Porównawcza analiza jakościowa aminokwasów. Jakościowe reakcje na aminokwasy, peptydy, białka. Ilościowe oznaczanie aminokwasów
Metody oznaczania aminokwasów
Aminokwasy mają charakter biologiczny substancje czynne, grają duża rola w życiu ludzkiego ciała są szeroko stosowane jako leki. Niektóre z nich są niezbędne i dostają się do organizmu wraz z pożywieniem. Obecnie istnieje wiele metod ilościowego oznaczania aminokwasów w medycynie surowce roślinne, V leki i płyny biologiczne w produktach spożywczych.
Spośród różnorodnych metod ilościowego oznaczania aminokwasów w różnych obiektach można wyróżnić cztery główne grupy: chromatograficzne, spektrofotometryczne, miareczkowe i metody elektrochemiczne analiza.
Metody chromatograficzne
Dla ostatnie dziesięciolecia Znaczący postęp nastąpił w dziedzinie chromatografii gazowo-cieczowej aminokwasów. Zaproponowano metodę wykorzystującą kolumny mikropakowane, która pozwala na względne krótki czas oddzielić prawie całkowicie 17 biologicznie ważnych α-aminokwasów.
Opracowano metodę oznaczania aminokwasów metodą chromatografii gazowo-cieczowej w próbkach surowicy, osocza, moczu i płyn mózgowo-rdzeniowy, w oparciu o przygotowanie eterów 2,3,4,5,6-pentafluorobenzoiloizobutylowych, a następnie rozdzielenie na kolumnie polidimetylosiloksanowej w trybie programowania temperatury od 140°C do 250°C za pomocą detektora płomieniowo-jonizacyjnego. Czas rozdziału chromatograficznego wynosi 28 minut. W wyniku badań wyodrębniono 27 aminokwasów.
Pomimo różnorodności metod wysokosprawnej chromatografii cieczowej do analizy aminokwasów, najszybszą i najbardziej dostępną jest wersja z odwróconą fazą z detekcją spektrofotometryczną. W celu skutecznej separacji i detekcji aminokwasy przekształca się w pochodne hydrofobowe i pochłaniające światło, to znaczy przeprowadza się derywatyzację przedkolumnową. Jako odczynniki do derywatyzacji stosuje się aldehyd ortoftalowy, naftaleno-2,3-dikarboksyaldehyd i chloromrówczan 9-fluorenylometylowy.
Opracowano metodę ilościowego oznaczania L-cystyny, kwasu L-glutaminowego i glicyny w leku „Eltacin”, który wykazuje działanie przeciwutleniające w połączeniu z działaniem przeciwdławicowym. Kwas glutaminowy i glicynę oznaczono metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami po derywatyzacji przedkolumnowej z odczynnikiem aldehyd ortoftalowy/N-acetylo-L-cysteina. Zdaniem autorów derywatyzacja cysteiny jest trudna ze względu na niestabilność samego aminokwasu i powstałych pochodnych. Dlatego analizę cysteiny przeprowadzono metodą miareczkowania bromatometrycznego. Ustalono, że obecność w próbce znaczne ilości cysteina nie zakłóca oznaczania produktów derywatyzacji glicyny i kwasu glutaminowego za pomocą odczynnika ortoftalowego / N-acetylo-L-cysteiny. Metoda charakteryzuje się dużą powtarzalnością i dokładnością oznaczeń.
Stwierdzono możliwość zastosowania 4,7-fenantrolino-5,6-dionu (fanchinonu) jako fluorogennego odczynnika znakującego do przedkolumnowego tworzenia jego pochodnych na potrzeby rozdziału i analizy ilościowej aminokwasów metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej zbadane. Nie mając wewnętrznej fluorescencji, fanchinon reaguje z grupami aminowymi aminokwasów (w temperaturze 68 ° C przez 160 minut), tworząc iminochinole, których fluorescencję mierzy się przy długości fali 460 nm. Wyizolowane pochodne identyfikowano za pomocą widm Tm, IR, masowych i PMR. Wysokosprawną chromatografię cieczową przeprowadzono na chromatografie z detektorem fluorescencyjnym i kolumną z elucją gradientową mieszaninami: roztwór trietyloaminy – bufor fosforanowy (pH 3) – metanol. Jako wzorzec wewnętrzny zastosowano chinidynę. Ta metoda jest dość obiecujący w dużych laboratoriach i można go zaproponować do analizy aminokwasów w gotowych postaciach dawkowania.
Opracowano technikę wysokosprawnej chromatografii cieczowej z potencjometrycznym biosensorem do ilościowego oznaczania lizyny. Bioczujnik jest skonstruowany poprzez połączenie membrany zawierającej oksydazę lizyny z jonoselektywną elektrodą NH4+. Jony amonowe powstające podczas enzymatycznej degradacji lizyny wykrywane są potencjometrycznie. Opracowano chromatodensytometryczną, ekspresową metodę analizy tryptofanu w płynach hodowlanych. Chromatografię cienkowarstwową przeprowadzono na płytkach Sorbfil. Chromatografię prowadzono w układzie propanol-2 - 25% roztwór wodorotlenku amonu (7:3) przez 25 minut. Chromatogramy suszono w temp temperatura pokojowa i trzymano przez 15 minut w temperaturze 120°C. Do wykrywania plam na chromatogramach stosowano specyficzny odczynnik – 4-dimetyloaminobenzaldehyd, selektywny wobec pierścienia indolowego tryptofanu, w postaci 0,5% roztworu etanolu z dodatkiem 5% stężonego kwasu siarkowego. Po wywołaniu chromatogramy poprzez zanurzenie w kuwecie teflonowej ze świeżo przygotowanym roztworem 4-dimetyloaminobenzaldehydu, trzymano je przez 5-7 minut w temperaturze 110°C. Skanowanie plamek tryptofanu przeprowadzono przy długości fali 625 nm na komputerowym densytometrze wideo. Opracowana metoda, mimo wysoka dokładność definicje i działanie specyficzne dla tryptofanu.
Do analizy β-aminokwasów w płynach biologicznych, lekach i produktach spożywczych szeroko stosowane są metody elektroforezy kapilarnej, polegające na rozdzielaniu składników złożonej mieszaniny w kapilarze kwarcowej pod wpływem przyłożonego pola elektrycznego. Ponieważ aminokwasy mają charakter obojnaczy, można je rozdzielać za pomocą roztworów buforowych elektrolitów o odpowiedniej wartości pH, najczęściej stosuje się bufory separacyjne obojętne i zasadowe.
W celu zwiększenia specyficzności i czułości metody elektroforezy kapilarnej do analizy poszczególnych β-aminokwasów stosuje się ich wstępną derywatyzację, a następnie rozdział w kapilarze kwarcowej i spektrofotometryczne oznaczanie produktów reakcji. Zatem jako środki derywatyzujące stosuje się mrówczan 9-fluorenylometylu, chloromrówczan 9-(2-karbazolo)-etylu i barwnik cyjaninowy. Perspektywy tej metody wynikają z takich zalet, jak szybkość analizy, łatwość przygotowania próbki, niskie zużycie odczynników i prostota aparatury.
Aminokwasy można wykryć za pomocą reakcji barwnych: ninhydryny, ksantoproteiny, Foly, Milone, testu biuretowego itp. Reakcje te są niespecyficzne, ponieważ w oparciu o wykrywanie poszczególne fragmenty w strukturze aminokwasów, które można znaleźć także w innych związkach.
Reakcja ninhydrynowa, reakcja barwna stosowana do jakościowego i ilościowego oznaczania aminokwasów, iminokwasów i amin. Po podgrzaniu środowisko alkaliczne ninhydryną (dihydrat tricetohydryny, C 9 H b O 4) z substancjami posiadającymi pierwszorzędowe grupy aminowe (-NH 2), powstaje produkt o stabilnym intensywnym niebiesko-fioletowym kolorze z maksymalną absorpcją około 570 nm. Ponieważ absorpcja przy tej długości fali zależy liniowo od liczby wolnych grup aminowych, reakcja z ninhydryną posłużyła jako podstawa do ich ilościowego oznaczenia metodą kolorymetryczną lub spektrofotometryczną. Reakcja ta wykorzystywana jest także do oznaczania drugorzędowych grup aminowych (>NH) w iminokwasach – prolinie i hydroksyprolinie; w tym przypadku powstaje jasnożółty produkt. Czułość - do 0,01%. Nowoczesna automatyczna analiza aminokwasów polega na połączeniu rozdziału jonowymiennego aminokwasów z ich ilościowym oznaczeniem za pomocą reakcji ninhydrynowej. Przy rozdzielaniu mieszanin aminokwasów metodą chromatografii bibułowej możliwe jest oznaczenie każdego aminokwasu w ilości co najmniej 2-5 µg.
Intensywność koloru można wykorzystać do oceny ilości aminokwasów.
Ta reakcja jest dodatnia nie tylko z wolnymi aminokwasami, ale także z peptydami, białkami itp.
Reakcja ksantoproteinowa umożliwia wykrywanie aminokwasów aromatycznych (fenyloalaniny, tyrozyny, histydyny, tryptofanu), w oparciu o reakcję podstawienia elektrofilowego w jądrze aromatycznym (nitrowanie).
Po wystawieniu na działanie skoncentrowanego kwas azotowy na przykład tyrozyna daje produkt o żółtym kolorze.
Taka reakcja. Jest to reakcja na cysteinę i cystynę. Podczas hydrolizy alkalicznej „słabo związana siarka” w cysteinie i cystynie dość łatwo ulega odszczepieniu, w wyniku czego powstaje siarkowodór, który w reakcji z zasadą wytwarza siarczki sodu lub potasu. Po dodaniu octanu ołowiu(II) tworzy się szaro-czarny osad siarczku ołowiu(II).
Opis doświadczenia. Do probówki wlewa się 1 ml roztworu cystyny, dodaje się 0,5 ml 20% roztworu wodorotlenku sodu. Mieszaninę ogrzano do wrzenia, po czym dodano 0,5 ml roztworu octanu ołowiu(II). Obserwuje się szaro-czarny osad siarczku ołowiu (II):
Reakcja Zimmermana. Jest to reakcja na aminokwas glicynę.
Opis doświadczenia. Do 2 ml 0,1% roztworu glicyny, skorygowanego przez dodanie 10% roztworu zasady do pH = 8, dodać 0,5 ml roztwór wodny dialdehyd o-ftalowy. Mieszanina reakcyjna powoli zaczyna zmieniać kolor na jasnozielony. Po kilku minutach pojawia się zielony osad.
Reakcja na tryptofan. Tryptofan reagując w środowisku kwaśnym z aldehydami tworzy kolorowe produkty kondensacji. Przykładowo w przypadku kwasu glioksylowego (który jest domieszką stężonego kwasu octowego) reakcja przebiega według równania:
Reakcja tryptofanu z formaldehydem przebiega według podobnego schematu.
Reakcja Sakaguchiego. Ta reakcja na aminokwas argininę opiera się na oddziaływaniu argininy z α-naftolem w obecności środka utleniającego. Mechanizm jego działania nie został dotychczas w pełni wyjaśniony. Najwyraźniej reakcję prowadzi się zgodnie z następującym równaniem:
Ponieważ pochodne chinonoiminy (w w tym przypadku naftochinon), w którym wodór grupy iminowej –NH– jest zastąpiony rodnikiem alkilowym lub arylowym, zawsze mają barwę żółto-czerwoną, wówczas najwyraźniej pomarańczowo-czerwoną barwę roztworu podczas reakcji Sakaguchiego tłumaczy się pojawienie się pochodnej iminy naftochinonu. Nie można jednak wykluczyć możliwości powstania jeszcze bardziej złożonego związku w wyniku dalszego utleniania pozostałych grup NH reszty argininy i pierścienia benzenowego α-naftolu:
Opis doświadczenia. Do probówki wlewa się 2 ml 0,01% roztworu argininy, następnie dodaje się 2 ml 10% roztworu wodorotlenku sodu i kilka kropli 0,2%. roztwór alkoholuα-naftol. Zawartość probówki dobrze wymieszać, dodać 0,5 ml roztworu podbrominu i ponownie wymieszać. Natychmiast dodać 1 ml 40% roztworu mocznika, aby ustabilizować szybko rozwijającą się pomarańczowo-czerwoną barwę.
Reakcja biuretowa– stosowany jako reakcja barwna na białka. W środowisku zasadowym w obecności soli miedzi(II) dają fioletową barwę. Zabarwienie wynika z tworzenia się kompleksu miedzi(II) z powodu grupy peptydowej -CO-NH-, co jest charakterystyczne dla białek. Reakcja ta wzięła swoją nazwę od pochodnej mocznika – biuretu, który powstaje podczas ogrzewania mocznika z eliminacją amoniaku:
Oprócz białek i biuretu takie samo zabarwienie nadają inne związki zawierające - z tej grupy: amidy, imidy kwasy karboksylowe, a także związki zawierające w cząsteczce grupy -CS-NH- lub =CH-NH-. Reagują także białka, niektóre aminokwasy, peptydy, biuret i średnie peptony.
Kolor kompleksu otrzymanego w reakcji biuretowej z różnymi peptydami jest nieco inny i zależy od długości łańcucha peptydowego. Peptydy o długości łańcucha czterech reszt aminokwasowych i większej tworzą kompleks czerwony, tripeptydy - fioletowy, a dipeptydy - niebieski.
postać ketonowa polipeptydu
enolowa forma polipeptydu
Kiedy polipeptyd oddziałuje z Cu (OH) 2, tworzy się kompleks, którego strukturę można przedstawić w następujący sposób.
I białka
Wiadomo, że wszystkie 20 odmian kanonicznych α-aminokwasów ma tę samą strukturę, z trzema wariantami grup funkcyjnych (ryc. 3.3). Niestety reakcje na grupy aminowe i karboksylowe nie są zbyt specyficzne, ponieważ w związku z tym są charakterystyczne dla wszystkich amin, szeregu amidów i kwasów karboksylowych. To samo dotyczy większości ich rodników = R, z których 10 jest niepolarnych, to znaczy reprezentowanych przez grupy alifatyczne = węglowodorowe, z których większość jest chemicznie obojętna. Specyficzność większości aminokwasów polarnych R, które zawierają grupy alkoholowe (Ser, Tre, Tyr), amidowe (Asn, Gln) i karboksylowe (Asp, Glu), jest również stosunkowo niska. Grupa aminowa (Lys), imidazol His i grupa guanidynowa Arg są bardziej aktywne, a aktywność grupy tio Cys jest maksymalna. Dlatego największy znaczenie praktyczne w analizie jakościowej i ilościowej α-aminokwasów, w tym w analizatorach aminokwasów, uzyskano uniwersalną reakcję ninhydrynową, specyficzną dla jednoczesnej obecności zarówno grup aminowych, jak i karboksylowych przy atomie α-C.
Ryż. 3.3. Ogólne formuły struktury α-aminokwasów i produkty ich polimeryzacji. Wyjaśnienia w tekście.
Polimeryzacja α-aminokwasów w strukturę peptydów i białek (ryc. 3.3) zachowuje wszystkie ich typy R, ale:
1. Reakcja na ninhydrynę staje się ujemna, ponieważ z wyjątkiem N- i C-końcowych, grupy α-aminowe i α-karboksylowe są wykorzystywane do tworzenia wiązań peptydowych. Dodatnia reakcja ninhydryny z białkiem najprawdopodobniej wskazuje na obecność zanieczyszczeń aminokwasowych w preparacie lub pojemniku.
2. W przypadku wszystkich peptydów i białek reakcja biuretowa jest specyficzna dla grupy peptydowej nieobecnej w monomerycznych aminokwasach.
3. Spośród bardziej specyficznych reakcji na aminokwasy R przydatne są: reakcja ksantoproteiny ze stężonym kwasem azotowym do aromatycznych R Fen, Tyr, Tri; reakcja z izatyną na pięcioczłonowym pierścieniu Pro, a także reakcje z imidazolem R His, grupą tio Cys i grupą guanidyno Arg. Należy wziąć pod uwagę, że część z tych R jest ukryta w kuleczkach białkowych i dlatego reakcje jakościowe na nie są osłabione. Dlatego przed ich wykonaniem białka są zwykle poddawane denaturacji w taki czy inny sposób.
4. W przeciwieństwie do prawdziwych roztworów aminokwasów, roztwory koloidalne białka są charakterystyczne reakcje osadowe, związane z zniszczeniem ich otoczek hydratacyjnych i w efekcie zmniejszeniem ich rozpuszczalności pod wpływem środków odwadniających: sole obojętne = wysalanie, metanol = MeOH, etanol = EtOH, aceton, mocznik i inne środki.
Wykonując reakcje jakościowe, powinieneś:
1. Uważnie przestrzegaj zasad bezpieczeństwo przeciwpożarowe i pracować ze stężonymi kwasami i zasadami = EZh.
2. Zaznaczyć szklanym wykresem lub pisakiem 2 rzędy probówek i umieścić w jednej z nich nie więcej niż 0,5 ml (2-5 kropli) 1% roztworu aminokwasów i w przybliżeniu taką samą objętość 1 % roztwór białka w drugim.
3. Do pary probówek z roztworami aminokwasów i białek dodać równolegle 3-5 kropli odpowiednich odczynników i wykonać pozostałe procedury wskazane dla odpowiedniej reakcji.
4. Jeżeli konieczne jest podgrzanie probówek, należy zdjąć pokrywę tygla i zapalić suche paliwo zapałką. Następnie zaciśnij probówkę w uchwycie, którego prymitywna konstrukcja jest bardzo zawodna. Dlatego lepiej owinąć kilka probówek kawałkiem papieru złożonym w paski i przytrzymać je kciuk, przepuścić równomiernie dolne połówki probówek przez płomień, unikając celowania szyją w sąsiadów i powodowania gwałtownego wrzenia roztworu. Po zakończeniu operacji należy natychmiast zgasić płomień pokrywką tygla.
5. Sporządza się wyniki doświadczeń zgodnie ze wzorem w sprawie rozpowszechnienia zeszytu laboratoryjnego w formie tabeli:
6. Po zapoznaniu się z otrzymanymi wynikami i wypełnieniu protokołu wraz ze stojakiem z probówkami przedstawiamy je nauczycielowi do ochrony.
1. Reakcja z ninhydryną. Na podstawie deaminacji i dekarboksylacji α-aminokwasów alkoholowym roztworem ninhydryny:
Powstały amoniak reagując z dwiema cząsteczkami ninhydryny tworzy barwną pochodną o maksimum absorpcji przy 540 nm (dla Pro - 440 nm).
Postęp prac: Do badanych próbek dodać 3-5 kropli 0,5% roztworu ninhydryny w alkoholu. Delikatnie podgrzej probówki z mieszaninami na ogniu i po 2-3 minutach zanotuj pojawienie się koloru.
2. Reakcja ksantoproteinowa. Jak wspomniano powyżej, polega ona na tworzeniu nitropochodnych aminokwasów z aromatycznymi R: Fen, Tyr, Tri.
Postęp prac: Włączając ciąg wyciągu, ostrożnie dodaj kilka kropli stężonego kwasu azotowego (HNO 3) do pary probówek z roztworami testowymi. Delikatnie podgrzej probówki nad płomieniem, unikając kierowania szyjkami w stronę sąsiadów i zanotuj rozwój zabarwienia.
3. Reakcja nitroprusydku. Opiera się na zasadowej hydrolizie aminokwasu cysteiny zawierającej siarkę, z uwolnieniem siarczku sodu (Na 2 S), co daje czerwony kompleks ze świeżo przygotowanym roztworem nitroprusydku sodu.
Postęp prac: Do obu probówek dodać 5-10 kropli roztworów testowych równa objętość 20% sody kaustycznej i gotować przez co najmniej 3-5 minut. Dodaj do probówek 3-5 kropli roztworu nitroprusydku sodu i zanotuj zmianę zabarwienia.
4. Reakcja biuretowa. Polega na tworzeniu barwnego kompleksu wiązania peptydowego z jonem Cu 2+ w środowisku zasadowym. Służy jako uniwersalny test do identyfikacji peptydów i białek w roztworach. Ponieważ wraz ze wzrostem liczby wiązań peptydowych intensywność barwy roztworu rośnie liniowo, jest on szeroko stosowany do fotometrycznego oznaczania stężeń białek.
Postęp prac. Do probówek dodać taką samą ilość 10% roztworu wodorotlenku sodu z 5-10 kroplami roztworów testowych. Dobrze wymieszaj i dodaj 2 krople 1% roztworu siarczanu miedzi (CuSO4). Wymieszać próbki i po kilku minutach zarejestrować rozwój koloru.
5. Próba wrzenia. Opiera się na termicznej denaturacji białek.
Postęp prac. Obie probówki zakwaszamy roztworami testowymi zawierającymi nie więcej niż jedną kroplę 1% roztworu kwas octowy(AcOH) i ogrzać do wrzenia. Po gotowaniu roztworów przez 2-3 minuty zapisz wyniki i wyjaśnij mechanizm zjawiska.
6. Wytrącanie solami metali ciężkich(Meh) . Ich właściwości denaturujące opierają się na zdolności ciężkich kationów Me do reagowania z grupami funkcyjnymi R cząsteczki białka: tio-, amino-, karboksy-, aromatyczne. Ponadto ich silne aniony powodują ładowanie grup jonowych w cząsteczkach białek, niszcząc w ten sposób zawarte w nich wiązania jonowe.
Postęp prac. Do obu probówek z roztworami testowymi dodać kilka kropli 5% roztworu siarczanu miedzi (CuSO 4). Uzyskane wyniki zapisz i opisz.
7. Opady kwasami organicznymi. Opiera się na denaturacji kwasowej białek i tworzeniu kowalencyjnych pochodnych grup tio-, aminowych i aromatycznych aminokwasów R z chloroorganicznymi.
Postęp prac. Do probówek z roztworami testowymi dodać kilka kropli 10% roztworu kwasu trichlorooctowego (TCA) i po kilku minutach zapisać wyniki
Sprzęt i odczynnik: papier do chromatografii; komora chromatograficzna; kolorymetr fotoelektryczny; nożyczki; talerze szklane (3 x 32 cm) - 3 szt.; uchwyt chromatogramu; szafka susząca; mikropipety; probówki ze szlifowanymi korkami; biureta 25 ml; standardowa mieszanina aminokwasów; mieszanina testowa aminokwasów; butanol, kwas octowy, woda w stosunku 15:3:7; 1% roztwór ninhydryny w 95% acetonie; alkohol etylowy (75%), nasycony siarczanem miedzi.
Wykonanie pracy
Weź kartkę papieru chromatograficznego o wymiarach 18 x 28 cm i za pomocą prostego ołówka narysuj poziomą linię w odległości 3 cm od jej krótkiej krawędzi. Następnie dzieli się go na nierówne segmenty zgodnie z załączonym schematem i zaznacza strzałkami granice stosowania mieszaniny wzorcowej i testowej, a odpowiednie napisy wykonuje się prostym ołówkiem.
Papier wzmacnia się nad powierzchnią stołu i najpierw nanosi się mieszaninę wzorcową na linię startu ograniczoną strzałkami, za pomocą specjalnej mikropipety cienką linią, aż cały roztwór z mikropipety zostanie przeniesiony na linię startu (mikropipeta jest wypełnione do 2-3 cm). Masę naniesionego roztworu mierzy się poprzez zważenie pipety napełnionej mieszaniną wzorcową (przed nałożeniem roztworu) i pustej (po nałożeniu roztworu). Na papier nanosi się zwykle 0,02-0,03 g roztworu wzorcowego. Następnie napełnij czystą pipetę mieszaniną testową aminokwasów (wydaną przez prowadzącego zajęcia na zajęcia), zważ ją i nałóż mieszaninę na linię startu z odpowiednim oznaczeniem.
Przygotowany chromatogram umieszcza się w komorze chromatograficznej, do której wcześniej wlewa się układ rozpuszczalników w celu rozdzielenia mieszaniny aminokwasów, np. mieszaniny butanolu, kwasu octowego i wody w stosunku 15:3:7. Rozdzielanie przeprowadza się metodą chromatografii wstępującej, aż linia czołowa osiągnie odległość 2-3 cm od górnej krawędzi bibułki chromatograficznej (linia mety). Następnie chromatogram wyjmuje się z komory, a górny koniec bibuły natychmiast umieszcza się w uchwycie wykonanym z trzech szklanych prętów mocowanych gumowym pierścieniem i umieszcza pod wyciągiem na 20 minut w celu usunięcia rozpuszczalników z bibuły.
Ryż. 8. Schemat ułożenia aminokwasów na chromatogramie:
A - miejsce zastosowania mieszaniny aminokwasów; I - cystyna i cysteina;
2 - lizyna; 3 - histydyna; 4 - arginina; 5 - kwas asparaginowy,
seria i glicyna; 6 - kwas glutaminowy i treonina; 7 - alanina;
8 - prolina; 9 - tyrozyna; 10 - walina i metionina; II - tryptofan;
12 - fenyloalanina; 13 – leucyna i izoleucyna
Wysuszony chromatogram zanurza się w 1% roztworze ninhydryny w acetonie w celu określenia położenia plamek aminokwasów. Następnie chromatogram umieszcza się pod wyciągiem na 10 minut w celu usunięcia acetonu i przenosi do suszarki, gdzie pozostawia na 15 minut w temperaturze 70°C. Aminokwasy mieszaniny wzorcowej i testowej wykrywa się w postaci niebiesko-fioletowych plamek ułożonych w łańcuch w kierunku ruchu układu rozpuszczalników od linii początkowej do górnej krawędzi chromatogramu.
Identyfikacja aminokwasów zawartych w mieszaninie testowej odbywa się poprzez zbieżność na chromatogramie pozycji zajmowanych przez aminokwasy mieszaniny wzorcowej i testowej (ryc. 8).
W celu określenia ilościowej zawartości aminokwasów w badanych mieszaninach chromatogram rysuje się prostym ołówkiem tak, aby leżące na tym samym poziomie kolorowe strefy, odpowiadające temu samemu aminokwasowi, mieściły się w mniej więcej identycznych prostokątach (ryc. 9) .
I II III IV
Ryż. 9. Układ aminokwasów na chromatogramie:
I - mieszanka nr I; II - mieszanina nr 2; 1U - mieszanina nr 3; Ř - standard
mieszanina aminokwasów
Zarysowane obszary papieru wycina się i umieszcza w probówkach, których numery muszą odpowiadać liczbie plamek na chromatogramach. Do każdej probówki z biurety wlewa się 10 ml 75% roztworu. alkohol etylowy nasycony siarczanem miodu (dodaj 0,2 ml nasyconego roztworu siarczanu miedzi do 500 ml alkoholu etylowego). Probówkę zamyka się korkiem i, od czasu do czasu mieszając, ceglasta barwa (niebiesko-fioletowa sól miedzi Ruemanna) całkowicie przenosi się z bibuły do roztworu. Zajmuje to 15-20 minut. Absorpcję (gęstość optyczną) roztworów wzorcowych i testowych mierzy się za pomocą kalorymetru fotoelektrycznego z filtrem światła zielonego (540 nm). Na przepływie odniesienia zainstalowana jest kuweta z 75% roztworem alkoholu etylowego z siarczanem miedzi.
Ilościową zawartość aminokwasów w roztworze testowym oblicza się ze stosunku ekstynkcji próbki testowej i wzorcowej.
Przykład obliczeń. Załóżmy, że mieszanina wzorcowa zawiera 1,8 mg glicyny w 1 ml i na pasek wyjściowy nanosi się 0,02 g tego roztworu wzorcowego. Zatem otrzymany chromatogram (1,8 × 0,02) = 0,036 mg glicyny. Przyjmijmy ponadto, że absorpcja kolorowych roztworów wyniosła 0,288 dla wzorca i 0,336 dla nieznanej mieszaniny. Wtedy zawartość glicyny w badanej mieszaninie, wykreślona na chromatogramie, wyniesie (36’0,336): 0,288=42 µg. Jeśli dalej założymy, że na chromatogram naniesiemy mieszaninę badaną w ilości np. 0,0250 g, to zawartość glicyny w 1 ml roztworu badawczego wyniesie (42:0,0250) = 1680 µg, czyli 1,68 mg/ ml
Przedstaw wyniki własnego eksperymentu i wyciągnij z nich wnioski.
Praca laboratoryjna nr 15
Separacja jonówFe 3+ , Współ 2+ , Ni 2+
W artykule zostaną omówione metody oznaczania aminokwasów, stosowane nie tylko w analizie produktów, ale także w biochemii i analizie farmaceutycznej.
Ogólną ilość aminokwasów można oznaczyć metodą fotometryczną opartą na oznaczeniu amoniaku otrzymanego z aminokwasów metodą Kjeldahla.
Reakcja z 1-naftolem. Do oznaczenia argininy, histydyny i tyrozyny zaproponowano reakcję z 1-naftolem. W obecności podchlorynu sodu (NaOCl) roztwór zmienia kolor na czerwony. Roztwór próbki w 50% etanolu zawierającym aminokwas schładza się lodem i dodaje 10% roztwór NaOCl i roztwór naftolu. Produkt reakcji zabarwia się na czerwono (lmax = 550 nm). Zawartość aminokwasów zależy od intensywności barwy powstałego roztworu.
Reakcja biuretowa. Jedną z najważniejszych reakcji stosowanych do oznaczania aminokwasów jest reakcja biuretowa. Reakcję prowadzi się przez dodanie rozcieńczonego wodnego roztworu soli miedzi (II) do alkalicznego roztworu biuretu. W tym przypadku rozwiązanie zmienia się intensywnie fioletowy w wyniku tworzenia się złożonego związku.
W reakcji biuretowej biorą udział związki zawierające co najmniej 2 grupy amidowe lub grupę aminohydroksyetylenową, a także amidy i imidy aminokwasów. Reakcję tę przeprowadzają białka oraz stężone roztwory aminokwasów i amidów. Rozcieńczone roztwory aminokwasów nie powodują reakcji biuretowej, dlatego też reakcję tę można wykorzystać do określenia końca hydrolizy białek. Reakcję wykorzystuje się także do jakościowego i ilościowego oznaczania białka. Reakcja biuretowa jest podstawą metod stosowanych w klinicznych laboratoriach diagnostycznych do oznaczania białka we krwi i innych płynach biologicznych.
Reakcja ninhydrynowa. Drugą najważniejszą reakcją stosowaną do oznaczania aminokwasów jest reakcja ninhydrynowa – reakcja barwna na a-aminokwasy, którą przeprowadza się poprzez ogrzewanie tych ostatnich w alkalicznym roztworze nadmiaru ninhydryny.
Ninhydryna przeprowadza oksydacyjną dekarboksylację a-aminokwasów z utworzeniem amoniaku, dwutlenek węgla i aldehyd zawierający o jeden atom węgla mniej niż aminokwas macierzysty. Zredukowana ninhydryna reaguje dalej z uwolnionym amoniakiem i drugą cząsteczką ninhydryny, tworząc kolorowy produkt kondensacji z amoniakiem.
Powstały związek (pigment) ma fioletowo-niebieski kolor (lmax = 570 nm). Tworzenie się tego barwnego związku wykorzystuje się w ilościowym teście a-aminokwasów, który pozwala wykryć aminokwasy nawet w ilościach tak małych jak 1 µg.
Prolina i hydroksyprolina, które nie posiadają grupy a-aminowej, reagują z ninhydryną tworząc pochodne żółty(lmaks. = 440 nm). Reakcja nie jest specyficzna, ponieważ amoniak i związki zawierające grupę aminową (aminy, białka, peptydy) również dają kolorowy produkt z ninhydryną. Jednakże w przypadku tych związków nie jest uwalniany CO2. Uwalnianie dwutlenku węgla jest charakterystyczne tylko dla a-aminokwasów. Reakcja służy do kolorymetrycznego ilościowego oznaczania a-aminokwasów, w tym w automatycznych analizatorach aminokwasów (pomiar objętości CO 2).
Reakcja ninhydrynowa służy do oznaczania glicyny, izoleucyny, leucyny; seryna, fenyloalanina, cysteina, tyrozyna, tryptofan itp. dają mniej intensywne zabarwienie.
Otrzymane produkty charakteryzują się dość intensywną barwą (e = 1,8–3,3·10 4), lecz produkty barwione są nietrwałe. Intensywność koloru szybko maleje. Dla stabilizacji dodaje się CdCl2. Tworzy trwałe kompleksy z powstałymi związkami. Chlorek kadmu również przyspiesza reakcję.
Aminokwasy i niektóre inne związki zawierające grupę aminową kondensują w środowisku zasadowym z 1,2-naftochinono-4-sulfoksylanem, tworząc czerwone, żółte i pomarańczowe pochodne monoiminy 1,2-naftochinonu.
Reakcja służy do oznaczania a-aminooksylatów (waliny, izoleucyny, leucyny itp.).
Do oznaczenia tryptofanu można zastosować reakcję z 4-dimetyloaminobenzaldehydem. Produkt reakcji ma kolor fioletowy, a zawartość tryptofanu w analizowanym roztworze zależy od intensywności jego zabarwienia.
Należy jednak zaznaczyć, że reakcja ta jest rzadko stosowana w analizie żywności.
Do ilościowego oznaczania aminokwasów zawierających siarkę stosuje się metodę bromatometryczną opartą na reakcji:
Roztwór cysteiny w 1% roztworze NaOH wlewa się do kolby ze zmielonym korkiem, dodaje 0,1 N. roztworem bromianu potasu, suchym bromkiem potasu i zakwaszeniu 10% HCl.
BrO 3 – + 5Br – + 6H + → 3Br 2 + 3H 2O
Powstały w wyniku reakcji brom, którego ilość jest równa ilości bromianu potasu, reaguje z aminokwasem. Po 10 minutach dodaje się jodek potasu, który reaguje z nieprzereagowanym bromem, a uwolniony jod miareczkuje się 0,1 N. roztwór tiosiarczanu sodu ze skrobią jako wskaźnikiem.
2I – + Br 2 → Br - + I 2
Ilość tiosiarczanu użytego do miareczkowania odpowiada ilości bromu, który nie przereagował z aminokwasem. Na podstawie różnicy pomiędzy ilością dodanego bromianu potasu i tiosiarczanu określa się ilość bromu, która weszła w reakcję z aminokwasem, a co za tym idzie, ilość aminokwasu.
Metioninę oznacza się w podobny sposób. Metionina utlenia się do sulfonu:
Ta reakcja, kiedy pewne warunki pozwala bardzo dokładnie oznaczyć zawartość metioniny.
