Urządzenie do wykonywania immunoelektroforezy w żelu. Surowica poli-IEF do immunoelektroforezy białek surowicy ludzkiej, sucha. Metoda immunoelektroforezy w żelu agarowym.

Opis

Surowica do IEF zawiera przeciwciała przeciwko białkom surowicy ludzkiej. W immunoelektroforezie z normalną ludzką surowicą krwi lek powinien wykryć co najmniej 15 linii precypitacji w odpowiednich strefach: w strefie a - albumina, 2 -makroglobulina; w strefie β – transferyna, ceruloplazmina; w strefie γ – linie IgG, IgA, IgM itp.
Serum powinno całkowicie się rozpuścić w ciągu 5 minut po dodaniu do ampułki (butelki) 1,0 ml oczyszczonej wody. Po rozpuszczeniu serum powinno być przezroczyste, bez osadu i obcych wtrąceń, o barwie różowo-żółtej. Dopuszczalna jest niewielka opalescencja w świetle przechodzącym.

Formularz zwolnienia

Dostępny w ampułkach 1 ml (10 butelek).

Mieszanina

Sucha surowica do immunoelektroforezy przeciwko białkom surowicy ludzkiej jest liofilizatem surowicy odpornościowej pochodzącej od owiec immunizowanych normalną surowicą krwi ludzkiej.
Zestaw składa się z surowicy do immunoelektroforezy wobec białek surowicy ludzkiej.

Surowica dla IEF przeciwko białkom surowicy ludzkiej. Porowata masa o barwie od białawo-szarej do różowo-żółtej 10 ampułek (butelek) po 1 ml

Wskazania do stosowania

Przeznaczony do jakościowego i ilościowego oznaczania immunoglobulin i różnych białek w surowicy krwi, innych płynach biologicznych człowieka i produktach krwionośnych metodą immunoelektroforezy (IEF).

Schemat dawkowania i sposób podawania

Analizowane próbki należy przechowywać w temperaturze od 2 do 8°C przez 7 dni lub w temperaturze nieprzekraczającej minus 18°C nie dłużej niż 1 rok. Zamrożone próbki należy rozmrozić i dokładnie wymieszać poprzez wstrząsanie przed badaniem. Ponowne zamrażanie jest niedozwolone.

SPRZĘT, ODCZYNNIKI I MATERIAŁY
Wyposażenie: urządzenie do immunoelektroforezy z prostownikiem prądu elektrycznego, waga analityczna, elektryczna płyta grzejna, pH-metr, lodówka, stolik z możliwością regulacji poziomu, płytki szklane (90×120) mm, komora mokra, szkło wolumetryczne, dozowniki pipet z wymiennymi końcówkami, pojemnik do dezynfekcji .
Odczynniki i materiały:
– agar;
– czerń amidowa 10B;
– weronal;
- woda oczyszczona;
- gliceryna;
- kwas borowy;
- kwas octowy;
– środkowy;
– mertiolan (timerosal);
– tetraboran sodu 10-woda;
- chlorek sodu;
– pironina B;
– bibuła laboratoryjna;
- rękawiczki jednorazowe;
– roztwory dezynfekcyjne.

PRZEPROWADZENIE ANALIZY
Immunoelektroforeza.
Metoda IEF opiera się na zdolności naładowanych cząstek do poruszania się w żelu agarowym pod wpływem pola elektrycznego oraz na specyficznym wytrącaniu tych cząstek przez odpowiednie surowice odpornościowe z utworzeniem widocznych kompleksów immunologicznych.
Otworzyć ampułki (butelki) z surowicą do IEF i rozpuścić zawartość każdej w 1,0 ml oczyszczonej wody.
Przygotowanie roztworów buforowych.
Roztwór buforowy weronalu-medinalu 0,05 M pH 8,6±0,1 (weronal – 1,38 g, medinal – 8,76 g, woda oczyszczona do 1 l);
Roztwór buforowy boranowy 0,05 M, pH 8,6±0,1 (kwas borowy – 6,7 g, 10-wodny tetraboran sodu – 13,4 g, woda oczyszczona – do 1 l).
Użyj dowolnego z poniższych roztworów buforowych.
Przed wlaniem roztworu buforowego do komór elektrod urządzenia IEF należy go 2 razy rozcieńczyć wodą oczyszczoną.
Przygotowanie 0,9% roztworu chlorku sodu.
Do kolby miarowej o pojemności 1 litra przenieść 9 g chlorku sodu, zalać wodą oczyszczoną do kreski i mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia.

Przygotowanie roztworu barwiącego.
Do kolby miarowej o pojemności 1 litra przenieść 1 g sadzy amidowej 10 B, zalać niewielką ilością wody oczyszczonej, dodać 70 ml kwasu octowego, uzupełnić wodą oczyszczoną do kreski i wymieszać.
Przygotowanie roztworu do przemywania agaru po barwieniu.
Do kolby miarowej o pojemności 1 litra wlać 25 ml kwasu octowego, dodać 20 ml gliceryny, uzupełnić wodą oczyszczoną do kreski i wymieszać.
Przygotowanie 1% żelu agarowego w roztworze buforowym.
Ilość żelu agarowego należy wcześniej wyliczyć w zależności od ilości płytek. 1 g agaru przelać do szklanki, przepłukać 2-3 razy oczyszczoną wodą i gotować we wrzącej łaźni wodnej w 50 ml oczyszczonej wody aż do całkowitego rozpuszczenia. Przenieść ugotowany agar do cylindra miarowego o pojemności 100 ml i uzupełnić zawartość do kreski za pomocą podgrzanego roztworu buforowego. Dodać 0,1 g mertiolanu i wymieszać. Żel agarowy musi być jednorodny, przezroczysty i wolny od zanieczyszczeń mechanicznych.

Wypełnianie płytek szklanych żelem agarowym.
Umieścić płytki szklane (90±120) mm na stole wyważonym za pomocą poziomicy. Ostrożnie nałóż roztopiony i schłodzony agar do temperatury (55±5) °C na płytki szklane w ilości 20 ml stopionego agaru na płytkę. Po stwardnieniu agaru umieścić płytki w urządzeniu IEF. Połączyć żel agarowy na płytkach z roztworem buforowym w komorach elektrod urządzenia za pomocą bibuły filtracyjnej złożonej w 5-6 warstwach.
Łączenie agaru na płytkach z roztworem buforowym możliwe jest również przy pomocy mostków agarowych.

Prowadzenie IEF.
W warstwie agaru za pomocą specjalnego stempla wycinamy dziury, a po elektroforezie wycinamy poprzeczne rowki.
Po usunięciu agaru ze dołków należy je za pomocą pipety z dozownikiem napełnić rozpuszczoną kontrolną surowicą ludzką i analizowanymi próbkami. Do jednej ze studzienek dodać barwnik pironiny B (w celu kontroli postępu frakcji).
Przykryj urządzenie IEF pokrywą z elektrodami platynowymi i podłącz je do prostownika prądu elektrycznego. Elektroforezę przeprowadza się przy napięciu 70-150 V i prądzie 10-50 mA przez 2-3 godziny. Zatrzymaj proces elektroforezy, gdy plamka pironiny odpowiadająca migracji albuminy znajdzie się w odległości 20-25 mm od. studnia.
Po elektroforezie wyjąć płytki z urządzenia. Dodaj rozpuszczoną surowicę dla IEF do rowków. Umieścić płytki w wilgotnej komorze i przechowywać w lodówce w temperaturze (5±3)°C przez 48 godzin.

Po inkubacji w żelu agarowym tworzą się linie strącania.

Barwienie agarem.
Płytki można fotografować metodą kontaktową lub w świetle przechodzącym lub wysuszyć i wybarwić roztworem czerni amidowej 10 B. W tym celu płytki należy umieścić w kuwetach, napełnić 0,9% roztworem chlorku sodu i pozostawić na 16-18 godziny, aby zmyć nie wytrącone białka. Następnie przykryj płytki żelem agarowym z bibułą filtracyjną nasączoną 0,9% roztworem chlorku sodu i wysusz na powietrzu, aż żel agarowy zmieni się w cienką warstwę.
Z wysuszonych płytek wyjąć bibułę filtracyjną i umieścić w kuwetach z roztworem barwnika na 30-40 minut. Następnie po zabarwieniu umyć w roztworze agarowym do płukania przez 5-10 minut i ponownie wysuszyć.

Rozliczanie wyników.
Zapisz wyniki wizualnie.

Zasada działania i konstrukcja
Zasada działania urządzenia polega na tym, że antygeny i przeciwciała w polu elektrycznym mają różną ruchliwość elektroforetyczną.
Antygeny posiadające ruchliwość elektroforetyczną β-globulin poruszają się w kierunku elektrody dodatniej – anody, natomiast przeciwciała spokrewnione z β-globulinami poruszają się w kierunku elektrody ujemnej – katody.
Oddziałując w równoważnych proporcjach, antygeny i przeciwciała tworzą w uchwycie żelu bezbarwną linię precypitacji, prostopadłą do kierunku przepływu w pożywce, co pozwala ocenić obecność lub brak antygenu w badanej surowicy.
Strukturalnie urządzenie składa się z zasilacza o napięciu wyjściowym 30 V i 60 V, komory elektroforetycznej na 26 próbek, tacy, urządzenia do napełniania żelu i nakładania dołków.

Procedura operacyjna
Przed przystąpieniem do pracy przygotowuje się roztwory buforowe i żele agarowe zgodnie z zaleceniami podanymi w opisie urządzenia, uchwyt żelu ustala się w pozycji poziomej, po czym wgłębienia uchwytu wypełnia się płynnym żelem i przechowuje do momentu żel twardnieje.
Surowice testowe dodaje się do dołków żelowych (jednorazowo do 25 próbek plus dołek z surowicą kontrolną standardowego systemu testowego),
Oznaczanie antygenów przeprowadza się według metod podanych w opisie urządzenia i zgodnie z wybranym trybem elektroforezy.
Obecność lub brak linii strącania, widocznej pod ukośnym oświetleniem, pozwala ocenić obecność lub brak antygenów w surowicy testowej.
Opis urządzenia zawiera 4 metody oznaczania antygenów i przeciwciał, a także identyfikacji przeciwciał w reakcji wyczerpania antygenu standardowego.

SPECYFIKACJE
Urządzenie umożliwia jednoczesne badanie 26 próbek, w tym jedna kontrolna.
Czas reakcji - nie więcej niż 25 minut przy oznaczaniu antygenu wirusa zapalenia wątroby typu B
Wymiary gabarytowe głównych bloków, mm
zasilacz 282*115*95
kamera 87 * 69 * 223
paleta 264*120*37
Masa głównych bloków, kg
Zasilanie / komora / taca 2.2 / 04 / 03
Napięcie i częstotliwość znamionowa, V / Hz 220 / 50
Pobór mocy, VA, nie więcej niż 25
Średnia żywotność urządzenia, lata 5

Aby uzyskać bardziej szczegółowe informacje, możesz skontaktować się z producentem” Urządzenie do immunoelektroforezy PIEF-01- Analizator ELISA za 7200 rubli.

Analiza immunoelektroforetyczna jest połączeniem elektroforezy w żelu agarowym z immunodyfuzją. Istnieją różne opcje immunoelektroforezy. Immunoelektroforezę (IEF) po raz pierwszy opisali Grabar i Williams w 1953 r. W 1955 r. Scheidegger zaproponował mikromodyfikację tej metody przy użyciu zwykłych szkiełek.

Zasada IEF jest następująca. Najpierw przeprowadza się elektroforetyczną separację białek (antygenów) w buforowanym żelu agarowym; Po usunięciu napięcia wzdłuż kierunku ruchu białek w polu elektrycznym w żelu wycina się rowek, do którego dodaje się wytrącającą się surowicę immunologiczną. Antygen i surowica odpornościowa dyfundują w żelu ku sobie, a w miejscu ich oddziaływania pojawiają się łukowate linie wytrącania, których liczba, położenie i kształt dają wyobrażenie o składzie początkowej mieszaniny antygenów.

Stosując tę metodę w immunologii klinicznej, półilościowo określa się stężenie immunoglobulin różnych klas i identyfikuje białka szpiczaka. IEF jest również stosowany w diagnostyce stanów niedoborów odporności. Metoda jest niezbędna do spójnego monitorowania procesu oczyszczania preparatów białkowych. Często wykorzystuje się go również do kontroli autentyczności i czystości tych leków.

Elektroforeza dwuwymiarowa (krzyżowa) służy do rozdzielania złożonej mieszaniny antygenów. Metoda obejmuje dwa etapy. W pierwszym etapie białka dyfundują pod wpływem pola elektrycznego w żelu agarozowym zawierającym przeciwciała. W drugim etapie płyta jest obracana o 90° i poddawana wielokrotnemu przyspieszaniu w kierunku prostopadłym do pierwszego. W ten sposób możliwe jest ilościowe scharakteryzowanie każdego z antygenów w mieszaninie. Metodę tę stosuje się w szczególności do oceny stopnia konwersji białka dopełniacza C3 do inaktywowanej formy C3c w surowicy pacjentów ze SLE lub płynie stawowym pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów.

Analiza elektroimmunologiczna

Metodę tę po raz pierwszy zaproponował Laurell w 1966 roku. Żel agarozowy zawierający surowicę odpornościową rozprowadza się równomiernie na płaskiej powierzchni. Lek zawierający antygen dodaje się w różnych rozcieńczeniach do szeregu kolejnych dołków w żelu. Ze studzienek pod wpływem stałego prądu elektrycznego antygeny migrują do warstwy agarozowej, gdzie wchodzą w interakcję z immunoglobulinami. W wyniku tego oddziaływania powstają wydzielenia AG-AT, które przyjmują wydłużony, spiczasty kształt, przypominający rakietę. Stąd inna nazwa metody – immunoelektroforeza rakietowa. Długość strefy precypitacji, przy niezmienionych innych czynnikach (stężenie żelu, stężenie surowicy odpornościowej w żelu, grubość warstwy żelu, tryb elektroforezy) jest bezpośrednio zależna od stężenia antygenu. EIA służy do ilościowego oznaczania białek w płynach ustrojowych.

Przeciwelektroforeza

Zasada przeciwelektroforezy została zastosowana w 1969 roku przez Bedaridę do wykrywania wydzieleń AG-AT. Immunoprecypitacja zachodzi w warstwie nośnej i w przeciwieństwie do metody Uchterlony kontakt antygenu z przeciwciałem następuje nie w wyniku swobodnej dyfuzji, ale pod wpływem stałego pola elektrycznego. Białka są amfolitami; ze względu na różnice w składzie aminokwasów mogą migrować w środowisku zasadowym z różnymi prędkościami i w różnych kierunkach (anodowy, katodowy). Jeżeli antygen i odpowiednia wytrącająca się surowica odpornościowa migrują w różnych kierunkach, możliwe staje się ich zbliżanie do siebie w warstwie żelu lub na błonie z octanu celulozy. Pomiędzy dołkami wyjściowymi obu składników obserwuje się wytrącanie przez 30-180 minut, w zależności od przyłożonego napięcia. Przeciwimmunoelektroforeza (CIEF) przeznaczona jest do wykrywania i identyfikacji precypitujących układów antygen-antygen, pod warunkiem, że antygen ma ruchliwość elektroforetyczną inną niż immunoglobuliny. VIEF służy do identyfikacji antygenów wirusa zapalenia wątroby typu B, przeciwciał przeciwko Aspergillus w aspergilozie oskrzelowo-płucnej, przeciwciał przeciwko N.meningitidis, przeciwciał przeciwko DNA w SLE.

Immunoelektroforeza- jedna z powszechnie stosowanych metod jakościowej analizy antygenów. Mając odpowiedni AS strącający, można go zastosować do badania dowolnej mieszaniny antygenowej. W szczególności z powodzeniem analizowane są białka surowicy krwi, płynu mózgowo-rdzeniowego, moczu, mleka, ekstraktów narządów, a także białka pochodzenia roślinnego i bakteryjnego. W klinice metoda ta jest najczęściej stosowana w diagnostyce paraproteinemii i stanów niedoborów odporności. W medycynie sądowej służy do analizy układów haptoglobiny i specyficznego dla grupy składnika Gc.

W pracach badawczych immunoelektroforeza służy jako główna metoda identyfikacji białek zawartych w złożonych mieszaninach. Jest niezastąpiony jako metoda konsekwentnego monitorowania procesu oczyszczania preparatów białkowych. Często wykorzystuje się go również do kontroli autentyczności i czystości tych leków. Oczywiście metoda mająca tak szerokie zastosowanie wymagała modyfikacji i udoskonaleń w różnych kierunkach. Zaproponowano nowe nośniki: żel agarozowy, PAGE, błony z octanu celulozy.

W tym samym czasie zaczęto łączyć IEF z różnymi metodami specyficznego barwienia i fluorochromowania w celu wykrywania enzymów, węglowodanów, lipoprotein i nukleoprotein. W wyniku połączenia z innymi metodami analitycznymi, niedawno zaproponowano dwuwymiarową IEF do oznaczania ilościowego przy użyciu polispecyficznego AS, immunoelektroforezę krążkową, immunoelektrofokusowanie, radioimmunoelektroforezę. Specjalna modyfikacja dwuwymiarowego IEF może zwiększyć jego czułość na poziom RIA. Osiąga się to poprzez elektroforetyczną elucję antygenu z małych szklanych zbiorników o pojemności 0,1–10 ml. Dla IEF z chłodzeniem Wime zaprojektował urządzenie, które automatycznie utrzymuje stałą temperaturę i prąd podczas procesu separacji.

Urządzenie to jest bardzo wygodne do określania ruchliwości elektroforetycznej różnych substancji. Stosowanie w tym urządzeniu chłodzenia termoelektrycznego (bateria Peltiera) powinno być szczególnie zalecane przy pracy z enzymami i innymi substancjami termolabilnymi. Ostatnio zaproponowano prostą metodę rozdziału białek z wykorzystaniem elektroforezy dwuwymiarowej. Znana jest czuła metoda oznaczania nieprecypitujących układów antygen-przeciwciało, oparta na wykorzystaniu mAb, tzw. kaskadowa IEF, obejmująca utrwalanie antygenów po elektroforezie, przyłączanie przeciwciał do antygenów, usuwanie związanych przeciwciał i ich ilościowe ocena.

W przypadku elektroforezy immunofiksacyjnej oddziela się AT, a nie antygen. Jest to metoda szybka i ekonomiczna, szczególnie odpowiednia do masowych badań przesiewowych w celu wykrycia paraproteinemii oraz do otrzymywania preparatów białkowych. Przy IEF często obserwuje się zakłócenia w normalnym przebiegu procesu i nie zawsze możliwe jest natychmiastowe wykrycie ich przyczyny. Jeśli na przykład użyje się niedostatecznie oczyszczonego agaru, najczęściej prowadzi to do trzech naruszeń: słabego tworzenia żelu, silnej elektrosmozy i słabego przebarwienia preparatów. Agar, który nie jest wystarczająco czysty, należy zawsze oczyścić. Rozpoczynając pracę z nową porcją agaru należy najpierw sprawdzić jego przydatność. Często stwierdza się, że te same antygeny mają różną ruchliwość elektroforetyczną i odmiennie barwią się po spożyciu różnych partii agaru. Przyczyną zaburzeń IEF może być hydroliza agaru na skutek powtarzającego się lub zbyt długiego ogrzewania.

Hydroliza objawia się osłabieniem właściwości żelotwórczych i pojawieniem się nieregularności na powierzchni żelu. Użycie niewłaściwego roztworu buforowego może mieć wpływ na separację elektroforetyczną. Większość buforów stanowi dobrą pożywkę dla bakterii i pleśni. Dlatego też bufor należy przechowywać w lodówce lub dodać do niego środek konserwujący. Bufor wypełniający komorę elektroforetyczną należy wymieniać przynajmniej raz w tygodniu. W przypadku wielokrotnego użycia bufora elektrody, po każdym rozdzieleniu konieczna jest zmiana biegunów elektrod. Wielkość napięcia na zaciskach komory zwykle nie pozwala ocenić fizycznej siły prądu przepływającego przez żel, dlatego do obwodu należy podłączyć szeregowo miliamperomierz. Podczas procesu separacji prąd prawie zawsze wzrasta. Zjawisko to spowodowane jest nagrzewaniem żelu, które wzrasta wraz ze wzrostem czasu trwania elektroforezy.

Jednakże po początkowym wzroście prąd w obwodzie może spaść. Dzieje się tak często na skutek wysychania pasków bibuły filtracyjnej łączącej żel z buforem, lub nawet na skutek wysychania samego żelu. W takim przypadku należy zmniejszyć siłę jonową bufora lub napięcie na zaciskach komory. Ponadto suszeniu można zapobiec, owinąwszy przed elektroforezą płytkę żelową i paski papieru folią polimerową. Najwygodniej jest pracować ze źródłem zapewniającym stałą siłę prądu (stabilizacja prądu). Jest rzeczą oczywistą, że wyniki IEF zależą od jakości antygenów i surowic odpornościowych.

OGÓLNY ARTYKUŁ FARMAKOPEJSKI

Wprowadzony w celu zastąpienia metody określonej w FS 42-3874-99

Niniejsza monografia farmakopealna ogólna ma na celu badanie składu antygenowego materiałów biologicznych, a także oznaczanie czystości, składu jakościowego i ilościowego immunobiologicznych produktów leczniczych (IMP) metodą immunoelektroforezy (IEF) w żelu agarowym, łączącą metody elektroforezy strefowej i immunodyfuzji.

W procesie immunoelektroforezy w żelach lub na błonach z octanu celulozy, przy zastosowaniu prostych lub podwójnych metod immunodyfuzji, zachodzi reakcja pomiędzy rozpuszczalnymi białkami a wytrącaniem swoistych dla nich przeciwciał. Ilościowe oznaczanie białek można przeprowadzić metodą elektroforezy w podłożu zawierającym przeciwciała (test elektroimmunologiczny, elektroimmunodyfuzja, immunoelektroforeza rakietowa). Antygenowy charakter składników białkowych można zbadać porównując je ze znanymi markerami.

Skuteczność testów immunochemicznych zależy od specyfiki zastosowanych surowic, ich miana i powinowactwa do antygenów.

Zazwyczaj immunoelektroforeza jest kombinacją elektroforezy w żelu agarowym (lub agarozowym), po której następuje podwójna immunodyfuzja w tym samym podłożu. W dwuwymiarowej podwójnej immunodyfuzji antygen i przeciwciała, umieszczone w okrągłych lub prostokątnych zagłębieniach w żelu, migrują ku sobie, w wyniku czego w momencie ich spotkania tworzą się linie (łuki) precypitacji. Położenie pasm precypitacyjnych zależy od współczynnika dyfuzji antygenu i jego stężenia w stosunku do przeciwciał (szybkość dyfuzji przeciwciała można uznać za stałą). Pewien stosunek stężeń antygenu i przeciwciał, optymalny do wytrącenia osadu, nazywany jest strefą równoważności. W ten sposób powstają wyraźne linie opadów.

Stężenie (miano) przeciwciał w surowicy odpornościowej może również znacznie się różnić. Możliwa jest sytuacja, w której strefy równoważności dla różnych składników mieszaniny nie będą się nakładać. Aby wybrać równoważny stosunek antygen-przeciwciało, zaleca się przeprowadzenie immunoelektroforezy mieszanin wieloskładnikowych przy kilku względnych stężeniach antygen-przeciwciało, ponieważ zastosowanie tylko jednego takiego stężenia może nie wykryć niektórych składników.

Metoda immunoelektroforezy w żelu agarowym

Na scenie obiektowej umieszcza się szklaną płytkę o wymiarach 90x120 mm nasączoną alkoholem, ściśle poziomo. Żel agarowy schłodzony do temperatury (45±5) 0 C nanosi się na szklaną płytkę w ilości 18,0-20,0 ml. Po stwardnieniu w temperaturze pokojowej, po 20-30 minutach na płytce tworzy się warstwa agaru o grubości 2,0 - 2,5 mm.

Po stwardnieniu żelu za pomocą specjalnego szablonu wycina się w nim 6-7 otworów o średnicy 1-2 mm. Dołki napełnia się badaną próbką w objętości nie większej niż objętość dołka (2 dołki na każdą badaną próbkę). W tym przypadku do górnych i dolnych dołków płytki szklanej dodaje się próbkę kontrolną z żelem - normalną surowicą ludzką („Próbka standardowa systemu testowego do oznaczania składu frakcyjnego (antygenowego) preparatów z surowicy krwi ludzkiej metodą immunoelektroforeza” lub inna próbka kontrolna zgodnie z instrukcjami zawartymi w monografii farmakopealnej lub dokumentacji regulacyjnej), barwiona pironiną B (lub innym barwnikiem określonym w monografii farmakopealnej lub dokumentacji regulacyjnej).

Do cylindra miarowego o pojemności 1000 ml dodać 500 ml roztworu buforu weronalu-medinalu lub boranu, dopełnić wodą oczyszczoną objętość roztworu do kreski i wymieszać. Powstały roztwór (lub inny roztwór buforowy określony w monografii farmakopealnej lub dokumentacji regulacyjnej) wlewa się do sekcji elektrod komory urządzenia do elektroforezy.

Płytkę z przygotowanym żelem umieszcza się w urządzeniu do elektroforezy i łączy z roztworem buforowym w komorach elektrod urządzenia za pomocą kilku warstw bibuły filtracyjnej. W przypadku konstrukcji urządzenia do elektroforezy, która przewiduje połączenie agaru na płytce z buforem elektrody za pomocą kolumn agarowych, płytkę instaluje się w urządzeniu zrównoważonym i zalewa roztopionym agarem do momentu połączenia się z kolumnami agarowymi i warstwą żelu Tworzy się warstwa o grubości 1–2 mm.

Urządzenie do elektroforezy przykrywa się pokrywką i włącza się źródło zasilania (napięcie 70-200 V, prąd 10-40 mA). Elektroforezę prowadzi się przez 1,5-3 godziny, aż plamka pironiny B odpowiadająca migracji albuminy znajdzie się w odległości 20-25 mm od dołka.

Po elektroforezie pomiędzy dołkami w żelu agarowym przy użyciu specjalnego szablonu wycina się podłużne „rowki” (równoległe do kierunku migracji). Do „rowków” dodaje się 0,25 ml wytrącającej się surowicy odpornościowej: przeciwko białkom surowicy krwi ludzkiej (w przypadku badania składu frakcyjnego) lub surowicy wieloważnej przeciwko białkom surowicy krwi ludzkiej, bydlęcej, końskiej i świńskiej (w celu potwierdzenia autentyczności).

Płytkę z żelem agarowym umieszcza się w wilgotnej komorze i utrzymuje w temperaturze (5 ± 3) 0 C przez 24 - 48 godzin.

Aby zmyć białka, które nie weszły w reakcję strącania, płytkę agarową umieszcza się w kuwetach, napełnia 0,9% roztworem chlorku sodu i inkubuje przez 16-18 godzin. Roztwór zmienia się 3-4 razy. Następnie płytkę wyjmuje się z 0,9% roztworu chlorku sodu, przykrywa bibułą filtracyjną namoczoną w 0,9% roztworze chlorku sodu i suszy na powietrzu, aż żel agarowy zamieni się w cienką warstwę. Następnie płytkę z wysuszonym żelem przykrywa się bibułą filtracyjną namoczoną w 0,9% roztworze chlorku sodu, nie pozostawiając pęcherzyków powietrza, i suszy w temperaturze pokojowej lub w piecu w temperaturze nie przekraczającej 40°C. Po wysuszeniu płytki bibułę filtracyjną zwilża się wodą i ostrożnie usuwa.

Do barwienia białek należy zastosować czerń amidową 10B lub inny odpowiedni barwnik (zgodnie z instrukcją zawartą w monografii farmakopealnej lub dokumentacji regulacyjnej), umieszczając płytkę w kuwecie z roztworem barwnika na 30-40 minut. Następnie płytkę przemywa się roztworem do przemywania agaru (2% roztworem kwasu octowego lub innym roztworem, zgodnie z instrukcją zawartą w dokumentacji regulacyjnej) przez 15-40 minut, aż do całkowitego zniknięcia zabarwionego tła i ponownie suszy w temperaturze pokojowej lub w suszarce w temperaturze nie wyższej niż 40°C.

Lipoproteiny barwiono czernią Sudan B. W celu barwienia całkowicie wysuszone płytki umieszczano w roztworze barwnika na 3 godziny, następnie odbarwiano 50% etanolem aż do całkowitego oczyszczenia tła. Lipoproteiny są zabarwione na kolor ciemnoniebieski. Barwienie należy przeprowadzić na całkowicie wyschniętym preparacie, gdyż czerń Sudan B jest nierozpuszczalna w wodzie i plami mokry żel.

Rozliczanie wyników podczas badania składu frakcyjnego preparatów immunoglobulin ludzkich przeprowadza się wizualnie poprzez porównanie elektroforogramu próbki testowej z elektroforogramem próbki kontrolnej - normalnej ludzkiej surowicy krwi („Standardowa próbka systemu testowego do oznaczania ułamkowej ( antygenowy) skład preparatów z surowicy krwi ludzkiej metodą immunoelektroforezy” lub innej próbki kontrolnej zgodnie z instrukcjami zawartymi w dokumentacji regulacyjnej), która musi wykazywać regulowaną liczbę linii precypitacji surowicą w stosunku do białek surowicy ludzkiej (co najmniej 15 linii precypitacji w przypadku stosowania „Standardowy system badania próbek do oznaczania składu frakcyjnego (antygenowego) leków metodą immunoelektroforezy ludzkiej surowicy krwi”). Główny składnik preparatu immunoglobuliny ludzkiej musi odpowiadać immunoglobulinie G (Ig G) normalnej ludzkiej surowicy krwi.

Uwzględnianie wyników podczas prowadzenia badań potwierdzających autentyczność produktów z krwi ludzkiej odbywa się wizualnie poprzez identyfikację linii strącania surowicy z białkami surowicy we krwi ludzi, bydła, koni i świń. Linie opadowe należy wykrywać wyłącznie przy użyciu surowicy w stosunku do białek surowicy ludzkiej.

Notatki

Przygotowanie 0,05 M roztworu buforowego weronalu i medinalu(pH 8,6±0,1). Do kolby miarowej o pojemności 1000 ml dodać 1,38 g weronalu i 8,76 g medinalu, dodać do kreski wodę oczyszczoną i mieszać aż do całkowitego rozpuszczenia.

Przygotowanie 0,05 M roztworu buforu boranowego(pH 8,6±0,1). Do kolby miarowej o pojemności 1000 ml dodać 6,7 g kwasu borowego, 13,4 g 10-wodnego czteroboranu sodu, dodać do kreski wodę oczyszczoną i wymieszać.
Przygotowanie 1,25% żelu agarowego. Żel agarowy przygotowuje się jedną z następujących metod:
Do przygotowania 1,25% żelu agarowego należy użyć 0,05 M buforu weronal-medinal (pH 8,6 ± 0,1) z dwukrotnie większym stężeniem soli (odpowiednio 2,76 g weronalu i 17,52 g medinalu na 1000 ml oczyszczonej wody).
Do przygotowania 1,25% żelu agarowego należy użyć roztworu buforowego boranu (pH 8,6±0,1) o dwukrotnie większym stężeniu soli (odpowiednio: 13,4 g kwasu borowego i 26,8 g 10-wodnego czteroboranu sodu na 1000 ml oczyszczonej wody).

Do zlewki o pojemności 1000 ml dodaje się 12,5 g agaru, dodaje się 500 ml wody oczyszczonej i żel pozostawia na godzinę do spęcznienia w temperaturze (20±1) 0 C. Zlewkę z zawartością umieszcza się we wrzącej łaźni wodnej i trzyma do całkowitego stopienia agaru. Objętość roztworu żelu doprowadza się wodą do 500 ml, następnie dodaje się równą objętość roztworu buforowego weronalu-medinalu lub roztworu buforowego boranu (lub innego roztworu buforowego określonego w monografii farmakopealnej lub w dokumentacji regulacyjnej). Roztwór agaru przesącza się przez 2-3 warstwy gazy, dodaje tiomersal do stężenia 100 µg/ml i rozlewa do butelek o pojemności 40-50 ml (ilość potrzebna na dwie płytki). Roztopiony agar powinien być przezroczysty.

Przygotowanie roztworu barwnika czerni amidowej 10B. Roztwór barwnika przygotowuje się na jeden z następujących sposobów:
Do kolby miarowej o pojemności 1000 ml dodać 1,0 g czerni amidowej 10B, 450 ml 0,1 M roztworu kwasu octowego, 550 ml 0,1 M roztworu octanu sodu i wymieszać.
Do kolby miarowej o pojemności 1000 ml dodać 1,0 g czerni amidowej 10B i 100 ml lodowatego kwasu octowego, dopełnić do kreski wodą oczyszczoną i wymieszać. Po 12 godzinach przefiltrować przez filtr papierowy.
Przygotowanie roztworu barwiącego Sudan black V. Do kolby miarowej o pojemności 1000 ml dodać 1,2 g czarnego Sudanu B, 20 ml 1M roztworu wodorotlenku sodu, 380 ml wody oczyszczonej, dopełnić objętość roztworu etanolem absolutnym do kreski i wymieszać. Mieszaninę krótko gotuje się, schładza do temperatury pokojowej i po ostudzeniu barwnik przelewa się do ciemnej butelki ze zmielonym korkiem. Odczynnik przechowuje się w temperaturze pokojowej przez 3 miesiące.
Przygotowanie 2% roztworu kwasu octowego do przemywania agaru. Do kolby miarowej o pojemności 1000 ml dodać 20,0 ml lodowatego kwasu octowego, dopełnić wodą oczyszczoną objętość roztworu do kreski i wymieszać. Odczynnik przechowuje się w temperaturze pokojowej przez 3 miesiące.