler kullanarak endotel hücrelerine bağlanırlar ve matris proteinlerini parçalayan ve bazal membranda gözenekler oluşturan proteinazları eksprese ederler. Hücre dışı matrisi yok eden kanser hücreleri, sağlıklı dokuların derinliklerine göç eder. Otokrin uyarım nedeniyle bir düğüm (1-2 mm çapında) oluşturacak şekilde bölünürler. Beslenme eksikliği ile düğümdeki hücrelerin bir kısmı ölür ve bu tür "uykuda" mikrometastazlar organ dokularında oldukça uzun süre gizli kalabilir. İÇİNDE uygun koşullar düğüm büyür, hücrelerde vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve fibroblast büyüme faktörü (FGFb) geni aktive edilir ve anjiyogenez başlatılır (oluşum kan damarları) (İncir. 2).

Ancak hücreler, tümörlerin gelişimine karşı koruma sağlayan özel mekanizmalarla donatılmıştır:

Geleneksel yöntemler ve dezavantajları

Eğer vücudun savunma sistemleri çöker ve buna rağmen tümör gelişmeye başlarsa, onu ancak tıbbi müdahale kurtarabilir. İçin uzun dönem Doktorlar üç ana “klasik” tedaviyi kullanır:

• cerrahi ( tamamen kaldırma tümörler). Tümör küçük ve iyi lokalize olduğunda kullanılır. Ayrıca temas eden dokulardan bazılarını da çıkarın. malign neoplazm. Yöntem metastaz varlığında kullanılmaz;
• radyasyon - kanser hücrelerinin bölünmesini durdurmak ve önlemek için tümörün radyoaktif parçacıklarla ışınlanması. Sağlıklı hücreler de bu radyasyona karşı hassastır ve sıklıkla ölürler;
• kemoterapi - ilaçlar hızla bölünen hücrelerin büyümesini engellemek için kullanılır. İlaçlar veriliyor olumsuz etki ve normal hücrelerde.

Yukarıda açıklanan yaklaşımlar her zaman hastayı kanserden kurtaramaz. Çoğu zaman ne zaman cerrahi tedavi tek kanser hücresi kalır ve tümör tekrarlayabilir ve kemoterapi ve radyasyon terapisi ile yan etkiler ortaya çıkar (bağışıklık azalması, anemi, saç dökülmesi vb.), bu da aşağıdakilere yol açar: ciddi sonuçlar ve sıklıkla hastanın ölümüne kadar. Ancak her yıl geleneksel tedaviler gelişiyor ve biyolojik tedavi gibi kanseri yenebilecek yeni tedaviler ortaya çıkıyor. hormon tedavisi, kök hücrelerin kullanımı, kemik iliği nakli ve çeşitli destekleyici tedaviler. Gen terapisi, kanserin temel nedenini (belirli genlerdeki arızaların telafisi) hedeflediği için en umut verici yöntem olarak kabul ediliyor.

Bir olasılık olarak gen terapisi

PubMed'e göre ilgi gen tedavisi(GT) kanser hastalıkları hızla büyüyor ve bugün GT, vücuttaki kanser hücreleri üzerinde çalışan bir dizi tekniği birleştiriyor ( in vivo) ve onun dışında ( ex vivo) (Şek. 3).

Şekil 3. İki ana gen terapisi stratejisi. Ex vivo- genetik materyal, vektörler kullanılarak kültürde yetiştirilen hücrelere aktarılır (transdüksiyon) ve ardından transgenik hücreler alıcıya verilir; in vivo- İstenilen gene sahip bir vektörün belirli bir doku veya organa yerleştirilmesi. Resim:

Gen tedavisi in vivo gen transferini içerir - genetik yapıların kanser hücrelerine veya tümörü çevreleyen dokulara yerleştirilmesi. Gen tedavisi ex vivo bir hastadan kanser hücrelerinin izole edilmesi ve tedavi edici "sağlıklı" bir genin hastaya yerleştirilmesinden oluşur. kanser genomu ve dönüştürülmüş hücrelerin hastanın vücuduna geri verilmesi. Bu amaçlar için yöntemlerle oluşturulan özel vektörler kullanılır. genetik mühendisliği. Kural olarak bunlar, vücudun sağlıklı dokularına veya viral olmayan vektörlere zararsız kalarak kanser hücrelerini tanımlayıp yok eden virüslerdir.

Viral vektörler

Retrovirüsler, adenovirüsler, adeno-ilişkili virüsler, lentivirüsler, herpes virüsleri ve diğerleri viral vektörler olarak kullanılır. Bu virüsler transdüksiyon verimlilikleri, hücrelerle etkileşimleri (tanıma ve enfeksiyon) ve DNA bakımından farklılık gösterir. Ana kriter güvenlik ve viral DNA'nın kontrolsüz yayılma riskinin olmamasıdır: eğer genler insan genomunda yanlış yere yerleştirilirse, zararlı mutasyonlar yaratabilir ve bir tümör gelişimini başlatabilirler. Enflamasyonu önlemek için transfer edilen genlerin ekspresyon düzeyinin dikkate alınması da önemlidir. bağışıklık reaksiyonları hedef proteinlerin hipersentezi sırasında organizma (Tablo 1).

Viral olmayan vektörler

Transgenik DNA'yı aktarmak için viral olmayan vektörler de kullanılır. Polimer taşıyıcılar ilaçlar- nanopartiküllerden yapılan tasarımlar - örneğin oligonükleotidler, peptitler, siRNA gibi düşük moleküler ağırlığa sahip ilaçların dağıtımı için kullanılır. Sayesinde küçük boyutlar Nanopartiküller hücreler tarafından emilir ve kılcal damarlara nüfuz edebilir, bu da "tıbbi" moleküllerin vücudun en erişilemeyen yerlerine iletilmesi için çok uygundur. Bu teknik Genellikle tümör anjiyogenezini inhibe etmek için kullanılır. Ancak kemik iliği gibi diğer organlarda parçacıkların birikerek öngörülemeyen sonuçlara yol açma riski vardır. En popüler viral olmayan DNA dağıtım yöntemleri lipozomlar ve elektroporasyondur.

Sentetik katyonik lipozomlarşu anda fonksiyonel genlerin sağlanması için umut verici bir yöntem olarak kabul edilmektedir. Parçacıkların yüzeyindeki pozitif yük, negatif yüklü olanlarla füzyonu sağlar hücre zarları. Katyonik lipozomlar, DNA zincirinin negatif yükünü nötralize eder, uzaysal yapısını daha kompakt hale getirir ve etkili yoğunlaşmayı destekler. Plazmid-lipozom kompleksinin bir takım önemli avantajları vardır: neredeyse sınırsız boyuttaki genetik yapıları barındırabilir, replikasyon veya rekombinasyon riski yoktur ve pratik olarak konakçının vücudunda bir bağışıklık tepkisine neden olmaz. Bu sistemin dezavantajı kısa süreli olmasıdır. tedavi edici etki ve tekrarlanan uygulamalarda yan etkiler ortaya çıkabilir.

Elektroporasyon oldukça basit olan ve bir bağışıklık tepkisi oluşturmayan, viral olmayan DNA aktarımının popüler bir yöntemidir. İndüklenmiş yardımıyla elektrik darbeleri Hücrelerin yüzeyinde gözenekler oluşur ve plazmid DNA hücre içi boşluğa kolayca nüfuz eder. Gen tedavisi in vivo Elektroporasyonun kullanılması, fare tümörleri üzerinde yapılan bir dizi deneyde etkinliğini kanıtlamıştır. Bu durumda, herhangi bir gen, örneğin sitokin genleri (IL-12) ve sitotoksik genler (TRAIL) aktarılabilir ve bu, çok çeşitli terapötik stratejilerin geliştirilmesine katkıda bulunur. Ek olarak bu yaklaşım hem metastatik hem de primer tümörlerin tedavisinde etkili olabilir.

Ekipman seçimi

Tümörün türüne ve ilerlemesine göre hasta için en etkili tedavi yöntemi seçilir. Bugüne kadar, onkolitik viral HT, ön ilaç HT (ön ilaç tedavisi), immünoterapi, kök hücrelerin kullanıldığı HT dahil olmak üzere kansere karşı umut verici yeni gen terapisi teknikleri geliştirildi.

Onkolitik viral gen terapisi

Bu teknik, özel genetik manipülasyonların yardımıyla onkolitik hale gelen virüsleri kullanır; sağlıklı hücrelerde üremeyi bırakır ve yalnızca tümör hücrelerini etkiler. İyi bir örnek Bu terapi, E1B proteinini eksprese etmeyen modifiye edilmiş bir adenovirüs olan ONYX-015'tir. Bu proteinin yokluğunda virüs normal p53 genine sahip hücrelerde çoğalamaz. Herpes simpleks virüsüne (HSV-1) dayanan iki vektör - G207 ve NV1020 - aynı zamanda yalnızca kanser hücrelerinde çoğalmak üzere çeşitli genlerde mutasyonlar taşır. Tekniğin en büyük avantajı, gerçekleştirirken intravenöz enjeksiyonlar Onkolitik virüsler kanla vücudun her yerine taşınır ve metastazlarla savaşabilir. Virüslerle çalışırken ortaya çıkan ana sorunlar olası risk alıcının vücudunda bir bağışıklık tepkisinin ortaya çıkması, ayrıca genetik yapıların sağlıklı hücrelerin genomuna kontrolsüz entegrasyonu ve bunun sonucunda kanserli bir tümörün ortaya çıkması.

Gen aracılı enzim ön ilaç tedavisi

Bu, kanser hücrelerinin ölmesine neden olan "intihar" genlerinin tümör dokusuna dahil edilmesine dayanmaktadır. Bu transgenler, hücre içi sitostatikleri, TNF reseptörlerini ve apoptozun aktivasyonu için diğer önemli bileşenleri aktive eden enzimleri kodlar. Ön ilaç genlerinin intihara yönelik kombinasyonu ideal olarak eşleşmelidir aşağıdaki gereksinimler: kontrollü gen ifadesi; seçilen ön ilacın aktif bir antikanser ajanına doğru şekilde dönüştürülmesi; ek endojen enzimler olmadan ön ilacın tamamen aktivasyonu.

Tedavinin dezavantajı tümörlerin hepsini içermesidir. savunma mekanizmaları, karakteristik sağlıklı hücreler ve yavaş yavaş zarar veren faktörlere ve ön ilaçlara uyum sağlarlar. Adaptasyon süreci sitokinlerin ekspresyonu (otokrin düzenleme), düzenleyici faktörler ile kolaylaştırılır. Hücre döngüsü(en dirençli kanser klonlarının seçimi), MDR geni (belirli ilaçlara duyarlılıktan sorumludur).

İmmünoterapi

Gen terapisi sayesinde Son zamanlardaİmmünoterapi aktif olarak gelişmeye başladı - yeni yaklaşım antitümör aşıları kullanarak kanserin tedavisi için. Yöntemin ana stratejisi aktif bağışıklama Gen transfer teknolojisini kullanarak kanser antijenlerine karşı vücut (TAA) [?18].

Rekombinant aşıların diğer ilaçlardan temel farkı, hastanın bağışıklık sisteminin kanser hücrelerini tanımasına ve yok etmesine yardımcı olmasıdır. İlk aşamada kanser hücreleri alıcının vücudundan (otolog hücreler) veya özel hücre hatlarından (allogeneik hücreler) elde edilir ve daha sonra in vitro olarak büyütülür. Bu hücrelerin bağışıklık sistemi tarafından tanınması için, bağışıklık sistemini uyarıcı moleküller (sitokinler) veya antijen sayısı artan proteinler üreten bir veya daha fazla gen eklenir. Bu modifikasyonlardan sonra hücrelerin kültürlenmesine devam edilir, ardından parçalanır ve bitmiş aşı elde edilir.

Transgenlere yönelik çok çeşitli viral ve viral olmayan vektörler, farklı şekiller bağışıklık hücreleri (örneğin sitotoksik T hücreleri ve dentritik hücreler) bağışıklık tepkisini ve kanser hücrelerinin gerilemesini engellemek için. 1990'larda tümöre infiltre eden lenfositlerin (TIL'ler), kanser hücreleri için sitotoksik T lenfositlerin (CTL'ler) ve doğal öldürücü (NK) hücrelerin kaynağı olduğu öne sürüldü. TIL kolayca manipüle edilebildiğinden ex vivo genetiği değiştirilmiş ilk insanlar oldular bağışıklık hücreleri antikanser immünoterapisi için kullanılmıştır. Bir kanser hastasının kanından alınan T hücrelerinde, kanser antijenlerine yönelik reseptörlerin ifadesinden sorumlu olan genler değiştirilir. Modifiye edilmiş T hücrelerinin hayatta kalma ve tümöre daha verimli bir şekilde girme olasılığını artırmak için genler de eklenebilir. Bu tür manipülasyonların yardımıyla kanser hücrelerinin oldukça aktif "öldürücüleri" yaratılır.

Çoğu kanserin spesifik antijenlere sahip olduğu ve kendi savunma mekanizmalarını tetikleyebildiği kanıtlandığında, engellemenin etkili olduğu varsayıldı. bağışıklık sistemi kanser hücreleri tümörün reddedilmesini kolaylaştıracaktır. Bu nedenle çoğu antitümör aşısının üretiminde antijen kaynağı olarak hasta tümör hücreleri veya özel allojenik hücreler kullanılır. Tümör immünoterapisinin temel sorunları, hastanın vücudunda otoimmün reaksiyonların olasılığı, antitümör yanıtının olmaması, tümör büyümesinin immünostimülasyonu ve diğerleridir.

Kök hücreler

Gen terapisi için güçlü bir araç, kök hücrelerin, terapötik ajanların (immün sistemi uyarıcı sitokinler, intihar genleri, nanopartiküller ve antianjiyogenik proteinler) aktarımı için vektörler olarak kullanılmasıdır. Kök hücreler (SK), kendini yenileme ve farklılaşma özelliklerinin yanı sıra diğerlerine göre büyük bir avantaja sahiptir. taşıma sistemleri(nanopolimerler, virüsler): ön ilacın aktivasyonu doğrudan tümör dokularında meydana gelir, bu da sistemik toksisiteyi önler (transgenlerin ekspresyonu yalnızca kanser hücrelerinin yok edilmesine katkıda bulunur). Ek bir olumlu kalite, otolog SC'lerin "ayrıcalıklı" durumudur - kullanılan kendi hücreleri %100 uyumluluğu garanti eder ve prosedürün güvenlik düzeyini artırır. Ancak yine de tedavinin etkinliği doğru tedaviye bağlıdır. ex vivo değiştirilmiş genin SC'ye aktarılması ve ardından dönüştürülmüş hücrelerin hastanın vücuduna aktarılması. Ayrıca, terapiyi geniş çapta kullanmadan önce, tümünü ayrıntılı olarak incelemek gerekir. olası yollar SC'nin kanser hücrelerine dönüşümü ve SC'nin kanserojen dönüşümünü önlemek için güvenlik önlemleri geliştirilmesi.

Çözüm

Özetlemek gerekirse, her kanser hastasının tedavisi için spesifik bir ilacın seçileceği, kişiselleştirilmiş tıp çağının geldiğini güvenle söyleyebiliriz. etkili terapi. Zaten geliştiriliyor bireysel programlar tedavilerin zamanında ve zamanında yapılmasını sağlayan uygun bakım ve hastaların durumunda önemli bir iyileşmeye yol açar. Kişiselleştirilmiş onkolojiye yönelik genomik analiz, hedefe yönelik ilaçların üretimi, kanser gen terapisi ve moleküler teşhis biyobelirteçlerin kullanılması zaten meyve veriyor.

Özellikle umut verici yöntem Kanserin tedavisi gen terapisidir. Açık şu an Standart olduğu durumlarda HT'nin etkinliğini sıklıkla doğrulayan klinik araştırmalar aktif olarak yürütülmektedir. antikanser tedavisi- ameliyat, radyasyon tedavisi ve kemoterapi yardımcı olmuyor. Yenilikçi HT yöntemlerinin (immünoterapi, onkolitik viroterapi, "intihar" tedavisi vb.) geliştirilmesi, kanserden yüksek ölüm oranı sorununu çözebilecek ve belki de gelecekte "kanser" tanısı konulamayacaktır. kulağa idam cezası gibi geliyor.

Kanser: hastalığı tanır, önler ve ortadan kaldırır.

Edebiyat

1. Williams S. Klug, Michael R. Cummingm. Biyoloji ve tıp dünyası. Genetiğin temelleri. Moskova: Tekhnosfer, 2007. - 726 s.;
2. Biyoinformatik: Büyük Veritabanları ve Büyük P;
3. Cui H., Cruz-Correa M. ve ark. (2003).

100 rupi ilk siparişe bonus

Çalışma türünü seçin Tez Ders çalışmasıÖzet Yüksek Lisans Tezi Uygulama Raporu Makale Raporu İncelemesi Ölçek Monografi Problem çözme İş planı Soru cevapları Yaratıcı çalışma Deneme Çizim Denemeler Çeviri Sunumlar Yazma Diğer Metnin benzersizliğini arttırma Yüksek lisans tezi Laboratuvar işiÇevrimiçi yardım

Fiyatı öğren

Retroviral vektörler

200'den fazla hastayı kapsayan klinik çalışmalardan elde edilen deneyimler, replikasyon kusurlu retroviral vektörlerin herhangi bir olumsuz etkiye neden olmadığını göstermektedir. yan etkiler. Bununla birlikte, kullanımlarının güvenliği dikkate alınmaya devam etmektedir büyük önem. Retroviral genleri içeren plazmavirüs adı verilen bir yapı oluşturuldu şaka Ve poh 5"-LTR-npoMOTopa'nın yanı sıra bir "terapötik" gen ve bir genin kontrolü altında ortam, sitomegalovirüs promoteri tarafından yönlendirilir. Transfeksiyondan sonra plazmavirüs, replikasyon kusurlu viral partiküllerin oluşumunu tetikler ve rekombinasyonun replikasyon yetenekli retrovirüsler oluşturma olasılığı çok düşüktür. Vektör 3,5 kb'den fazla taşıyamaz. DNA'nın yanı sıra potansiyel "terapötik" cDNA'ların ve tümör baskılayıcı genlerin çoğunun uzunluğu 0,5-2 kb'dir.

Retroviral vektör sisteminde ek iyileştirmeler yapılmıştır: ortaya çıkan viral parçacıkların sayısı arttırılmış, transdüksiyonun etkinliği arttırılmış, bunların bölünmeyen hücrelere nüfuz etmesini sağlamak için genetik mühendisliği modifikasyonları gerçekleştirilmiştir ve enfeksiyon arttı. İÇİNDE ikinci durum rekombinant retroviral vektörün genomu, proteini retrovirüsün bağlanma spesifikliğini ve enfekte ettiği hücre aralığını belirleyen başka bir virüsün kabuğuna paketlenir. Bu olaya fenotipik karışım denir (psödotip oluşumu). Fenotipik olarak karışık virüs, birlikte transfeksiyonla üretilir hücre çizgisi Gen ürünlerini sentezleyen şaka Ve pol rekombinant retroviral vektör ve gen ekspresyon vektörü çevre başka bir virüs. Bir geni değiştirerek ortam, Virüsün bulaştığı hücrelerin spektrumunu kesin olarak tanımlanmış bir türe kadar daraltabilir veya genişletebilirsiniz. Ayrıca gende çevre retrovirüs, belirli bir hücresel reseptöre bağlanan bir peptidi kodlayan bir nükleotid sekansı ekleyebilir ve rekombinant bir retrovirüsün hücreye girişini sağlar. gerekli hücreler. Son olarak terapötik gen ekspresyonunun özgüllüğü, hücreye özgü bir promoterin kontrolü altında elde edilebilir.

Adenoviral vektörler

Adenovirüsler bölünmeyen insan hücrelerini enfekte eder ve virüsü önleyen canlı aşılar olarak yaygın şekilde kullanılır. solunum yolu enfeksiyonları ve gastroenterit sağlanmadan yan etki. Bu özellikler, adenovirüslerin genleri hedef hücrelere iletme konusunda umut verici olmasını sağlar.

Bir adenoviral vektör elde etmek için, E1 adenoviral gen ürünlerini sentezleyen bir hücre çizgisi, adenovirüs genomunun iki bölümü ile birlikte transfekte edildi (Şekil 21.7). Bunlardan biri bir gtasmid olarak mevcut olabilir. E. coli ve E1 bölgesi yerine, adenovirüsün nükleotid dizileri ile çevrili bir "terapötik" gen içerir ve ikincisi, El bölgesini de içeren 5"-terminal bölgesinden yoksun olan ve onunla örtüşen bir bölgeye sahip olan bir adenovirüs DNA molekülüdür. terapötik geni taşıyan plazmid, örtüşme alanındaki iki transfekte edici DNA fragmanı arasındaki rekombinasyon, E1 geni yerine terapötik genin bulunduğu tam uzunluktaki adenoviral genin restorasyonuna yol açar. Konakçı hücre tarafından sağlanan ürünler, lizis sonucu hücreden salınan viral partiküllerin oluşumunu başlatır. Rekombinasyon olmadığında, yetersiz uzunluktaki transfekte edici DNA, viral partiküller halinde paketlenemez. Konakçı hücre genomundaki E1 bölgesi ile rekombinant bir adenovirüsün DNA'sı arasında replikasyon yetkinliğine sahip virüsler oluşturma oranı son derece düşüktür.

Bir rekombinant adenovirüs hedef hücreyi enfekte ettikten sonra, DNA'sı "terapötik" genin ifade edildiği çekirdeğe girer. Rekombinant DNA kromozoma entegre olmaz ve kısa süre kalır, bu nedenle adenoviral vektörler kullanılarak gen tedavisi yapılırken bunların belirli aralıklarla uygulanması gerekir.

Adenoviral vektörler kullanılmıştır klinik denemeler Kistik fibrozis için gen terapisi üzerine.

Hayvan virüslerine (retrovirüsler, polyomavirüsler) dayalı vektörler ve bunların gen terapisinde kullanımı.

Retroviral vektörler

200'den fazla hastayı kapsayan klinik çalışmalardan elde edilen deneyimler, replikasyon kusurlu retroviral vektörlerin herhangi bir olumsuz yan etkiye neden olmadığını göstermektedir. Bununla birlikte, kullanımlarının güvenliğine büyük önem verilmeye devam edilmektedir. Retroviral genleri içeren plazmavirüs adı verilen bir yapı oluşturuldu şaka Ve poh 5"-LTR-npoMOTopa'nın yanı sıra bir "terapötik" gen ve bir genin kontrolü altında ortam, sitomegalovirüs promoteri tarafından yönlendirilir. Transfeksiyondan sonra plazmavirüs, replikasyon kusurlu viral partiküllerin oluşumunu tetikler ve rekombinasyonun replikasyon yetenekli retrovirüsler oluşturma olasılığı çok düşüktür. Vektör 3,5 kb'den fazla taşıyamaz. DNA'nın yanı sıra potansiyel "terapötik" cDNA'ların ve tümör baskılayıcı genlerin çoğunun uzunluğu da 0,5-2 kb'dir.

Retroviral vektör sisteminde ek iyileştirmeler yapılmıştır: ortaya çıkan viral parçacıkların sayısı arttırılmış, transdüksiyonun etkinliği arttırılmış, bunların bölünmeyen hücrelere nüfuz etmesini sağlamak için genetik mühendisliği modifikasyonları gerçekleştirilmiştir ve enfeksiyon arttı. İkinci durumda, rekombinant retroviral vektörün genomu, proteini retrovirüsün bağlanma spesifikliğini ve enfekte ettiği hücre aralığını belirleyen başka bir virüsün kabuğuna paketlenir. Bu olaya fenotipik karışım denir (psödotip oluşumu). Fenotipik olarak karıştırılmış bir virüs, gen ürünlerini sentezleyen bir hücre hattının birlikte transfeksiyonuyla üretilir. şaka Ve pol rekombinant retroviral vektör ve gen ekspresyon vektörü çevre başka bir virüs. Bir geni değiştirerek ortam, Virüsün bulaştığı hücrelerin spektrumunu kesin olarak tanımlanmış bir türe kadar daraltabilir veya genişletebilirsiniz. Ayrıca gende çevre retrovirüs, belirli bir hücresel reseptöre bağlanan bir peptidi kodlayan bir nükleotid dizisini ekleyebilir ve rekombinant retrovirüsün istenen hücrelere girmesini sağlayabilirsiniz. Son olarak terapötik gen ekspresyonunun özgüllüğü, hücreye özgü bir promoterin kontrolü altında elde edilebilir.

Adenoviral vektörler

Adenovirüsler bölünmeyen insan hücrelerini enfekte eder ve yan etkilere neden olmadan solunum yolu enfeksiyonlarını ve gastroenteriti önleyen canlı aşılar olarak yaygın şekilde kullanılır. Bu özellikler, adenovirüslerin genleri hedef hücrelere iletme konusunda umut verici olmasını sağlar.

Bir adenoviral vektör elde etmek için, E1 adenoviral gen ürünlerini sentezleyen bir hücre çizgisi, adenovirüs genomunun iki bölümü ile birlikte transfekte edildi (Şekil 21.7). Bunlardan biri bir gtasmid olarak mevcut olabilir. E. coli ve E1 bölgesi yerine, adenovirüsün nükleotid dizileri ile çevrili bir "terapötik" gen içerir ve ikincisi, El bölgesini de içeren 5"-terminal bölgesinden yoksun olan ve onunla örtüşen bir bölgeye sahip olan bir adenovirüs DNA molekülüdür. terapötik geni taşıyan plazmid, örtüşme alanındaki iki transfekte edici DNA fragmanı arasındaki rekombinasyon, E1 geni yerine terapötik genin bulunduğu tam uzunluktaki adenoviral genin restorasyonuna yol açar. Konakçı hücre tarafından sağlanan ürünler, lizis sonucu hücreden salınan viral partiküllerin oluşumunu başlatır. Rekombinasyon olmadığında, yetersiz uzunluktaki transfekte edici DNA, viral partiküller halinde paketlenemez. Konakçı hücre genomundaki E1 bölgesi ile rekombinant bir adenovirüsün DNA'sı arasında replikasyon yetkinliğine sahip virüsler oluşturma oranı son derece düşüktür.

Bir rekombinant adenovirüs hedef hücreyi enfekte ettikten sonra, DNA'sı "terapötik" genin ifade edildiği çekirdeğe girer. Rekombinant DNA kromozoma entegre olmaz ve kısa süre kalır, bu nedenle adenoviral vektörler kullanılarak gen tedavisi yapılırken bunların belirli aralıklarla tanıtılması gerekir.

Adenoviral vektörler kistik fibrozis için gen terapisine yönelik klinik deneylerde kullanılmıştır.

Ökaryotlarda (hayvanlarda) nükleer plazmid bulunmadığından, vektörlerin transferi için tek "bağışçılar" virüsler olabilir. Hayvan virüslerinin kullanımı kötüdür çünkü:

1. Genomlarında klonlanmış DNA ile değiştirilebilecek, gerekli olmayan hiçbir bölge yoktur. => Bu tür virüslere dayanarak oluşturulan vektörler kusurludur.

2. Viral vektörlerin kapasitesi sınırlıdır, çünkü kapside yalnızca belirli miktarda DNA paketlenebilir (ve ökaryotik genler çok büyüktür, 30 veya daha fazla nükleotid çifti vardır).

SV-40 virüsü.

Maymun hücrelerinde gelişir. Onkotransformasyon etkisi olduğundan ve genlerin yapısını bozabildiğinden, klonlanmış genleri hücresel kromozomlara entegre etmek için nadiren kullanılır. Bu tür vektörler kullanılarak ifade gözlemlenebilir.

Vaccinia virüsü.

Eşsiz bir yapıya sahip çift sarmallı DNA'ya sahiptir. Her iki ucunda da DNA iplikçiklerini kovalent olarak kapatan saç tokaları bulunan doğrusal bir moleküldür. Bir vektör olarak çekici çünkü:

1. geniş aralık Konak hücre. Omurgasızlardan omurgalılara.

2. Büyük yabancı DNA parçalarının (25 kb'ye kadar) girişine izin verir, virüsün kendisi 187 kb'lik bir genoma sahiptir.

3. Kullanımı güvenlidir.

Çeşitli patojenik virüslerin (mikroplar) protein-antijenlerini kodlayan genlerin genomuna yerleştirildiği rekombinant virüsler oluşturmak ve böylece bulaşıcı hastalıklara karşı bağışıklık oluşturmak için kullanılırlar.

Retrovirüsler.

Tek sarmallı RNA'ya sahiptirler. Onların yaşam döngüsü mutlaka çift sarmallı DNA oluşumundan geçer. Avantajları:

1. Son derece geniş bir ana bilgisayar yelpazesi.

2. Entegre DNA'nın yapısı, içine klonlanan genin yeniden düzenlenme olasılığını dışlar.

3. Hücreler ölmez, ancak birçok nesil boyunca virüs üretir.

Ayrıca kullanılır:

Adenovirüsler;

Baculovirüsler (böcekleri enfekte eder).

Bakteriyofaj λ'ya dayalı vektörler

Faj λ'ya dayalı vektörler 1974'te ortaya çıktı. Faj λ DNA'sı çift sarmallı, doğrusaldır ve boyutu 48.502 bp'dir. Uçlar tek sarmallı GC uçlara sahiptir, 12 nt uzunluğundadır

Faj vektörleri genellikle çift sarmallı doğrusal bir DNA molekülü içeren ılıman bakteriyofaj λ temel alınarak oluşturulur. Fajın sol ve sağ kolları litik döngü (kopyalama, üreme) için gerekli tüm genlere sahiptir. Bakteriyofaj λ genomunun orta kısmı (lizojeni kontrol eden genleri, yani bakteri hücresinin DNA'sına entegrasyonunu içerir) üremesi için gerekli değildir ve yaklaşık 25 bin baz çiftidir. Bu kısım yabancı bir DNA fragmanı ile değiştirilebilir. Bu tür değiştirilmiş fajlar bir litik döngüden geçer, ancak lizojeni oluşmaz. Bakteriyofaj λ'ya dayanan vektörler, DNA fragmanlarını klonlamak için kullanılır.

Faj M13, dairesel bir ssDNA genomuna sahip filamentli bir kolofajdır. Rekombinant DNA elde etmek için fajın replikatif bir formu kullanılır; bu, içine bir dizi kısıtlama enzimi için polilinker bölgeleri içeren lacZ geninin yerleştirildiği, 6400 bp boyutunda dairesel çift sarmallı bir DNA'dır. Rekombinant fajlar, bakteriyel çim parçalama bölgelerinden seçilir. Beyaz renk. M13 fajını temel alan vektörlerin kullanımının birçok olumlu yönü vardır. Böylece, bir klonlama, tek sarmallı DNA genomuna sahip iki tip faj üretir. Her faj türü, farklı yönlerde olabilen DNA yerleştirme iplikçiklerinden yalnızca birini içerir. Bu bağlamda, faj M13 kullanılarak klonlama, tek sarmallı DNA probları ve DNA dizilimi oluşturmak için uygundur.

7. Hayvan virüslerine dayalı vektörler

Memeli ekstrakromozomal ekspresyon vektörleri, memeli gen fonksiyonunu ve düzenlemesini incelemek için kullanılır. Ek olarak, bazı insan hastalıklarını tedavi etmek için tıbbi amaçlarla potansiyel olarak kullanılabilecek orijinal rekombinant proteinlerin üretilmesi için de kullanılabilirler. Halihazırda oluşturulmuş birçok memeli ifade vektörü vardır, ancak bunların hepsi benzer özelliklere sahiptir ve diğer ökaryotik ifade vektörlerine benzer. Klonlanmış ve seçilebilir işaretleyici genlerin destekleyicileri ve bunların transkripsiyon sonlandırma sinyalleri (poliadenilasyon sinyalleri; ökaryotik hücrelerden türetilmelidir; genellikle hayvan virüslerinin (örneğin, insan sitomegolovirüs, SV40 veya HSV) veya memeli genlerinin düzenleyici DNA dizilerini kullanır (örneğin, insan sitomegolovirüs, SV40 veya HSV) örneğin gen (3-aktin, metalotiyonein, timidin kinaz veya sığır büyüme hormonu). Güçlü promotörler ve etkili poliadenilasyon sinyalleri tercih edilir. E. coli'de bir memeli ekspresyon vektörünün seçimi ve amplifikasyonu için gerekli sekanslar, standart bir E. coli'den türetilir. coli klonlama vektörü (örneğin plazmid pBR322).

Seçici işaretleyici genler. Transfekte edilmiş memeli hücrelerini seçmek için neomisin fosfotransferazı kodlayan bakteriyel Neor geni sıklıkla kullanılır. Bu sistem, transfekte edilmemiş memeli hücrelerinde translasyonu engellemek için toksik bileşik genetiği (G-418) kullanır. Transfekte edilmiş hücrelerde G-418, neomisin fosfotransferaz tarafından fosforile edilir ve etkisiz hale getirilir. Sonuç olarak, yalnızca Neor gen ürününü sentezleyen hücreler hayatta kalır ve çoğalır.

Transfekte edilmiş memeli hücrelerinin seçilmesine yönelik başka bir sistem, dihidrofolat redüktaz (DHFR) enzimini kodlayan genin kullanımına dayanmaktadır. Bu sistem, kusurlu DHFR genine sahip hücreleri, yani fonksiyonel DHFR'nin sentezlenmediği hücreleri kullanır. DHFR hücrelerinin işleyen bir DHFR genine sahip bir memeli ekspresyon vektörüyle transfeksiyonundan sonra ortama metotreksat eklenir. Transfekte edilmemiş hücreler onun varlığında büyümez ve dihidrofolat redüktaz sentezleyen hücreler hayatta kalır. DHFR genine sahip hücrelerin ön seçiminden sonra ortamdaki metotreksat konsantrasyonu arttırılır ve sentezlenen vektörün çok sayıda kopyasına sahip hücreler Büyük miktarlar rekombinant protein.

Çeşitli proteinlere yönelik genler halihazırda memeli ekspresyon vektörlerine eklenmiştir ve konakçı hücrelerde eksprese edilmiştir. Bazen promotör ile klonlanmış gen arasına bir intron yerleştirildiğinde ürün verimi arttı. Bu olgunun mekanizması bilinmemektedir. Klonlanmış genin birincil transkriptinin, klonlanmış genin kodlama bölgesinin bir kısmının kesildiği gizli ekleme bölgeleri içermesi mümkündür ve ek bir intronun varlığında, buralarda birleştirme daha az olasıdır. Seçici bir işaretleyici genin ekspresyonu ile koordine edildiğinde klonlanmış genin yüksek düzeyde ekspresyonu elde edildi. Bunu yapmak için örneğin DHFR geni, klonlanmış gene yakın bir yere yerleştirildi, böylece her iki gen de aynı promoterin kontrolü altındaydı ve ortak bir poliadenilasyon sinyaline sahipti ve DHFR geninin iki yanında intron ekleme bölgeleri vardı. DHFR ve rekombinant protein, sırasıyla birincil transkriptten ve eklenmiş mRNA'dan çevrildi.

Bir memeli hücresinde iki klonlanmış genin ifadesi

Ticari olarak değerli bazı proteinler, aktif formlarında farklı polipeptit zincirlerinden oluşur. Örneğin, insan tiroid uyarıcı hormonu bir heterodimerdir ve hemoglobin, her biri iki kopya olan iki alt birimden oluşan bir tetramerdir (a2(32). Aktif bir multimerik protein elde etmek için, her birinin genini veya cDNA'sını klonlamayı deneyebilirsiniz. alt birimleri sentezler ve saflaştırır ve daha sonra bunları in vitro olarak karıştırır. Bununla birlikte, polipeptit zincirlerinin doğru katlanması in vitro olarak nadiren elde edildiğinden, bu şekilde yalnızca birkaç multimerik protein elde edilebilir, ancak dimeriklerin in vivo olarak birleştirilmesi. ve tetramerik proteinler çok verimli bir şekilde oluşur. Bu nedenle, iki farklı rekombinant proteinin bir kafeste sentezi için stratejiler geliştirilmiştir.

Bunu yapmak için, konakçı hücreler, her biri alt birimlerden birinin genini veya cDNA'sını ve farklı seçilebilir işaretleyici genleri taşıyan iki memeli ekspresyon vektörü ile eş zamanlı olarak transfekte edildi. Transfekte edilmiş hücreler çift seçime tabi tutuldu ve hayatta kalan hücreler her iki vektörü de taşıdı. Otantik dimerik ve tetramerik rekombinant proteinleri sentezlemek için ikili vektör sistemleri başarıyla kullanılmıştır. Ne yazık ki çift transfekte edilmiş hücreler sıklıkla iki vektörden birini kaybeder. Ayrıca her vektörün kopya sayısı her zaman aynı olmadığından bir alt birim diğerinden daha fazla miktarda sentezlenebilir ve nihai ürünün verimi düşebilir. Bu sorunların üstesinden gelmek için her iki klonlanmış geni de içeren vektörler oluşturuldu. Bazı durumlarda bağımsız promoterlerin ve poliadenilasyon sinyallerinin kontrolü altına yerleştirilmiştir. Rekombinant proteinlerin aynı miktarda sentezini garanti etmek için, klonlanmış genlerin dahili bir ribozom bağlanma bölgesi içeren bir DNA segmenti ile ayrıldığı iki sistronik vektörler adı verilen vektörler oluşturuldu. Bu tür bölgeler memeli virüslerinin genomlarında bulunmuştur; çeşitli proteinlerin polisistronik mRNA'dan eşzamanlı translasyonunu sağlarlar. Gen-iç ribozom bağlama bölgesi-gen yapısının transkripsiyonu, bir promoter ve bir poliadenilasyon sinyali tarafından düzenlenir. İki gen içeren bir transkript sentezlenir, çeviri mRNA'nın 5" ucundan ve iç bölgeden başlar.

Özetle, araştırma ve tıbbi amaçlar için özgün rekombinant proteinlerin üretilmesi söz konusu olduğunda memeli ekspresyon vektörleri, diğer ökaryotik ekspresyon sistemlerine yönelik vektörler kadar çok yönlü ve etkilidir. Bununla birlikte, modifiye memeli hücreleri kullanılarak rekombinant proteinlerin endüstriyel sentezi çok pahalıdır.