Chemiczne i elektrochemiczne metody badań w medycynie. Katedra Chemii Temat wykładu: Metody chemiczne w medycynie

Ryc.1. Klasyfikacja metod analitycznych

Oprócz trzech głównych grup istnieją hybrydowy metody. Na ryc. 1. nie są pokazane. W metodach hybrydowych separacja, identyfikacja i oznaczanie składników są organicznie łączone w jednym urządzeniu (lub w jednym kompleksie instrumentów). Najważniejszą z tych metod jest chromatograficzny analiza. W specjalnym urządzeniu (chromatografie) następuje rozdzielenie składników badanej próbki (mieszaniny), które przemieszczają się z różną prędkością przez kolumnę wypełnioną stałym proszkiem (sorbentem). Zanim składnik opuści kolumnę, oceniany jest jego charakter i w ten sposób identyfikowane są wszystkie składniki próbki. Elementy opuszczające kolumnę kolejno trafiają do kolejnej części urządzenia, gdzie specjalne urządzenie – detektor – mierzy i rejestruje sygnały wszystkich podzespołów. Często sygnały są automatycznie przypisywane do określonych substancji i obliczana jest zawartość każdego składnika próbki. Jest jasne, że chromatograficzny analizy nie można uważać jedynie za metodę rozdzielania składników, ani jedynie za metodę ilościowego oznaczania, jest to właśnie metoda hybrydowa;

1.4. Metody analizy i wymagania dla nich

Nie należy mylić pojęć metoda I techniki.

Metodologia to jasny i szczegółowy opis tego, jak należy przeprowadzić analizę, stosując jakąś metodę w celu rozwiązania konkretnego problemu analitycznego.

Zazwyczaj metoda jest opracowywana przez specjalistów, przechodzi wstępne badania i certyfikację metrologiczną, jest oficjalnie zarejestrowana i zatwierdzona. Nazwa metody wskazuje na zastosowaną metodę, przedmiot oznaczania i przedmiot analizy

Podnieść optymalny(najlepszą) technikę, w każdym przypadku należy wziąć pod uwagę szereg wymagań praktycznych.

1. T dokładność. To jest główny wymóg. Oznacza to, że błąd względny lub bezwzględny analizy nie powinien przekraczać określonej wartości granicznej

2. Wrażliwość. To słowo w mowie potocznej zastępuje się terminami bardziej rygorystycznymi „granica wykrywalności” i „dolna granica wykrywalnych stężeń”" Metody wysoce czułe to takie, dzięki którym możemy wykryć i zidentyfikować składnik nawet wtedy, gdy jego zawartość w badanym materiale jest niska. Im niższa oczekiwana zawartość, tym bardziej czuła jest wymagana technika. .

3. Selektywność (selektywność). Ważne jest, aby na wynik analizy nie miały wpływu obce substancje zawarte w próbce.

4. Wyrazistość . Mówimy o czasie trwania analizy jednej próbki – od pobrania do wyciągnięcia wniosku. Im szybciej zostaną uzyskane wyniki, tym lepiej.

5.C koszt. Ta cecha techniki nie wymaga komentarza. Na masową skalę można stosować jedynie stosunkowo niedrogie testy. Koszt kontroli analitycznej w przemyśle zwykle nie przekracza 1% kosztu produktu. Analizy unikalne w swojej złożoności i rzadko wykonywane są bardzo drogie.

Istnieją inne wymagania dotyczące metodologii - bezpieczeństwo analizy, możliwość przeprowadzenia analizy bez bezpośredniego udziału człowieka, stabilność wyników na losowe wahania warunków itp.

1,5. Główne etapy (etapy) analizy ilościowej

Technikę analizy ilościowej można mentalnie podzielić na kilka kolejnych etapów (etapów), a prawie każda technika ma te same etapy. Odpowiedni schemat logiczny analizy pokazano na ryc. 1.2. Główne etapy przeprowadzania analizy ilościowej to: sformułowanie problemu analitycznego i wybór metodologii, pobieranie próbek, przygotowanie próbki, pomiar sygnału, obliczanie i prezentacja wyników.

Sformułowanie problemu analitycznego i wybór metodologii. Praca specjalisty-analityka rozpoczyna się zwykle od pozyskiwania zamówienie Do analizy. Pojawienie się takiego zamówienia wynika zwykle z działalności zawodowej innych specjalistów, pojawienia się niektórych Problemy. Takim problemem może być np. postawienie diagnozy, ustalenie przyczyny wady podczas produkcji niektórych produktów, ustalenie autentyczności eksponatu muzealnego, możliwość obecności jakiejś substancji toksycznej w wodzie kranowej itp. Na podstawie informacji uzyskanych od specjalisty (chemika organika, inżyniera przemysłu, geologa, dentysty, śledczego prokuratury, agronoma, archeologa itp.) analityk musi sformułować problem analityczny. Oczywiście musimy wziąć pod uwagę możliwości i życzenia „klienta”. Ponadto konieczne jest zebranie dodatkowych informacji (przede wszystkim o składzie jakościowym materiału, który będzie musiał zostać poddany analizie).

Postawienie problemu analitycznego wymaga bardzo wysoko wykwalifikowanego analityka i jest najtrudniejszą częścią nadchodzących badań. Nie wystarczy określić, jaki materiał będzie podlegał analizie i co dokładnie należy w nim określić. Konieczne jest zrozumienie, na jakim poziomie stężenia trzeba będzie przeprowadzić analizę, jakie obce składniki będą obecne w próbkach, jak często trzeba będzie przeprowadzać analizy, ile czasu i pieniędzy można przeznaczyć na jedną analizę , czy możliwe będzie dostarczenie próbek do laboratorium, czy też konieczne będzie wykonanie analizy bezpośrednio „na miejscu”, czy wprowadzone zostaną ograniczenia wagowe i odtwarzalność właściwości badanego materiału itp. Co najważniejsze, musisz zrozumieć: jaką dokładność wyników analizy należy zapewnić i jak taką dokładność można osiągnąć!

Jasno sformułowany problem analityczny jest podstawą wyboru optymalnej metodyki. Do poszukiwań służą zbiory dokumentów normatywnych (w tym metod standardowych), podręczniki oraz recenzje poszczególnych obiektów lub metod. Przykładowo, jeśli zamierzają oznaczać zawartość produktów naftowych w ściekach metodą fotometryczną, to przeglądają monografie poświęcone po pierwsze analizie fotometrycznej, po drugie metodom analizy ścieków, po trzecie różnym metodom oznaczania produktów naftowych . Istnieje seria książek, z których każda poświęcona jest chemii analitycznej pierwiastka. Wydano podręczniki dotyczące poszczególnych metod i poszczególnych obiektów analiz. Jeżeli w podręcznikach i monografiach nie udało się znaleźć odpowiednich metod, poszukiwania kontynuuje się korzystając z czasopism abstrakcyjnych i naukowych, wyszukiwarek internetowych, konsultacji ze specjalistami itp. Po wybraniu odpowiednich metod wybiera się tę, która najlepiej spełnia zadanie analityczne .

Często do rozwiązania konkretnego problemu nie tylko nie ma standardowych metod, ale w ogóle nie ma opisanych wcześniej rozwiązań technicznych (szczególnie złożone problemy analityczne, unikalne obiekty). Z taką sytuacją często mamy do czynienia podczas prowadzenia badań naukowych. W takich przypadkach należy samodzielnie opracować technikę analizy. Jednak wykonując analizy własnymi metodami, należy szczególnie dokładnie sprawdzić poprawność uzyskanych wyników.

Próbowanie. Opracuj metodę analizy, która by na to pozwoliła zmierzyć stężenie interesującego nas składnika bezpośrednio w badanym obiekcie jest to dość rzadkie. Przykładem może być czujnik zawartości dwutlenku węgla w powietrzu, który jest instalowany na łodziach podwodnych i innych zamkniętych przestrzeniach. Znacznie częściej niewielka część jest pobierana z badanego materiału. próbka- i dostarczyć go do laboratorium analitycznego w celu dalszych badań. Próbka musi być przedstawiciel(reprezentatywny), to znaczy jego właściwości i skład powinny w przybliżeniu pokrywać się z właściwościami i składem badanego materiału jako całości. W przypadku obiektów gazowych i ciekłych dość łatwo jest pobrać reprezentatywną próbkę, ponieważ są one jednorodne . Trzeba tylko wybrać odpowiedni czas i miejsce selekcji. Przykładowo przy pobieraniu próbek wody ze zbiornika uwzględnia się, że woda w warstwie powierzchniowej różni się składem od wody z warstwy dennej, woda w pobliżu brzegów jest bardziej zanieczyszczona, skład wody rzecznej nie jest to samo w różnych porach roku itp. W dużych miastach próbki powietrza atmosferycznego pobierane są z uwzględnieniem kierunku wiatru i lokalizacji źródeł emisji zanieczyszczeń. Pobieranie próbek nie sprawia problemów nawet w przypadku badania czystych substancji chemicznych, nawet ciał stałych lub jednorodnych drobnych proszków.

Znacznie trudniej jest prawidłowo wybrać reprezentatywną próbkę niejednorodnej substancji stałej (gleby, rudy, węgla, zboża itp.). Jeśli pobierzesz próbki gleby w różnych miejscach tego samego pola, z różnych głębokości lub w różnym czasie, wyniki analizy tego samego rodzaju próbek okażą się różne. Mogą się one różnić kilkukrotnie, zwłaszcza jeśli sam materiał był niejednorodny i składał się z cząstek o różnym składzie i wielkości.

Sprawę komplikuje fakt, że często pobieraniem próbek zajmuje się nie sam analityk, lecz niedostatecznie wykwalifikowani pracownicy lub, co gorsza, osoby zainteresowane uzyskaniem określonego wyniku analizy. I tak w opowieściach M. Twaina i Breta Harte barwnie opisano, jak przed sprzedażą miejsca ze złotem sprzedawca starał się wybrać do analizy kawałki skały z wyraźnymi wtrąceniami złota, a kupujący - pustą skałę. Nic więc dziwnego, że wyniki odpowiednich analiz dały odwrotną, choć w obu przypadkach błędną charakterystykę badanego obszaru.

Aby zapewnić poprawność wyników analiz, dla każdej grupy obiektów opracowano i przyjęto specjalne zasady i schematy pobierania próbek. Przykładem może być analiza gleby. W takim przypadku należy wybrać Niektóre duże porcje materiału badawczego w różnych miejscach obszaru badań, a następnie połączyć je. Z góry oblicza się, ile powinno być punktów poboru próbek i w jakiej odległości od siebie powinny być one zlokalizowane. Wskazane jest, z jakiej głębokości należy pobrać każdą porcję gleby, jaką powinna mieć masę itp. Istnieje nawet specjalna teoria matematyczna, która pozwala obliczyć minimalną masę połączonej próbki, biorąc pod uwagę wielkość cząstek , niejednorodność ich składu itp. Im większa masa próbki, tym jest ona bardziej reprezentatywna, dlatego w przypadku materiału niejednorodnego całkowita masa połączonej próbki może sięgać dziesiątek, a nawet setek kilogramów. Połączoną próbkę suszy się, rozdrabnia, dokładnie miesza i stopniowo zmniejsza ilość badanego materiału (są do tego specjalne techniki i urządzenia), ale nawet po wielokrotnym rozdrobnieniu masa próbki może osiągnąć kilkaset gramów. Zredukowana próbka dostarczana jest do laboratorium w hermetycznie zamkniętym pojemniku. Tam kontynuują mielenie i mieszanie badanego materiału (w celu uśrednienia składu), a dopiero potem pobierają odważoną porcję uśrednionej próbki na wagę analityczną do dalszej analizy. przygotowanie próbki i późniejszy pomiar sygnału.

Pobieranie próbek jest najważniejszym etapem analizy, gdyż błędy występujące na tym etapie są bardzo trudne do skorygowania lub wyjaśnienia. Błędy próbkowania są często główną przyczyną ogólnej niepewności analitycznej. Jeżeli pobranie próbki będzie nieprawidłowe, nawet idealne wykonanie kolejnych operacji nie pomoże – uzyskanie prawidłowego wyniku nie będzie już możliwe.

przygotowanie próbki . To zbiorcza nazwa wszystkich operacji, którym poddawana jest dostarczona tam próbka w laboratorium przed pomiarem sygnału analitycznego. Podczas przygotowanie próbki przeprowadzać różnorodne operacje: odparowanie, suszenie, kalcynację lub spalanie próbki, jej rozpuszczenie w wodzie, kwasach lub rozpuszczalnikach organicznych, wstępne utlenianie lub redukcję oznaczanego składnika za pomocą specjalnie dodanych odczynników, usuwanie lub maskowanie zakłócających zanieczyszczeń. Często konieczne jest zagęszczenie oznaczanego składnika – z próbki o dużej objętości składnik jest ilościowo przenoszony do małej objętości roztworu (koncentratu), gdzie następnie mierzony jest sygnał analityczny. Przykładowe składniki o podobnych właściwościach podczas przygotowanie próbki starają się je od siebie oddzielić, aby ułatwić określenie stężenia każdego z osobna. przygotowanie próbki wymaga więcej czasu i pracy niż inne operacje analityczne; jest to dość trudne do zautomatyzowania. Należy pamiętać, że każda operacja przygotowanie próbki- jest to dodatkowe źródło błędów analitycznych. Im mniej takich operacji, tym lepiej. Idealne metody to takie, które nie obejmują sceny przygotowanie próbki(„przyszedł, zmierzył, obliczył”), ale takich metod jest stosunkowo niewiele.

Analityczny pomiar sygnału wymaga stosowania odpowiednich przyrządów pomiarowych, przede wszystkim precyzyjnych (wag, potencjometrów, spektrometrów, chromatografów itp.), a także wstępnie skalibrowanych przyrządów pomiarowych. Przyrządy pomiarowe muszą być certyfikowane („zweryfikowane”), czyli z góry wiadomo, jaki maksymalny błąd można uzyskać mierząc sygnał tym urządzeniem. Oprócz przyrządów pomiary sygnałów wymagają w wielu przypadkach wzorców o znanym składzie chemicznym (próbki porównawcze, np. próbki wzorcowe). Służą do kalibracji metodologii (patrz rozdział 5), sprawdzania i dostosowywania instrumentów. Wynik analizy oblicza się również przy użyciu standardów.

Obliczanie i prezentacja wyników - najszybszy i najłatwiejszy etap analizy. Wystarczy wybrać odpowiednią metodę obliczeń (przy użyciu tej czy innej formuły, zgodnie z harmonogramem itp.). Zatem, aby oznaczyć uran w rudzie uranu, radioaktywność próbki porównuje się z radioaktywnością próbki standardowej (rudy o znanej zawartości uranu), a następnie zawartość uranu w próbce określa się, rozwiązując zwykłą proporcję. Jednak ta prosta metoda nie zawsze jest odpowiednia, a zastosowanie niewłaściwego algorytmu obliczeniowego może prowadzić do poważnych błędów. Niektóre metody obliczeń są bardzo złożone i wymagają użycia komputera. W kolejnych rozdziałach zostaną szczegółowo opisane metody obliczeniowe stosowane w różnych metodach analizy, ich zalety oraz warunki stosowalności poszczególnych metod. Wyniki analizy należy poddać obróbce statystycznej. Wszelkie dane związane z analizą danej próbki odzwierciedlone są w dzienniku laboratoryjnym, a wynik analizy zapisywany jest w specjalnym protokole. Czasami sam analityk porównuje wyniki analizy kilku substancji ze sobą lub z określonymi standardami i wyciąga znaczące wnioski. Na przykład o zgodności lub niezgodności jakości badanego materiału z ustalonymi wymaganiami ( kontrola analityczna).

3315 0

Zanieczyszczenia metalami ciężkimi (HM) mają bardzo zróżnicowany niekorzystny wpływ na życie organizmów żywych i ogólnie na biosferę Ziemi. Wraz z pestycydami, dioksynami, produktami naftowymi, fenolami, fosforanami i azotanami metale ciężkie tworzą „piekielną mieszaninę”, która w przyszłości może postawić pod znakiem zapytania samo istnienie cywilizacji. Rosnąca skala zanieczyszczenia środowiska powoduje wzrost częstości występowania mutacji genetycznych, nowotworów, chorób układu krążenia, chorób zawodowych, zatruć, dermatoz oraz istotnych klinicznie zaburzeń immunologicznych. Nadchodzącej epoce nanotechnologii towarzyszy wejście do biosfery pierwiastków rzadkich i ziem rzadkich, z którymi dotychczas żyjąca przyroda praktycznie nie spotkała się, a zatem nie posiada mechanizmów biochemicznych przeciwdziałających ewentualnemu nieprzyjaznemu wpływowi tych pierwiastków na organizmy żywe.

W tych warunkach bezwzględnie konieczne staje się zastosowanie chemii analitycznej, która zajmuje się sposobami określania składu chemicznego materiałów naturalnych i sztucznych. Techniki i metody tej nauki służą identyfikacji substancji wchodzących w skład przedmiotu i ich dokładnemu określeniu ilościowemu. W medycynie chemia analityczna stanowi podstawę klinicznych badań laboratoryjnych, które pomagają lekarzom diagnozować choroby i osiągać sukcesy w ich leczeniu. Analizy chemiczne wykorzystuje się także do oceny stopnia zanieczyszczenia środowiska oraz określenia wartości odżywczej żywności. Ponieważ nie wszyscy znają podejście do analizy w chemii analitycznej, należy powiedzieć kilka słów o terminologii. Termin selektywny oznacza reakcję z kilkoma substancjami, termin konkretny oznacza reakcję z jedną substancją. Warunki analizować I określić nierówny. Próbkę (przedmiot) analizuje się na zawartość jednego lub większej liczby składników ( Analityki), a proces pomiaru zawartości analitu nazywa się definicja.

Metody ekranizacja nie opracowano badań zawartości niektórych pierwiastków w medycynie; listę elementów do analizy ustala się w zależności od objawów klinicznych. W załączniku znajdują się tabele najważniejszych chorób, zespołów, oznak niedoborów i nadmiarów niezbędny(= niezbędne) mikroelementy wg A.P. Avtsynu i in. (1991). Bardzo często w medycynie sądowej wykorzystuje się analizę wieloelementową do ustalenia przyczyn ostrych i przewlekłych zatruć. Taka analiza jest również istotna w diagnostyce i leczeniu chorób zawodowych powstałych na skutek przewlekłego narażenia organizmu na metale ciężkie (zarówno pochodzenia przemysłowego, jak i środowiskowego).

Dla medycyny prewencyjnej w ogóle, a zwłaszcza dla lekarzy sanitarnych, dane dotyczące składu jakościowego i ilościowego zanieczyszczeń środowiska oraz szkodliwych zanieczyszczeń w surowcach spożywczych i produktach spożywczych są bardzo ważne, pozwalają na opracowanie odpowiednich działań legislacyjnych i organizacyjnych. Jedyną wiarygodną metodą ich uzyskania jest analiza składu powietrza, wody, gleby i innych obiektów środowiska, surowców spożywczych i produktów spożywczych. Danych analitycznych nie można zastąpić studiowaniem dokumentacji technicznej, ponieważ naruszenia technologii i wypadki są częste podczas produkcji, a interakcja substancji zanieczyszczających w rzeczywistym środowisku może być nieprzewidywalna, na przykład antagonistyczna lub odwrotnie, synergistyczna.

Bionieorganiczne medyczne. G.K. Baraszkow

Fizykochemiczne lub instrumentalne metody analizy

Fizykochemiczne lub instrumentalne metody analizy polegają na pomiarze za pomocą przyrządów (przyrządów) parametrów fizycznych analizowanego układu, które powstają lub zmieniają się w trakcie prowadzenia reakcji analitycznej.

Szybki rozwój metod analizy fizykochemicznej spowodowany był faktem, że klasyczne metody analizy chemicznej (grawimetria, miareczkowanie) nie były już w stanie sprostać licznym wymaganiom przemysłu chemicznego, farmaceutycznego, metalurgicznego, półprzewodników, jądrowego i innych, które wymagały zwiększenia czułość metod na poziomie 10-8 - 10-9%, ich selektywność i szybkość, co umożliwiłoby sterowanie procesami technologicznymi w oparciu o dane analizy chemicznej, a także wykonywanie ich w sposób automatyczny i zdalny.

Szereg nowoczesnych metod analizy fizykochemicznej umożliwia jednoczesne wykonanie analizy jakościowej i ilościowej składników tej samej próbki. Dokładność analiz współczesnych metod fizykochemicznych jest porównywalna z dokładnością metod klasycznych, a w niektórych, np. w kulometrii, jest znacznie wyższa.

Do wad niektórych metod fizykochemicznych należy wysoki koszt stosowanych instrumentów i konieczność stosowania standardów. Dlatego klasyczne metody analizy nadal nie straciły na znaczeniu i znajdują zastosowanie tam, gdzie nie ma ograniczeń co do szybkości analizy, a wymagana jest duża dokładność przy dużej zawartości analizowanego składnika.

Klasyfikacja fizykochemicznych metod analizy

Klasyfikacja fizykochemicznych metod analizy opiera się na charakterze mierzonego parametru fizycznego analizowanego układu, którego wartość jest funkcją ilości substancji. Zgodnie z tym wszystkie metody fizykochemiczne są podzielone na trzy duże grupy:

Elektrochemiczny;

Optyczne i spektralne;

Chromatograficzne.

Elektrochemiczne metody analizy opierają się na pomiarze parametrów elektrycznych: prądu, napięcia, potencjałów elektrod równowagowych, przewodności elektrycznej, ilości energii elektrycznej, których wartości są proporcjonalne do zawartości substancji w analizowanym obiekcie.

Optyczne i spektralne metody analizy opierają się na pomiarach parametrów charakteryzujących skutki oddziaływania promieniowania elektromagnetycznego z substancjami: natężenia promieniowania wzbudzonych atomów, absorpcji promieniowania monochromatycznego, współczynnika załamania światła, kąta obrotu płaszczyzny spolaryzowana wiązka światła itp.

Wszystkie te parametry są funkcją stężenia substancji w analizowanym obiekcie.

Metody chromatograficzne to metody rozdzielania jednorodnych mieszanin wieloskładnikowych na poszczególne składniki metodami sorpcyjnymi w warunkach dynamicznych. W tych warunkach składniki rozdzielane są pomiędzy dwie niemieszające się ze sobą fazy: ruchomą i stacjonarną. Rozkład składników opiera się na różnicy ich współczynników rozkładu pomiędzy fazą ruchomą i stacjonarną, co prowadzi do różnych szybkości przenoszenia tych składników z fazy stacjonarnej do fazy ruchomej. Po rozdzieleniu zawartość ilościową każdego składnika można oznaczyć różnymi metodami analizy: klasyczną lub instrumentalną.

Analiza spektralna absorpcji molekularnej

Analiza widma absorpcji molekularnej obejmuje analizy spektrofotometryczne i fotokolorymetryczne.

Analiza spektrofotometryczna polega na wyznaczeniu widma absorpcyjnego lub pomiarze absorpcji światła przy ściśle określonej długości fali, która odpowiada maksimum krzywej absorpcji badanej substancji.

Analiza fotokolorymetryczna polega na porównaniu intensywności barwy badanego roztworu barwnego z barwnym roztworem wzorcowym o określonym stężeniu.

Cząsteczki substancji mają pewną energię wewnętrzną E, której składnikami są:

Energia ruchu elektronów Węgorz znajdujący się w polu elektrostatycznym jąder atomowych;

Energia drgań jąder atomowych względem siebie E liczy się;

Energia rotacji cząsteczki E vr

i wyraża się matematycznie jako sumę wszystkich powyższych energii:

Ponadto, jeśli cząsteczka substancji absorbuje promieniowanie, wówczas jej energia początkowa E 0 wzrasta o ilość energii pochłoniętego fotonu, czyli:

Z powyższej równości wynika, że ​​im krótsza długość fali λ, tym większa częstotliwość drgań, a zatem większa E, czyli energia przekazywana cząsteczce substancji podczas interakcji z promieniowaniem elektromagnetycznym. Dlatego charakter oddziaływania energii promieniowania z materią będzie różny w zależności od długości fali światła λ.

Zbiór wszystkich częstotliwości (długości fal) promieniowania elektromagnetycznego nazywany jest widmem elektromagnetycznym. Przedział długości fali jest podzielony na obszary: ultrafiolet (UV) około 10-380 nm, światło widzialne 380-750 nm, podczerwień (IR) 750-100 000 nm.

Energia przekazana cząsteczce substancji przez promieniowanie UV i widzialne części widma jest wystarczająca, aby spowodować zmianę stanu elektronowego cząsteczki.

Energia promieni IR jest mniejsza, wystarczy więc jedynie spowodować zmianę energii przejść wibracyjnych i rotacyjnych w cząsteczce substancji. Zatem w różnych częściach widma można uzyskać różne informacje o stanie, właściwościach i strukturze substancji.

Prawa absorpcji promieniowania

Spektrofotometryczne metody analizy opierają się na dwóch podstawowych prawach. Pierwszym z nich jest prawo Bouguera-Lamberta, drugim prawem jest prawo Beera. Połączone prawo Bouguera-Lamberta-Beera ma następującą formułę:

Absorpcja światła monochromatycznego przez kolorowy roztwór jest wprost proporcjonalna do stężenia substancji pochłaniającej światło i grubości warstwy roztworu, przez którą przechodzi.

Prawo Bouguera-Lamberta-Beera jest podstawowym prawem absorpcji światła i leży u podstaw większości fotometrycznych metod analizy. Matematycznie wyraża się to równaniem:

Lub

Rozmiar lgI / I 0 nazywa się gęstością optyczną substancji pochłaniającej i jest oznaczona literami D lub A. Wtedy prawo można zapisać w następujący sposób:

Stosunek natężenia strumienia promieniowania monochromatycznego przechodzącego przez badany obiekt do natężenia początkowego strumienia promieniowania nazywany jest przezroczystością lub transmitancją roztworu i jest oznaczony literą T: T = I / I 0

Stosunek ten można wyrazić w procentach. Wartość T, charakteryzująca przepuszczalność warstwy o grubości 1 cm, nazywana jest transmitancją. Gęstość optyczna D i transmitancja T są ze sobą powiązane zależnością

D i T to główne wielkości charakteryzujące absorpcję roztworu danej substancji o określonym stężeniu przy określonej długości fali i grubości warstwy absorbującej.

Zależność D(C) jest liniowa, a T(C) lub T(l) wykładnicza. Jest to ściśle przestrzegane tylko w przypadku strumieni promieniowania monochromatycznego.

Wartość współczynnika ekstynkcji K zależy od sposobu wyrażenia stężenia substancji w roztworze oraz grubości warstwy pochłaniającej. Jeżeli stężenie wyraża się w molach na litr, a grubość warstwy podaje się w centymetrach, wówczas nazywa się to współczynnikiem ekstynkcji molowej, oznaczonym symbolem ε i jest równy gęstości optycznej roztworu o stężeniu 1 mol/L umieszcza się w kuwecie o grubości warstwy 1 cm.

Wartość molowego współczynnika absorpcji światła zależy od:

Z natury substancji rozpuszczonej;

Długości fal światła monochromatycznego;

Temperatury;

Charakter rozpuszczalnika.

Przyczyny nieprzestrzegania prawa Bouguera-Lamberta-Beera.

1. Prawo zostało wyprowadzone i obowiązuje tylko dla światła monochromatycznego, zatem niedostateczna monochromatyzacja może spowodować odchylenie od prawa, a w większym stopniu im mniej monochromatyczne jest światło.

2. W roztworach mogą zachodzić różne procesy zmieniające stężenie substancji absorbującej lub jej charakter: hydroliza, jonizacja, hydratacja, asocjacja, polimeryzacja, kompleksowanie itp.

3. Absorpcja światła przez roztwory zależy w dużym stopniu od pH roztworu. Gdy zmienia się pH roztworu, mogą zmienić się:

Stopień jonizacji słabego elektrolitu;

Forma istnienia jonów, która prowadzi do zmiany absorpcji światła;

Skład powstałych kolorowych związków złożonych.

Ustawa obowiązuje zatem dla roztworów silnie rozcieńczonych, a jej zakres jest ograniczony.

Kolorometria wizualna

Intensywność barwy roztworów można mierzyć różnymi metodami. Wśród nich wyróżnia się subiektywne (wizualne) metody kolorymetryczne oraz obiektywne, czyli fotokolorymetryczne.

Metody wizualne to takie, w których oceny intensywności barwy badanego roztworu dokonuje się gołym okiem. W obiektywnych metodach oznaczania kolorymetrycznego zamiast bezpośredniej obserwacji stosuje się fotokomórki do pomiaru intensywności barwy badanego roztworu. Oznaczanie w tym przypadku przeprowadza się w specjalnych urządzeniach - fotokolorymetrach, dlatego metodę tę nazywa się fotokolorymetryczną.

Widoczne kolory:

Metody wizualne obejmują:

- metoda serii standardowych;

- metoda miareczkowania kolorymetrycznego lub powielania;

- metoda wyrównawcza.

Standardowa metoda szeregowa. Wykonując analizę metodą serii wzorcowych, intensywność barwy analizowanego roztworu barwnego porównuje się z barwami serii specjalnie przygotowanych roztworów wzorcowych (o tej samej grubości warstwy).

Metoda miareczkowania kolorymetrycznego (duplikacji). polega na porównaniu barwy analizowanego roztworu z barwą innego roztworu – kontrolnego. Roztwór kontrolny zawiera wszystkie składniki roztworu badawczego, z wyjątkiem oznaczanej substancji, oraz wszystkie odczynniki użyte do przygotowania próbki. Z biurety dodaje się do niego roztwór mianowany oznaczanej substancji. W przypadku dodania takiej ilości tego roztworu, że intensywność barwy roztworów kontrolnych i analizowanych jest równa, uznaje się, że analizowany roztwór zawiera taką samą ilość analitu, jaką wprowadzono do roztworu kontrolnego.

Metoda regulacji różni się od opisanych powyżej wizualnych metod kolorymetrycznych, w których podobieństwo barw roztworów wzorcowych i testowych uzyskuje się poprzez zmianę ich stężenia. W metodzie wyrównawczej podobieństwo kolorów uzyskuje się poprzez zmianę grubości warstw kolorowych roztworów. W tym celu przy oznaczaniu stężenia substancji stosuje się kolorymetry drenażowe i zanurzeniowe.

Zalety wizualnych metod analizy kolorymetrycznej:

Technika oznaczania jest prosta, nie ma potrzeby stosowania skomplikowanego, drogiego sprzętu;

Oko obserwatora może ocenić nie tylko intensywność, ale także odcienie barwy roztworów.

Wady:

Konieczne jest przygotowanie standardowego rozwiązania lub serii standardowych rozwiązań;

Nie da się porównać intensywności barwy roztworu w obecności innych substancji barwiących;

Porównując intensywność koloru oczu danej osoby przez długi czas, osoba staje się zmęczona i zwiększa się błąd określenia;

Oko ludzkie nie jest tak wrażliwe na niewielkie zmiany gęstości optycznej jak urządzenia fotowoltaiczne, co uniemożliwia wykrycie różnic w stężeniu do około pięciu względnych procent.

Metody fotoelektrokolorymetryczne

Fotoelektrokolorymetria służy do pomiaru absorpcji lub przepuszczalności światła przez kolorowe roztwory. Przyrządy używane do tego celu nazywane są kolorymetrami fotoelektrycznymi (PEC).

Fotoelektryczne metody pomiaru intensywności koloru wykorzystują fotokomórki. W odróżnieniu od przyrządów, w których porównuje się kolory wizualnie, w fotoelektrokolorymetrach odbiornikiem energii świetlnej jest urządzenie – fotokomórka. Urządzenie to przekształca energię świetlną w energię elektryczną. Fotokomórki umożliwiają oznaczenia kolorymetryczne nie tylko w zakresie widzialnym, ale także w zakresie UV i IR widma. Pomiar strumieni świetlnych za pomocą fotometrów fotoelektrycznych jest dokładniejszy i niezależny od charakterystyki oka obserwatora. Zastosowanie fotokomórek umożliwia automatyzację wyznaczania stężenia substancji w chemicznej kontroli procesów technologicznych. W rezultacie kolorymetria fotoelektryczna jest znacznie szerzej stosowana w praktyce laboratoriów zakładowych niż kolorymetria wizualna.

Na ryc. Rysunek 1 przedstawia typowy układ węzłów w przyrządach do pomiaru transmisji lub absorpcji roztworów.

Rys. 1 Główne elementy urządzeń do pomiaru absorpcji promieniowania: 1 - źródło promieniowania; 2 - monochromator; 3 - kuwety do roztworów; 4 - konwerter; 5 - wskaźnik sygnału.

Fotokolorymetry, w zależności od liczby fotokomórek zastosowanych w pomiarach, dzielą się na dwie grupy: jednowiązkowe (jednoramienne) - urządzenia z jedną fotokomórką i dwuwiązkowe (dwuramienne) - z dwiema fotokomórkami.

Dokładność pomiaru uzyskana za pomocą jednowiązkowych FEC jest niska. W fabrykach i laboratoriach naukowych najczęściej stosuje się instalacje fotowoltaiczne wyposażone w dwie fotokomórki. Konstrukcja tych urządzeń opiera się na zasadzie wyrównywania natężenia dwóch wiązek światła za pomocą zmiennej przysłony szczelinowej, czyli zasadzie optycznej kompensacji dwóch strumieni świetlnych poprzez zmianę otwarcia źrenicy przysłony.

Schemat ideowy urządzenia pokazano na ryc. 2. Światło żarówki 1 jest rozdzielane na dwie równoległe wiązki za pomocą zwierciadeł 2. Te wiązki światła przechodzą przez filtry świetlne 3, kuwety z roztworami 4 i padają na fotokomórki 6 i 6", które zgodnie z obwodem różnicowym są podłączone do galwanometru 8. Przysłona szczelinowa 5 zmienia intensywność strumienia świetlnego padającego na fotokomórkę 6. Fotometryczny klin neutralny 7 służy do tłumienia strumienia świetlnego padającego na fotokomórkę 6".

Ryc.2. Schemat fotoelektrokolorymetru dwuwiązkowego

Oznaczanie stężeń w fotoelektrokolorymetrii

Aby określić stężenie analitów w fotoelektrokolorymetrii, stosuje się:

Metoda porównywania gęstości optycznych roztworów barwnych wzorcowych i testowych;

Metoda wyznaczania na podstawie średniej wartości molowego współczynnika absorpcji światła;

Metoda krzywej kalibracyjnej;

Metoda addytywna.

Metoda porównywania gęstości optycznych roztworów barwnych wzorcowych i testowych

Do oznaczenia należy przygotować roztwór wzorcowy analitu o znanym stężeniu, które jest zbliżone do stężenia roztworu badanego. Wyznacz gęstość optyczną tego roztworu przy określonej długości fali D fl. Następnie określa się gęstość optyczną badanego roztworu Dx przy tej samej długości fali i przy tej samej grubości warstwy. Porównując gęstość optyczną roztworów testowych i referencyjnych, stwierdza się nieznane stężenie analitu.

Metoda porównawcza ma zastosowanie do pojedynczych analiz i wymaga bezwzględnego przestrzegania podstawowego prawa absorpcji światła.

Metoda wykresu kalibracji. Aby określić stężenie substancji tą metodą, należy przygotować serię 5-8 roztworów wzorcowych o różnych stężeniach. Przy wyborze zakresu stężeń roztworów wzorcowych stosuje się następujące zasady:

* musi obejmować obszar możliwych pomiarów stężenia badanego roztworu;

* gęstość optyczna roztworu testowego powinna odpowiadać w przybliżeniu środkowi krzywej kalibracyjnej;

* pożądane jest, aby w tym zakresie stężeń przestrzegane było podstawowe prawo absorpcji światła, czyli wykres zależności miał charakter liniowy;

*wartość gęstości optycznej musi mieścić się w przedziale 0,14...1,3.

Zmierz gęstość optyczną roztworów wzorcowych i wykreśl zależność D(C) . Ustaliwszy Dx badanego rozwiązania, zgodnie ze znalezioną krzywą kalibracyjną Cx (ryc. 3).

Metoda ta umożliwia określenie stężenia substancji nawet w przypadkach, gdy nie jest przestrzegana podstawowa zasada absorpcji światła. W tym przypadku przygotowuje się dużą liczbę roztworów wzorcowych, różniących się stężeniem nie większym niż 10%.

Ryż. 3. Zależność gęstości optycznej roztworu od stężenia (krzywa kalibracyjna)

Metoda addytywna- jest to rodzaj metody porównawczej polegającej na porównaniu gęstości optycznej roztworu badawczego i tego samego roztworu z dodatkiem znanej ilości oznaczanej substancji.

Służy do eliminacji zakłócającego wpływu zanieczyszczeń obcych oraz do oznaczania małych ilości analitu w obecności dużych ilości substancji obcych. Metoda wymaga obowiązkowego przestrzegania podstawowego prawa absorpcji światła.

Spektrofotometria

Jest to metoda analizy fotometrycznej, w której zawartość substancji określa się na podstawie absorpcji przez nią światła monochromatycznego w zakresie widma widzialnego, UV i IR. W spektrofotometrii, w przeciwieństwie do fotometrii, monochromatyzację zapewniają nie filtry światła, ale monochromatory, które umożliwiają ciągłą zmianę długości fali. Jako monochromatory stosuje się pryzmaty lub siatki dyfrakcyjne, które zapewniają znacznie wyższą monochromatyczność światła niż filtry świetlne, dzięki czemu dokładność oznaczeń spektrofotometrycznych jest większa.

Metody spektrofotometryczne w porównaniu do metod fotokolorymetrycznych pozwalają na rozwiązywanie szerszego zakresu problemów:

* przeprowadzać ilościowe oznaczanie substancji w szerokim zakresie długości fal (185-1100 nm);

* przeprowadzać analizy ilościowe układów wieloskładnikowych (jednoczesne oznaczanie kilku substancji);

* określić skład i stałe trwałości kompleksowych związków pochłaniających światło;

* określić właściwości fotometryczne związków pochłaniających światło.

W przeciwieństwie do fotometrów monochromatorem w spektrofotometrach jest pryzmat lub siatka dyfrakcyjna, która umożliwia ciągłą zmianę długości fali. Istnieją przyrządy do pomiarów w zakresie widzialnym, UV i IR widma. Schemat ideowy spektrofotometru jest praktycznie niezależny od obszaru widmowego.

Spektrofotometry, podobnie jak fotometry, występują w wersjach jedno- i dwuwiązkowych. W urządzeniach z podwójną wiązką strumień światła jest w jakiś sposób rozdzielany albo wewnątrz monochromatora, albo na wyjściu z niego: jeden strumień przechodzi następnie przez roztwór testowy, drugi przez rozpuszczalnik.

Przyrządy jednowiązkowe są szczególnie przydatne do oznaczeń ilościowych opartych na pomiarach absorbancji przy jednej długości fali. W tym przypadku istotną zaletą jest prostota urządzenia i łatwość obsługi. Większa szybkość i łatwość pomiaru podczas pracy z instrumentami z podwójną wiązką są przydatne w analizie jakościowej, gdy w celu uzyskania widma należy zmierzyć gęstość optyczną w dużym zakresie długości fal. Dodatkowo urządzenie dwuwiązkowe można łatwo przystosować do automatycznej rejestracji stale zmieniającej się gęstości optycznej: wszystkie nowoczesne spektrofotometry rejestrujące wykorzystują w tym celu układ dwuwiązkowy.

Zarówno przyrządy jednowiązkowe, jak i dwuwiązkowe nadają się do pomiarów światła widzialnego i UV. Produkowane na rynku spektrofotometry IR zawsze opierają się na konstrukcji dwuwiązkowej, ponieważ zwykle służą do skanowania i rejestracji dużego obszaru widma.

Analizę ilościową układów jednoskładnikowych przeprowadza się tymi samymi metodami, co w fotoelektrokolorymetrii:

Porównując gęstości optyczne roztworów wzorcowych i testowych;

Metoda wyznaczania na podstawie średniej wartości molowego współczynnika absorpcji światła;

Stosując metodę wykresu kalibracyjnego,

i nie posiada cech charakterystycznych.

Spektrofotometria w analizie jakościowej

Analiza jakościowa w nadfioletowej części widma. Widma absorpcji ultrafioletu mają zwykle dwa lub trzy, czasem pięć lub więcej pasm absorpcji. Aby jednoznacznie zidentyfikować badaną substancję, rejestruje się jej widmo absorpcji w różnych rozpuszczalnikach, a uzyskane dane porównuje z odpowiadającymi im widmami podobnych substancji o znanym składzie. Jeżeli widma absorpcji badanej substancji w różnych rozpuszczalnikach pokrywają się z widmem znanej substancji, wówczas z dużym prawdopodobieństwem można wyciągnąć wniosek na temat tożsamości składu chemicznego tych związków. Aby zidentyfikować nieznaną substancję na podstawie jej widma absorpcyjnego, konieczne jest posiadanie wystarczającej liczby widm absorpcyjnych substancji organicznych i nieorganicznych. Istnieją atlasy pokazujące widma absorpcyjne wielu substancji, głównie organicznych. Szczególnie dobrze zbadano widma ultrafioletowe węglowodorów aromatycznych.

Identyfikując nieznane związki należy zwrócić także uwagę na intensywność wchłaniania. Wiele związków organicznych ma pasma absorpcji, których maksima znajdują się przy tej samej długości fali λ, ale ich intensywności są różne. Przykładowo w widmie fenolu występuje pasmo absorpcji przy λ = 255 nm, dla którego molowy współczynnik absorpcji przy maksimum absorpcji wynosi ε maks= 1450. Przy tej samej długości fali aceton ma pasmo, dla którego ε maks = 17.

Analiza jakościowa w widzialnej części widma. Identyfikację substancji barwnej, takiej jak barwnik, można również przeprowadzić poprzez porównanie jej widma absorpcji w świetle widzialnym z widmem podobnego barwnika. Widma absorpcyjne większości barwników opisane są w specjalnych atlasach i instrukcjach. Z widma absorpcyjnego barwnika można wyciągnąć wniosek o czystości barwnika, gdyż w widmie zanieczyszczeń występuje szereg pasm absorpcyjnych, których w widmie barwnika nie ma. Z widma absorpcyjnego mieszaniny barwników można również wyciągnąć wnioski na temat składu mieszaniny, zwłaszcza jeśli widma składników mieszaniny zawierają pasma absorpcji zlokalizowane w różnych obszarach widma.

Analiza jakościowa w zakresie podczerwieni widma

Absorpcja promieniowania IR wiąże się ze wzrostem energii drgań i rotacji wiązania kowalencyjnego, jeśli prowadzi to do zmiany momentu dipolowego cząsteczki. Oznacza to, że prawie wszystkie cząsteczki posiadające wiązania kowalencyjne są w takim czy innym stopniu zdolne do absorpcji w obszarze IR.

Widma w podczerwieni wieloatomowych związków kowalencyjnych są zwykle bardzo złożone: składają się z wielu wąskich pasm absorpcyjnych i bardzo różnią się od konwencjonalnych widm UV i widzialnego. Różnice wynikają z natury interakcji pomiędzy cząsteczkami absorbującymi a ich otoczeniem. Ta interakcja (w fazach skondensowanych) wpływa na przejścia elektronowe w chromoforze, dlatego linie absorpcyjne rozszerzają się i mają tendencję do łączenia się w szerokie pasma absorpcji. Natomiast w widmie IR częstotliwość i współczynnik absorpcji odpowiadający pojedynczemu wiązaniu zwykle niewiele się zmieniają wraz ze zmianami w środowisku (w tym zmianami w pozostałych częściach cząsteczki). Linie również się rozszerzają, ale nie na tyle, aby połączyć się w pasek.

Zazwyczaj podczas konstruowania widm IR transmitancję wykreśla się na osi Y jako wartość procentową, a nie gęstość optyczną. Dzięki tej metodzie konstruowania pasma absorpcji pojawiają się jako zagłębienia na krzywej, a nie jako maksima w widmach UV.

Tworzenie widm w podczerwieni jest związane z energią wibracyjną cząsteczek. Wibracje mogą być kierowane wzdłuż wiązania walencyjnego pomiędzy atomami cząsteczki i w takim przypadku nazywane są wartościowością. Wyróżnia się drgania rozciągające symetryczne, w których atomy wibrują w tych samych kierunkach, oraz drgania rozciągające asymetryczne, w których atomy wibrują w przeciwnych kierunkach. Jeśli drgania atomowe występują wraz ze zmianą kąta między wiązaniami, nazywa się je deformacją. Podział ten jest bardzo dowolny, ponieważ podczas drgań rozciągających kąty ulegają w takim czy innym stopniu odkształceniu i odwrotnie. Energia drgań zginających jest zwykle mniejsza od energii drgań rozciągających, a pasma absorpcyjne wywołane drganiami zginającymi zlokalizowane są w obszarze fal dłuższych.

Drgania wszystkich atomów cząsteczki powodują powstawanie pasm absorpcyjnych, które są indywidualne dla cząsteczek danej substancji. Jednak wśród tych wibracji można wyróżnić drgania grup atomów, które są słabo powiązane z wibracjami atomów reszty cząsteczki. Pasma absorpcji wywołane takimi drganiami nazywane są pasmami charakterystycznymi. Z reguły obserwuje się je w widmach wszystkich cząsteczek zawierających te grupy atomów. Przykładem charakterystycznych pasm są pasma przy 2960 i 2870 cm -1. Pierwsze pasmo wynika z asymetrycznych drgań rozciągających wiązania C-H w grupie metylowej CH3, a drugie z symetrycznych drgań rozciągających wiązania C-H tej samej grupy. Takie pasma z niewielkim odchyleniem (±10 cm -1) obserwuje się w widmach wszystkich węglowodorów nasyconych i ogólnie w widmie wszystkich cząsteczek zawierających grupy CH3.

Inne grupy funkcyjne mogą mieć wpływ na położenie pasma charakterystycznego, a różnica częstotliwości może dochodzić do ±100 cm -1, ale takich przypadków jest nielicznych i można je uwzględnić na podstawie danych literaturowych.