Amino asitlerin karşılaştırmalı kalitatif analizi. Amino asitlere, peptitlere, proteinlere kalitatif reaksiyonlar Amino asitlerin kantitatif tayini
Amino asitleri belirleme yöntemleri
Amino asitler biyolojik olarak aktif maddeler, onlar oynuyorlar büyük rol insan vücudunun yaşamında yaygın olarak kullanılırlar ilaçlar. Bazıları esastır ve vücuda yiyecekle girer. Günümüzde tıbbi ürünlerde amino asitlerin kantitatif tayini için çok sayıda yöntem bulunmaktadır. bitkisel hammaddeler, V ilaçlar ve gıda ürünlerindeki biyolojik sıvılar.
Çeşitli nesnelerdeki amino asitlerin kantitatif belirlenmesine yönelik çeşitli yöntemlerden dört ana grup ayırt edilebilir: kromatografik, spektrofotometrik, titrimetrik ve elektrokimyasal yöntemler analiz.
Kromatografik yöntemler
Arka son on yıllar Amino asitlerin gaz-sıvı kromatografisi alanında önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. Göreceli olarak izin veren, mikro paketlenmiş sütunları kullanan bir yöntem önerilmiştir. Kısa bir zaman biyolojik olarak önemli 17 a-amino asidi neredeyse tamamen ayırır.
Serum, plazma, idrar ve serum örneklerinde gaz-sıvı kromatografisi kullanılarak amino asitlerin belirlenmesi için bir yöntem geliştirilmiştir. Beyin omurilik sıvısı 2,3,4,5,6-pentaflorobenzoil-izobütil eterlerin hazırlanmasını ve ardından bir alev iyonizasyon detektörü ile 140°C ila 250°C sıcaklık programlama modunda bir polidimetilsiloksan sütununda ayırmayı temel alır. Kromatografik ayırma süresi 28 dakikadır. Araştırma sonucunda 27 amino asit ayrıştırıldı.
Amino asitlerin analizi için yüksek performanslı sıvı kromatografi yöntemlerinin çeşitliliğine rağmen, en hızlı ve erişilebilir olanı spektrofotometrik tespitli ters fazlı versiyondur. Başarılı bir ayırma ve tespit için amino asitler hidrofobik ve ışık emici türevlere dönüştürülür, yani kolon öncesi türevlendirme gerçekleştirilir. Türetme reaktifleri olarak ortoftalik aldehit, naftalin-2,3-dikarboksaldehit ve 9-florenilmetilkloroformat kullanılır.
Antianjinal etki ile kombinasyon halinde antioksidan aktiviteye sahip olan "Eltacin" ilacında L-sistin, L-glutamik asit ve glisin miktarının belirlenmesi için bir yöntem geliştirilmiştir. Glutamik asit ve glisin, ortoftalikdehit/N-asetil-L-sistein reaktifi ile kolon öncesi türevlendirme sonrasında ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile belirlendi. Yazarlara göre sisteinin türetilmesi, amino asidin kendisinin ve ortaya çıkan türevlerin kararsızlığı nedeniyle zordur. Bu nedenle bromatometrik titrasyonla sistein analizi yapıldı. Numunede varlığı tespit edildi önemli miktarlar sistein, glisin ve glutamik asidin ortoftalikdehit / N-asetil-L-sistein reaktifi ile türevlendirme ürünlerinin belirlenmesine müdahale etmez. Yöntem, yüksek tekrarlanabilirlik ve belirleme doğruluğu ile karakterize edilir.
4,7-fenantrolin-5,6-dion'un (fankinon), yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile amino asitlerin ayrılması ve kantitatif analizi amacıyla türevlerinin kolon öncesi oluşumu için florojenik etiketleme reaktifi olarak kullanılma olasılığı ortaya çıktı. araştırıldı. Kendiliğinden floresansı olmayan fankinon, amino asitlerin amino gruplarıyla (68°C'de 160 dakika boyunca) reaksiyona girerek, floresansı 460 nm dalga boyunda ölçülen iminokinolleri oluşturur. İzole edilen türevler Tm, IR, kütle ve PMR spektrumları ile tanımlandı. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi, bir floresan detektörlü bir kromatograf ve aşağıdaki karışımlarla gradyan elüsyonlu bir kolon üzerinde gerçekleştirildi: trietilamin çözeltisi - fosfat tamponu (pH 3) - metanol. Kinidin dahili standart olarak kullanıldı. Bu method büyük laboratuvarlarda oldukça umut vericidir ve bitmiş dozaj formlarındaki amino asitlerin analizi için önerilebilir.
Lisinin kantitatif tespiti için potansiyometrik biyosensörlü yüksek performanslı bir sıvı kromatografi tekniği geliştirilmiştir. Biyosensör, lizin oksidaz içeren bir membranın iyon seçici bir NH4+ elektroduna bağlanmasıyla oluşturulur. Lizinin enzimatik bozunması sırasında oluşan amonyum iyonları potansiyometrik olarak tespit edilir. Kültür sıvılarındaki triptofanın analizi için kromatodensitometrik bir ekspres yöntem geliştirilmiştir. İnce tabaka kromatografisi Sorbfil plakaları üzerinde gerçekleştirildi. Kromatografi, propanol-2 - %25 amonyum hidroksit çözeltisi (7:3) sisteminde 25 dakika süreyle gerçekleştirildi. Kromatogramlar kurutuldu oda sıcaklığı ve 120°C'de 15 dakika bekletildi. Kromatogramlardaki lekeleri tespit etmek için,% 5 konsantre sülfürik asit ilavesiyle% 0,5'lik bir etanol çözeltisi formunda, triptofanın indol halkası için seçici olan 4-dimetilaminobenzaldehit gibi spesifik bir reaktif kullanıldı. Kromatogramlar, yeni hazırlanmış bir 4-dimetilaminobenzaldehit çözeltisi ile bir Teflon küvete daldırılarak geliştirildikten sonra, 110°C sıcaklıkta 5-7 dakika tutuldu. Triptofan noktalarının taranması, bir bilgisayar video yoğunluk ölçer üzerinde 625 nm dalga boyunda gerçekleştirildi. Geliştirilen yönteme rağmen yüksek doğruluk triptofana özel tanımlar ve performans.
Biyolojik sıvılarda, ilaçlarda ve gıda ürünlerinde β-amino asitlerin analizi için, karmaşık bir karışımın bileşenlerinin, uygulanan bir elektrik alanının etkisi altında bir kuvars kılcal içindeki ayrılmasına dayanan kılcal elektroforez yöntemleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Amino asitler zwitteriyonik yapıda olduğundan, uygun pH değerine sahip elektrolit tampon çözeltileri kullanılarak ayrılabilirler, çoğunlukla nötr ve bazik ayırma tamponları kullanılır.
Bireysel β-amino asitlerin analizi için kılcal elektroforez yönteminin özgüllüğünü ve hassasiyetini arttırmak amacıyla, bunların ön türevlendirilmesi kullanılır, ardından kuvars kılcalda ayırma ve reaksiyon ürünlerinin spektrofotometrik tespiti yapılır. Bu nedenle türevlendirme maddeleri olarak 9-florenil metil format, 9-(2-karbazol)-etil kloroformat ve siyanin boyası kullanılır. Yöntemin geleceği, hızlı analiz, numune hazırlama kolaylığı, reaktif tüketiminin düşük olması ve enstrümantasyonun basitliği gibi avantajlardan kaynaklanmaktadır.
Amino asitler renk reaksiyonları kullanılarak tespit edilebilir: ninhidrin, ksantoprotein, Foly, Milone, biüre testi vb. Bu reaksiyonlar spesifik değildir çünkü keşfe dayalı bireysel parçalar diğer bileşiklerde de bulunabilen amino asitlerin yapısında bulunur.
Ninhidrin reaksiyonu Amino asitlerin, imino asitlerin ve aminlerin niteliksel ve niceliksel olarak belirlenmesi için kullanılan bir renk reaksiyonu. Isıtıldığında alkali ortam ninhidrin (tricetohidrin dihidrat, C9HbO4), birincil amino gruplarına (-NH2) sahip maddelerle birlikte, maksimum emilimi yaklaşık 570 olan stabil, yoğun mavi-mor bir renge sahip bir ürün oluşur. nm. Bu dalga boyundaki absorpsiyon, serbest amino gruplarının sayısına doğrusal olarak bağlı olduğundan, ninhidrin reaksiyonu, bunların kolorimetri veya spektrofotometri ile niceliksel olarak belirlenmesi için temel oluşturdu. Bu reaksiyon aynı zamanda imino asitlerdeki (prolin ve hidroksiprolin) ikincil amino gruplarını (>NH) belirlemek için de kullanılır; bu durumda parlak sarı bir ürün oluşur. Hassasiyet - %0,01'e kadar. Modern otomatik amino asit analizi, amino asitlerin iyon değişimiyle ayrılması ve bunların niceliksel belirlenmesinin ninhidrin reaksiyonu kullanılarak birleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Amino asit karışımlarını kağıt kromatografisi kullanarak ayırırken, her bir amino asidin en az 2-5 μg miktarında belirlenmesini mümkün kılar.
Rengin yoğunluğu amino asitlerin miktarını belirlemek için kullanılabilir.
Bu reaksiyon sadece serbest amino asitlerle değil aynı zamanda peptitler, proteinler vb. ile de pozitiftir.
Ksantoprotein reaksiyonu aromatik çekirdekteki elektrofilik ikame reaksiyonuna (nitrasyon) dayalı olarak aromatik amino asitlerin (fenilalanin, tirozin, histidin, triptofan) tespitine olanak tanır.
Konsantreye maruz kaldığında Nitrik asitörneğin tirozin sarı renkli bir ürün üretir.
Foll reaksiyonu. Bu sistein ve sistine bir reaksiyondur. Alkali hidroliz sırasında, sistein ve sistin içindeki "zayıf bağlı kükürt" oldukça kolay bir şekilde ayrılarak, alkali ile reaksiyona girerek sodyum veya potasyum sülfürler üreten hidrojen sülfit oluşumuyla sonuçlanır. Kurşun(II) asetat eklendiğinde gri-siyah bir kurşun(II) sülfür çökeltisi oluşur.
Deneyimin açıklaması. Bir test tüpüne 1 ml sistin çözeltisi dökülür, üzerine 0,5 ml %20'lik sodyum hidroksit çözeltisi eklenir. Karışım kaynama noktasına kadar ısıtılır ve daha sonra 0,5 ml kurşun(II) asetat çözeltisi ilave edilir. Gri-siyah bir kurşun(II) sülfür çökeltisi gözlenir:
Zimmerman'ın tepkisi. Bu, amino asit glisinine bir reaksiyondur.
Deneyimin açıklaması. pH = 8'e %10 alkali çözelti eklenerek ayarlanan 2 ml %0,1 glisin çözeltisine 0,5 ml ekleyin sulu çözelti o-ftalik dialdehit. Reaksiyon karışımı yavaş yavaş parlak yeşile dönmeye başlar. Birkaç dakika sonra yeşil bir çökelti belirir.
Triptofana reaksiyon. Asidik ortamda aldehitlerle reaksiyona giren triptofan, renkli yoğunlaşma ürünleri oluşturur. Örneğin, glioksilik asit (konsantre asetik asit karışımıdır) ile reaksiyon aşağıdaki denkleme göre ilerler:
Triptofanın formaldehit ile reaksiyonu benzer bir şemaya göre ilerler.
Sakaguchi'nin tepkisi. Arginin amino asidine verilen bu reaksiyon, argininin bir oksitleyici madde varlığında a-naftol ile etkileşimine dayanmaktadır. Mekanizması henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Görünüşe göre reaksiyon aşağıdaki denkleme göre gerçekleştiriliyor:
Kinonimin türevlerinden beri (içinde bu durumdaİmino grubunun -NH- hidrojeninin bir alkil veya aril radikali ile değiştirildiği naftakinon) her zaman sarı-kırmızı renktedir, bu durumda Sakaguchi reaksiyonu sırasında çözeltinin turuncu-kırmızı rengi görünüşe göre şu şekilde açıklanmaktadır: naftokinon imin türevinin görünümü. Bununla birlikte, arginin kalıntısının geri kalan NH gruplarının ve a-naftolün benzen halkasının daha fazla oksidasyonu nedeniyle daha da karmaşık bir bileşiğin oluşma olasılığı göz ardı edilemez:
Deneyimin açıklaması. Bir test tüpüne 2 ml %0,01 arginin çözeltisi dökülür, ardından 2 ml %10 sodyum hidroksit çözeltisi ve birkaç damla %0,2 eklenir. alkol solüsyonu a-naftol. Test tüpünün içeriği iyice karıştırılır, 0,5 ml hipobromit çözeltisi ilave edilerek tekrar karıştırılır. Hızla gelişen turuncu-kırmızı rengi stabilize etmek için hemen 1 ml %40 üre çözeltisi ekleyin.
Biüre reaksiyonu– proteinlere renk reaksiyonu olarak kullanılır. Bakır(II) tuzlarının bulunduğu alkali ortamda mor renk verirler. Renk, peptit grubundan dolayı bir bakır(II) kompleksi bileşiğinin oluşmasından kaynaklanmaktadır. -CO-NH- proteinlerin karakteristik özelliğidir. Bu reaksiyon adını, üre amonyağın ortadan kaldırılmasıyla ısıtıldığında oluşan bir üre türevi olan biüreden almıştır:
Proteinlere ve biürete ek olarak, aynı renk, bu grubu içeren diğer bileşikler tarafından da verilir: amidler, imitler karboksilik asitler molekülde -CS-NH- veya =CH-NH- gruplarını içeren bileşiklerin yanı sıra. Proteinler, bazı amino asitler, peptitler, biüre ve orta peptonlar da reaksiyona girer.
Çeşitli peptitlerle biüre reaksiyonuyla elde edilen kompleksin rengi biraz farklıdır ve peptit zincirinin uzunluğuna bağlıdır. Zincir uzunluğu dört amino asit kalıntısı ve üzerinde olan peptitler kırmızı bir kompleks oluşturur, tripeptitler mor ve dipeptitler mavidir.
polipeptidin keton formu
polipeptidin enol formu
Bir polipeptit Cu(OH)2 ile etkileşime girdiğinde yapısı aşağıdaki gibi gösterilebilecek bir kompleks oluşur.
Ve proteinler
Kanonik a-amino asitlerin 20 çeşidinin tamamının, üç farklı fonksiyonel grupla aynı yapıya sahip olduğu bilinmektedir (Şekil 3.3). Ne yazık ki amino ve karboksi gruplarına verilen reaksiyonlar çok spesifik değildir çünkü buna göre tüm aminlerin, bir takım amidlerin ve karboksilik asitlerin karakteristiğidirler. Aynısı, çoğu kimyasal olarak inert olan, alifatik = hidrokarbon grupları ile temsil edilen, 10'u polar olmayan radikallerinin çoğu = R için de geçerlidir. Alkol (Ser, Tre, Tyr), amid (Asn, Gln) ve karboksi grupları (Asp, Glu) içeren çoğu R polar amino asidin özgüllüğü de nispeten düşüktür. Amino grubu (Lys), imidazol His ve guanidino grubu Arg daha aktiftir ve tiyo grubu Cys'in aktivitesi maksimumdur. Bu nedenle en büyük pratik önemi Amino asit analizörleri de dahil olmak üzere a-amino asitlerin niteliksel ve niceliksel analizinde, a-C atomunda hem amino hem de karboksi gruplarının eşzamanlı varlığına özgü evrensel bir ninhidrin reaksiyonu elde edildi.
Pirinç. 3.3. Genel formüllerα-amino asitlerin yapıları ve bunların polimerizasyon ürünleri. Metindeki açıklamalar.
α-amino asitlerin peptitlerin ve proteinlerin yapısına polimerizasyonu (Şekil 3.3) tüm R tiplerini korur, ancak:
1. Ninhidrin reaksiyonu negatif olur çünkü N- ve C-terminal olanlar hariç, a-amino ve a-karboksi grupları, peptid bağlarının oluşumuna harcanır. Protein ile pozitif bir ninhidrin reaksiyonu büyük olasılıkla preparasyon veya kapta amino asit safsızlıklarının varlığını gösterir.
2. Tüm peptitler ve proteinler için biüre reaksiyonu, monomerik amino asitlerde bulunmayan bir peptit grubuna özgüdür.
3. R amino asitlerine yönelik daha spesifik reaksiyonlardan aşağıdakiler faydalıdır: konsantre nitrik asit ile aromatik R Fen, Tyr, Tri'ye ksantoprotein reaksiyonu; beş üyeli Pro halkasında isatin ile reaksiyonun yanı sıra imidazol R His, tiyo grubu Cys ve guanidino grubu Arg üzerindeki reaksiyonlar. Bu R'lerden bazılarının protein globüllerinin içinde saklı olduğunu ve dolayısıyla onlara verilen niteliksel reaksiyonların zayıfladığını hesaba katmak önemlidir. Bu nedenle, gerçekleştirilmeden önce proteinler genellikle şu veya bu şekilde denatüre edilir.
4. Gerçek amino asit çözeltilerinin aksine, kolloidal çözümler proteinler karakteristiktir tortul reaksiyonlar hidrasyon kabuklarının tahrip olması ve bunun sonucunda su giderici maddelerin etkisi altında çözünürlüklerinin azalmasıyla ilişkilidir: nötr tuzlar = tuzlanma, metanol = MeOH, etanol = EtOH, aseton, üre ve diğer maddeler.
Niteliksel reaksiyonlar gerçekleştirirken şunları yapmalısınız:
1. Kurallara dikkatlice uyun yangın Güvenliği ve konsantre asitler ve alkalilerle çalışın = EZh.
2. 2 sıra test tüpünü bir cam grafik veya keçeli kalemle işaretleyin ve bunlardan birine 0,5 ml'den (2-5 damla) fazla olmayacak şekilde %1'lik amino asit solüsyonu ve yaklaşık olarak 1 litrelik tüple aynı hacimde yerleştirin. diğerinde % protein çözeltisi.
3. Amino asit ve protein çözeltileri içeren bir çift test tüpüne, karşılık gelen reaktiflerden 3-5 damla paralel olarak ekleyin ve karşılık gelen reaksiyon için belirtilen geri kalan prosedürleri uygulayın.
4. Test tüplerinin ısıtılması gerekiyorsa potanın kapağını çıkarın ve kuru yakıtı kibritle yakın. Daha sonra test tüpünü, ilkel tasarımı çok güvenilmez olan bir tutucuya kelepçeleyin. Bu nedenle, birkaç test tüpünü şeritler halinde katlanmış bir kağıt parçasıyla sarmak ve bunları tutmak daha iyidir. baş parmak, test tüplerinin alt yarısını eşit şekilde alevden geçirin, Boyunları komşulara doğrultmaktan ve çözeltinin şiddetli şekilde kaynamasına neden olmaktan kaçınmak. İşlemi tamamladıktan sonra pota kapağını kullanarak alevi derhal söndürün.
5. Deneylerin sonuçları şablona uygun olarak hazırlanmıştır. laboratuvar defterinin yayılması üzerine tablo şeklinde:
6. Elde edilen sonuçları değerlendirdikten ve protokolü tamamladıktan sonra bunları bir raf test tüpüyle birlikte koruma için öğretmene sunun.
1. Ninhidrin reaksiyonu.α-amino asitlerin bir ninhidrin alkol çözeltisi ile deaminasyonu ve dekarboksilasyonuna dayanmaktadır:
Ortaya çıkan amonyak, iki molekül ninhidrin ile reaksiyona girerek maksimum 540 nm'de (Pro - 440 nm) emilimi olan renkli bir türev oluşturur.
İlerlemek: Test örneklerine 3-5 damla %0,5 alkol ninhidrin çözeltisi ekleyin. Karışımlarla birlikte test tüplerini ateşte yavaşça ısıtın ve 2-3 dakika sonra rengin görünümünü kaydedin.
2. Ksantoprotein reaksiyonu. Yukarıda bahsedildiği gibi aromatik R: Fen, Tyr, Tri ile amino asitlerin nitro türevlerinin oluşmasına dayanır.
İlerlemek: Çeker ocak taslağını açarak, test solüsyonlarıyla birlikte bir çift test tüpüne dikkatlice birkaç damla konsantre nitrik asit (HNO 3) ekleyin. Boyunlarını komşulara doğrultmaktan kaçınarak test tüplerini ateşte yavaşça ısıtın ve renk gelişimini kaydedin.
3. Nitroprussid reaksiyonu. Taze hazırlanmış bir sodyum nitroprussid çözeltisi ile kırmızı bir kompleks veren sodyum sülfürün (Na2S) salınmasıyla kükürt içeren amino asit sisteinin alkalin hidrolizine dayanır.
İlerlemek: Her iki test tüpüne 5-10 damla test solüsyonu ekleyin eşit hacim% 20 kostik soda ve en az 3-5 dakika kaynatın. Test tüplerine 3-5 damla sodyum nitroprussid çözeltisi ekleyin ve renk gelişimini kaydedin.
4. Biüre reaksiyonu. Alkali bir ortamda Cu2+ iyonu ile renkli bir peptit bağı kompleksinin oluşmasına dayanır. Solüsyonlardaki peptitleri ve proteinleri tanımlamak için evrensel bir test görevi görür. Peptit bağlarının sayısı arttıkça çözeltinin renk yoğunluğu doğrusal olarak arttığından, protein konsantrasyonlarının fotometrik belirlenmesinde yaygın olarak kullanılır.
İlerlemek. Aynı miktarda %10'luk sodyum hidroksit çözeltisini 5-10 damla test çözeltisiyle birlikte test tüplerine ekleyin. İyice karıştırın ve 2 damla %1 bakır sülfat çözeltisi (CuSO 4) ekleyin. Örnekleri karıştırın ve birkaç dakika sonra renk gelişimini kaydedin.
5. Kaynama testi. Proteinlerin termal denatürasyonuna dayanır.
İlerlemek. Her iki test tüpünü de %1'lik solüsyondan en fazla bir damla içeren test solüsyonlarıyla asitleştirin. asetik asit(AcOH) ve kaynayana kadar ısıtın. Çözeltileri 2-3 dakika kaynattıktan sonra sonuçları kaydedin ve olayın mekanizmasını açıklayın.
6. Ağır metal tuzları ile çökeltme(Meh) . Denatüre edici özellikleri, ağır Me katyonlarının protein molekülünün R fonksiyonel grupları ile reaksiyona girme yeteneğine dayanmaktadır: tiyo-, amino-, karboksi-, aromatik. Ayrıca güçlü anyonları, protein moleküllerindeki iyonik grupların yeniden yüklenmesine neden olarak içlerindeki iyonik bağları yok eder.
İlerlemek. Test çözeltileriyle birlikte her iki test tüpüne birkaç damla %5 bakır sülfat çözeltisi (CuSO 4) ekleyin. Elde edilen sonuçları kaydedin ve açıklayın.
7. Organik asitlerle çökeltme. Proteinlerin asit denatürasyonuna ve R amino asitlerin tio-, amino- ve aromatik gruplarının organoklorinlerle kovalent türevlerinin oluşumuna dayanır.
İlerlemek. Test solüsyonlarının bulunduğu test tüplerine birkaç damla %10 trikloroasetik asit (TCA) solüsyonu ekleyin ve birkaç dakika sonra sonuçları kaydedin.
Ekipman ve reaktif: kromatografi kağıdı; kromatografi odası; fotoelektrik kolorimetre; makas; cam plakalar (3´32 cm) - 3 adet; kromatogramlar için tutucu; kurutma kabini; mikropipetler; toprak durduruculu test tüpleri; büret 25 ml; amino asitlerin standart karışımı; amino asitlerin test karışımı; 15:3:7 oranında bütanol, asetik asit, su; %95 asetonda %1 ninhidrin çözeltisi; bakır sülfatla doyurulmuş etil alkol (%75).
İşin tamamlanması
18 x 28 cm ölçülerinde bir kromatografi kağıdı alın ve kısa kenarından 3 cm mesafede basit bir kalemle yatay bir çizgi çizin. Daha sonra ekteki şemaya uygun olarak eşit olmayan bölümlere ayrılarak standart ve test karışımlarının uygulama sınırları oklarla işaretlenir ve karşılık gelen yazılar basit kalemle yapılır.
Kağıt masa yüzeyinin üzerinde güçlendirilir ve standart karışım ilk önce oklarla sınırlandırılmış olarak başlangıç çizgisine, özel bir mikropipet kullanılarak mikropipetteki tüm çözelti başlangıç çizgisine aktarılıncaya kadar ince bir çizgi halinde uygulanır (mikropipet 2-3 cm'ye kadar doldurulmuş). Uygulanan çözeltinin kütlesi, standart karışımla doldurulmuş (çözeltiyi uygulamadan önce) ve boş (çözeltiyi uyguladıktan sonra) pipetin tartılmasıyla ölçülür. Kağıda genellikle 0,02-0,03 g standart çözelti uygulanır. Daha sonra temiz bir pipeti amino asitlerin (öğretmen tarafından çalışma için verilen) test karışımıyla doldurun, tartın ve karışımı uygun işaretin bulunduğu başlangıç çizgisine uygulayın.
Hazırlanan kromatogram, bir amino asit karışımını, örneğin 15:3:7 oranında bir bütanol, asetik asit ve su karışımını ayırmak için önceden içine dökülmüş bir solvent sistemi ile bir kromatografi odasına yerleştirilir. Ayırma, ön çizgi kromatografi kağıdının üst kenarına (bitiş çizgisi) 2-3 cm'ye ulaşana kadar artan kromatografiyle gerçekleştirilir. Bundan sonra kromatogram odadan çıkarılır ve kağıdın üst ucu hemen kauçuk bir halka ile tutturulmuş üç cam çubuktan oluşan bir tutucuya yerleştirilir ve kağıttan solventlerin uzaklaştırılması için 20 dakika boyunca çeker ocakta tutulur.
Pirinç. 8. Kromatogramdaki amino asitlerin düzenlenme şeması:
A - bir amino asit karışımının uygulama noktası; I - sistin ve sistein;
2 - lizin; 3 - histidin; 4 - arginin; 5 - aspartik asit,
seri ve glisin; 6 - glutamik asit ve treonin; 7 - alanin;
8 - prolin; 9 - tirozin; 10 - valin ve metiyonin; II - triptofan;
12 - fenilalanin; 13 – lösin ve izolösin
Kurutulmuş kromatogram, üzerindeki amino asit lekelerinin konumunu tespit etmek için aseton içindeki %1'lik bir ninhidrin çözeltisine batırılır. Daha sonra kromatogram, asetonun uzaklaştırılması için 10 dakika süreyle çeker ocak içerisine yerleştirilir ve bir kurutma kabinine aktarılır ve burada 70°C'de 15 dakika süreyle bırakılır. Standart ve test karışımlarının amino asitleri, solvent sisteminin başlangıç çizgisinden kromatogramın üst kenarına kadar hareketi yönünde bir zincir halinde yer alan mavi-mor noktalar şeklinde tespit edilir.
Test karışımında bulunan amino asitlerin tanımlanması, standart ve test karışımlarının amino asitlerinin kapladığı pozisyonların kromatogramdaki çakışması ile gerçekleştirilir (Şekil 8).
Test karışımlarındaki amino asitlerin kantitatif içeriğini belirlemek için, kromatogram basit bir kalemle çizilir, böylece aynı seviyede bulunan ve aynı amino aside karşılık gelen renkli bölgeler yaklaşık olarak aynı dikdörtgenler içinde yer alır (Şekil 9). .
I II III IV
Pirinç. 9. Kromatogramdaki amino asitlerin düzeni:
I - karışım No. I; II - karışım No. 2; 1U - karışım No. 3; Ø - standart
amino asit karışımı
Kağıdın ana hatlarıyla belirtilen alanları kesilir ve sayıları kromatogramlardaki nokta sayısına karşılık gelmesi gereken test tüplerine yerleştirilir. Bir büretten her test tüpüne 10 ml %75'lik çözelti dökülür. etil alkol bal sülfatla doyurulmuş (500 ml etil alkole 0,2 ml doymuş bakır sülfat çözeltisi ekleyin). Test tüpünün kapağı kapatılır ve ara sıra karıştırılarak tuğla kırmızısı renk (Ruemann mavi-mor bakır tuzu) kağıttan çözeltiye tamamen aktarılır. Bu 15-20 dakika sürer. Standardın ve test çözeltilerinin absorpsiyonu (optik yoğunluk), yeşil ışık filtreli (540 nm) bir fotoelektrik kalorimetre üzerinde ölçülür. Referans akışına %75'lik bakır sülfatlı etil alkol çözeltisi içeren bir küvet yerleştirilir.
Test çözeltisindeki amino asitlerin kantitatif içeriği, test ve standart numunelerin ekstinksiyonlarının oranından hesaplanır.
Hesaplama örneği. Standart karışımın 1 ml'sinde 1,8 mg glisin içerdiğini ve bu standart çözeltinin 0,02 g'ının başlangıç şeridine uygulandığını varsayalım. Bu nedenle kromatogram (1,8 x 0,02) = 0,036 mg glisin aldı. Ayrıca renkli çözeltilerin absorpsiyonunun standart için 0,288 ve bilinmeyen karışım için 0,336 olduğunu kabul edelim. Daha sonra, kromatogram üzerinde işaretlenen, incelenen karışımdaki glisin içeriği (36'0,336): 0,288=42 μg olacaktır. Ayrıca test karışımının kromatograma örneğin 0,0250 g miktarında uygulandığını varsayarsak, 1 ml test çözeltisindeki glisin içeriği (42:0,0250) = 1680 μg veya 1,68 mg/ olacaktır. ml.
Kendi deneyinin sonuçlarını sunun ve onlardan sonuçlar çıkarın.
Laboratuvar çalışması No. 15
İyon ayrımıFe 3+ , ortak 2+ , Ni 2+
Bu makale, yalnızca ürünlerin analizinde değil, biyokimya ve farmasötik analizlerde de kullanılan amino asitlerin belirlenmesine yönelik yöntemleri tartışacaktır.
Amino asitlerin toplam miktarı, Kjeldahl yöntemi kullanılarak amino asitlerden elde edilen amonyağın belirlenmesine dayanan fotometrik bir yöntemle belirlenebilir.
1-naftol ile reaksiyon. Arginin, histidin ve tirozini belirlemek için 1-naftol ile bir reaksiyon önerildi. Sodyum hipoklorit (NaOCl) varlığında çözelti kırmızıya döner. Bir amino asit içeren %50 etanol içindeki bir numune çözeltisi buzla soğutulur ve %10'luk bir NaOCl çözeltisi ve bir naftol çözeltisi ilave edilir. Reaksiyon ürünü kırmızı renktedir (lmaks = 550 nm). Amino asitlerin içeriği, elde edilen çözeltinin renk yoğunluğuna göre belirlenir.
Biüre reaksiyonu. Amino asitlerin belirlenmesinde kullanılan en önemli reaksiyonlardan biri biüre reaksiyonudur. Reaksiyon, alkali bir biüre çözeltisine seyreltik sulu bir bakır (II) tuzu çözeltisinin eklenmesiyle gerçekleştirilir. Bu durumda çözüm yoğun bir şekilde ortaya çıkıyor mor karmaşık bir bileşiğin oluşumu nedeniyle.
Biüre reaksiyonu, en az 2 amid grubu veya bir aminohidroksietilen grubu içeren bileşiklerin yanı sıra amino asitlerin amidlerini ve imidlerini içerir. Bu reaksiyon proteinler ve amino asitlerin ve amidlerin konsantre çözeltileri tarafından gerçekleştirilir. Amino asitlerin seyreltik çözeltileri biüre reaksiyonu vermez ve bu nedenle reaksiyon, protein hidrolizinin sonunu belirlemek için kullanılabilir. Reaksiyon aynı zamanda proteinin niteliksel ve niceliksel tespiti için de kullanılır. Biüre reaksiyonu, klinik teşhis laboratuvarlarında kan ve diğer biyolojik sıvılardaki proteinin belirlenmesi için kullanılan yöntemlerin temelini oluşturur.
Ninhidrin reaksiyonu. Amino asitleri belirlemek için kullanılan ikinci en önemli reaksiyon, a-amino asitlere yönelik bir renk reaksiyonu olan ninhidrin reaksiyonudur; bu, a-amino asitlerin, fazla ninhidrin içeren alkalin bir çözelti içinde ısıtılmasıyla gerçekleştirilir.
Ninhidrin, a-amino asitlerin amonyak oluşumu ile oksidatif dekarboksilasyonunu gerçekleştirir. karbon dioksit ve ana amino asitten bir eksik karbon atomu içeren bir aldehit. İndirgenmiş ninhidrin ayrıca salınan amonyakla ve ikinci bir ninhidrin molekülüyle reaksiyona girerek amonyakla renkli bir yoğunlaşma ürünü oluşturur.
Ortaya çıkan bileşik (pigment) mor-mavi bir renge sahiptir (lmaks = 570 nm). Bu renkli bileşiğin oluşumu, 1 µg kadar küçük miktarlarda bile amino asitleri tespit edebilen kantitatif a-amino asit testinde kullanılır.
A-amino grubu olmayan prolin ve hidroksiprolin, ninhidrin ile reaksiyona girerek türevleri oluşturur. sarı renk(lmaks = 440 nm). Reaksiyon spesifik değildir çünkü amonyak ve bir amino grubu (aminler, proteinler, peptitler) içeren bileşikler de ninhidrin ile renkli bir ürün üretir. Ancak bu bileşiklerle CO2 açığa çıkmaz. Karbondioksit salınımı yalnızca a-amino asitlerin karakteristiğidir. Reaksiyon, otomatik amino asit analizörleri (CO2 hacminin ölçümü) dahil olmak üzere, a-amino asitlerin kolorimetrik kantitatif tespiti için kullanılır.
Ninhidrin reaksiyonu glisin, izolösin ve lösini belirlemek için kullanılır; serin, fenilalanin, sistein, tirozin, triptofan vb. daha az yoğun renk verir.
Ortaya çıkan ürünler oldukça yoğun bir renkle karakterize edilir (e = 1,8–3,3·10 4), ancak renkli ürünler kararsızdır. Renk yoğunluğu hızla azalır. Stabilizasyon için CdCl2 eklenir. Ortaya çıkan bileşiklerle stabil kompleksler oluşturur. Kadmiyum klorür de reaksiyonu hızlandırır.
Amino asitler ve bir amino grubu içeren diğer bazı bileşikler, alkalin bir ortamda 1,2-naftokinon - 4-sülfoksilat ile yoğunlaşarak 1,2-naftokinon monoimin'in kırmızı, sarı, turuncu türevlerini oluşturur.
Reaksiyon a-aminooksilatları (valin, izolösin, lösin, vb.) belirlemek için kullanılır.
Triptofanı belirlemek için 4-dimetilaminobenzaldehit ile reaksiyon kullanılabilir. Reaksiyon ürünü mor renklidir ve analiz edilen çözeltideki triptofan içeriği, rengin yoğunluğuna göre belirlenir.
Ancak bu reaksiyonun gıda analizlerinde nadiren kullanıldığı unutulmamalıdır.
Sülfür içeren amino asitlerin kantitatif tayini için aşağıdaki reaksiyona dayanan bir bromatometrik yöntem kullanılır:
% 1 NaOH çözeltisi içindeki bir sistein çözeltisi, zemin tıpası olan bir şişeye dökülür, 0,1 N eklenir. potasyum bromat çözeltisi, kuru potasyum bromür ve %10 HC1 ile asitleştirildi.
BrO 3 – + 5Br – + 6H + → 3Br 2 + 3H 2 O
Reaksiyon sonucu oluşan, miktarı potasyum bromat miktarına eşdeğer olan brom, amino asit ile reaksiyona girer. 10 dakika sonra reaksiyona girmemiş bromla reaksiyona giren potasyum iyodür eklenir ve açığa çıkan iyot 0,1 N ile titre edilir. indikatör olarak nişasta içeren sodyum tiyosülfat çözeltisi.
2I – + Br 2 → Br - + I 2
Titrasyon için kullanılan tiyosülfat miktarı, amino asitle reaksiyona girmeyen bromin miktarına eşdeğerdir. İlave edilen potasyum bromat ve tiyosülfat miktarları arasındaki farka göre amino asit ile reaksiyona giren brom miktarı, dolayısıyla amino asit miktarı bulunur.
Metionin de benzer şekilde belirlenir. Metiyonin bir sülfona oksitlenir:
Bu reaksiyon ne zaman belirli koşullar metiyonin içeriğini çok doğru bir şekilde belirlemenizi sağlar.
