Dispositivo per eseguire immunoelettroforesi in gel. Siero poli-IEF per immunoelettroforesi contro proteine ​​sieriche umane, secco Metodo di immunoelettroforesi in gel di agar.

Descrizione

Il siero per l'IEF contiene anticorpi contro le proteine ​​del siero umano. Nell'immunoelettroforesi con siero di sangue umano normale, il farmaco deve rilevare almeno 15 linee di precipitazione nelle zone corrispondenti: nella zona a - albumina, una 2 -macroglobulina; nella zona β – transferrina, ceruloplasmina; nella zona γ – linee IgG, IgA, IgM, ecc.
Il siero dovrebbe dissolversi completamente entro 5 minuti dall'aggiunta di 1,0 ml di acqua purificata all'ampolla (flacone). Dopo la dissoluzione, il siero deve essere trasparente, senza sedimenti e inclusioni estranee, di colore giallo-rosato. Una leggera opalescenza in luce trasmessa è accettabile.

Modulo per il rilascio

Disponibile in fiale da 1 ml (10 flaconi).

Composto

Il siero secco per l'immunoelettroforesi contro le proteine ​​del siero umano è un liofilizzato di siero immunitario di pecora immunizzata con siero di sangue umano normale.
Il kit è composto da siero per immunoelettroforesi contro proteine ​​sieriche umane.

Siero per IEF contro proteine ​​sieriche umane. Massa porosa dal colore dal grigio-biancastro al giallo-rosato 10 fiale (flaconi) da 1 ml

Indicazioni per l'uso

Progettato per la determinazione qualitativa e quantitativa delle immunoglobuline e di varie proteine ​​nel siero sanguigno, in altri fluidi biologici umani ed emoderivati ​​mediante immunoelettroforesi (IEF).

Regime posologico e modo di somministrazione

I campioni analizzati devono essere conservati a una temperatura compresa tra 2 e 8 °C per 7 giorni o a una temperatura non superiore a meno 18 °C per non più di 1 anno. I campioni congelati devono essere scongelati e miscelati accuratamente agitando prima del test. Non è consentito il ricongelamento.

ATTREZZATURE, REAGENTI E MATERIALI
Attrezzatura: apparecchio per immunoelettroforesi con raddrizzatore di corrente elettrica, bilancia analitica, piastra elettrica, pHmetro, frigorifero, tavolino con livello regolabile, piastre di vetro (90 × 120) mm, camera umida, vetreria volumetrica, dispensatori di pipette con puntali sostituibili, contenitore per la disinfezione .
Reagenti e materiali:
– agar;
– nero ammidico 10B;
– veronale;
- acqua purificata;
- Glicerina;
- acido borico;
- acido acetico;
– mediale;
– mertiolato (thimerosal);
– tetraborato di sodio 10-acqua;
- cloruro di sodio;
– pironina B;
– carta da filtro da laboratorio;
- guanti monouso;
– soluzioni disinfettanti.

CONDUZIONE DELL'ANALISI
Immunoelettroforesi.
Il metodo IEF si basa sulla capacità delle particelle cariche di muoversi in un gel di agar sotto l'influenza di un campo elettrico e sulla precipitazione specifica di queste particelle da parte dei corrispondenti sieri immunitari con formazione di immunocomplessi visibili.
Aprire le fiale (flaconi) con siero per IEF e sciogliere il contenuto di ciascuna in 1,0 ml di acqua purificata.
Preparazione delle soluzioni tampone.
Soluzione tampone Veronal-medinale 0,05 M pH 8,6±0,1 (veronal - 1,38 g, medinale - 8,76 g, acqua purificata fino a 1 l);
Soluzione tampone borato, 0,05 M, pH 8,6±0,1 (acido borico - 6,7 g, tetraborato di sodio 10-acquoso - 13,4 g, acqua purificata - fino a 1 l).
Utilizzare una delle seguenti soluzioni tampone.
Prima di versare la soluzione tampone nelle camere degli elettrodi del dispositivo IEF, è necessario diluirla 2 volte con acqua purificata.
Preparazione della soluzione di cloruro di sodio 0,9%.
Trasferire 9 g di cloruro di sodio in un matraccio tarato da 1 litro, versare acqua purificata fino alla tacca e agitare fino a completa dissoluzione.

Preparazione della soluzione colorante.
Trasferire 1 g di amido black 10 B in un matraccio tarato da 1 litro, versare una piccola quantità di acqua depurata, aggiungere 70 ml di acido acetico, portare a volume con acqua depurata e mescolare.
Preparazione di una soluzione per lavare l'agar dopo la colorazione.
Versare 25 ml di acido acetico in un matraccio tarato da 1 litro, aggiungere 20 ml di glicerina, portare a volume con acqua depurata e mescolare.
Preparazione del gel di agar all'1% in una soluzione tampone.
La quantità di gel di agar deve essere calcolata in anticipo in base al numero di piastre. Trasferire 1 g di agar in un bicchiere, sciacquare 2-3 volte con acqua purificata e cuocere a bagnomaria bollente in 50 ml di acqua purificata fino a completa dissoluzione. Trasferire l'agar bollito in un cilindro graduato da 100 ml e portare il contenuto al livello con una soluzione tampone riscaldata. Aggiungere 0,1 g di mertiolato e mescolare. Il gel di agar deve essere omogeneo, trasparente e privo di impurità meccaniche.

Riempimento di piastre di vetro con gel di agar.
Posizionare le lastre di vetro (90±120) mm su un piano bilanciato utilizzando una livella. Applicare con attenzione l'agar fuso e raffreddato ad una temperatura di (55±5) °C su piastre di vetro in ragione di 20 ml di agar fuso per piastra. Dopo che l'agar si è indurito, posizionare le piastre nel dispositivo IEF. Unire il gel di agar sulle piastre con una soluzione tampone nelle camere degli elettrodi del dispositivo utilizzando carta da filtro piegata in 5-6 strati.
È anche possibile collegare l'agar su piastre con una soluzione tampone utilizzando ponti di agar.

Condurre l'IEF.
Praticare dei fori nello strato di agar utilizzando un timbro speciale e, dopo l'elettroforesi, tagliare le scanalature trasversali.
Dopo aver rimosso l'agar dai pozzetti, riempirli utilizzando una pipetta dispensatrice con siero di sangue umano di controllo disciolto e i campioni analizzati. Aggiungere il colorante pironina B in uno dei pozzetti (per controllare l'avanzamento delle frazioni).
Coprire il dispositivo IEF con un coperchio con elettrodi di platino e collegarlo ad un raddrizzatore di corrente elettrica. L'elettroforesi viene effettuata con una tensione di 70-150 V e una corrente di 10-50 mA per 2-3 ore. Interrompere il processo di elettroforesi quando lo spot di pironina, corrispondente alla migrazione dell'albumina, si trova a una distanza di 20-25 mm dall'elettroforesi. il pozzo.
Dopo l'elettroforesi, rimuovere le piastre dal dispositivo. Aggiungere il siero disciolto per IEF nelle scanalature. Posizionare le piastre in una camera umida e conservare in frigorifero ad una temperatura di (5±3) °C per 48 ore.

Dopo l'incubazione nel gel di agar si formano delle linee di precipitazione.


Colorazione dell'agar.
Le piastre possono essere fotografate con il metodo per contatto o in luce trasmessa, oppure asciugate e colorate con una soluzione di nero ammidico 10 B. Per fare ciò, posizionare le piastre in cuvette, riempirle con una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% e lasciare agire per 16-18 ore per lavare via le proteine ​​non precipitate. Quindi coprire le piastre con gel di agar con carta da filtro imbevuta di una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% e asciugare all'aria fino a quando il gel di agar si trasforma in una pellicola sottile.
Rimuovere la carta da filtro dalle piastre essiccate e collocarle nelle cuvette con una soluzione colorante per 30-40 minuti. Lavare quindi nella soluzione di lavaggio dell'agar dopo la colorazione per 5-10 minuti e asciugare nuovamente.

Contabilità dei risultati.
Registrare visivamente i risultati.

Principio di funzionamento e struttura
Il principio di funzionamento del dispositivo è che gli antigeni e gli anticorpi in un campo elettrico hanno una mobilità elettroforetica diversa.
Gli antigeni, avendo la mobilità elettroforetica delle β-globuline, si muovono nella direzione dell'elettrodo positivo - l'anodo, mentre gli anticorpi, legati alle β-globuline, si muovono nella direzione dell'elettrodo negativo - il catodo.
Interagendo in rapporti equivalenti, antigeni e anticorpi formano una linea di precipitazione incolore nel supporto del gel, perpendicolare alla direzione del flusso nel mezzo, che consente di giudicare la presenza o l'assenza dell'antigene nel siero in esame.
Strutturalmente, il dispositivo è costituito da un alimentatore con una tensione di uscita di 30 V e 60 V, una camera elettroforetica per 26 campioni, un vassoio, un dispositivo per il riempimento del gel e l'applicazione dei pozzetti.

Procedura operativa
Prima di iniziare il lavoro, le soluzioni tampone e i gel di agar vengono preparati secondo le raccomandazioni fornite nella descrizione del dispositivo, il supporto del gel viene fissato in posizione orizzontale, dopodiché le rientranze del supporto vengono riempite con gel liquido e mantenute fino al il gel si indurisce.
I sieri del test vengono aggiunti ai pozzetti del gel (fino a 25 campioni alla volta più un pozzetto con il siero di controllo del sistema di test standard),
La determinazione degli antigeni viene effettuata secondo i metodi indicati nella descrizione del dispositivo e in conformità con la modalità elettroforetica selezionata.
La presenza o l'assenza di una linea di precipitazione, visibile sotto illuminazione obliqua, consente di giudicare la presenza o l'assenza di antigeni nel siero in esame.
La descrizione del dispositivo contiene 4 metodi per determinare antigeni e anticorpi, nonché per identificare gli anticorpi nella reazione di deplezione di un antigene standard.

SPECIFICHE
Il dispositivo consente l'esame simultaneo di 26 campioni, uno dei quali è di controllo.
Tempo di reazione: non più di 25 minuti durante la determinazione dell'antigene dell'epatite B
Dimensioni complessive dei blocchi principali, mm
alimentazione 282*115*95
fotocamera 87*69*223
pallet 264*120*37
Peso dei blocchi principali, kg
Alimentazione/camera/vassoio 2.2/04/03
Tensione e frequenza nominali, V/Hz 220/50
Consumo energetico, VA, non più di 25
Durata media del dispositivo, anni 5

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L'analisi immunoelettroforetica è una combinazione di elettroforesi su gel di agar con immunodiffusione. Esistono varie opzioni per l'immunoelettroforesi. L'immunoelettroforesi (IEF) fu descritta per la prima volta da Grabar e Williams nel 1953. Nel 1955, Scheidegger propose una micromodifica di questo metodo utilizzando normali vetrini.

Il principio IEF è il seguente. Innanzitutto, la separazione elettroforetica delle proteine ​​(antigeni) viene effettuata in un gel di agar tamponato; Dopo aver eliminato la tensione lungo la direzione del movimento delle proteine ​​nel campo elettrico, nel gel viene ritagliata una scanalatura nella quale viene aggiunto il siero immunitario precipitante. L'antigene e l'antisiero si diffondono nel gel l'uno verso l'altro e nel punto della loro interazione compaiono linee di precipitazione arcuate, il cui numero, posizione e forma danno un'idea della composizione della miscela iniziale di antigeni.

Utilizzando questo metodo nell'immunologia clinica, la concentrazione di immunoglobuline di varie classi viene determinata in modo semiquantitativo e vengono identificate le proteine ​​del mieloma. L'IEF viene utilizzato anche nella diagnosi delle condizioni di immunodeficienza. Il metodo è indispensabile per un monitoraggio coerente del processo di purificazione dei preparati proteici. Viene spesso utilizzato anche per controllare l'autenticità e la purezza di questi farmaci.

L'elettroforesi bidimensionale (crossover) viene utilizzata per separare una miscela complessa di antigeni. Il metodo prevede due fasi. Nella prima fase, le proteine ​​si diffondono sotto l'influenza di un campo elettrico in un gel di agarosio contenente anticorpi. Nella seconda fase la piastra viene ruotata di 90° e sottoposta a ripetute accelerazioni in direzione perpendicolare alla prima. In questo modo è possibile caratterizzare quantitativamente ciascuno degli antigeni presenti nella miscela. Questo metodo, in particolare, viene utilizzato per valutare il grado di conversione della proteina C3 del complemento nella forma inattivata di C3c nel siero di pazienti affetti da LES o nel liquido sinoviale di pazienti affetti da artrite reumatoide.

Analisi elettroimmune

Il metodo fu proposto per la prima volta da Laurell nel 1966. Un gel di agarosio contenente antisiero viene distribuito uniformemente su una superficie piana. Il farmaco contenente l'antigene viene aggiunto in varie diluizioni in una serie di pozzetti successivi nel gel. Dai pozzetti, sotto l'influenza di una corrente elettrica costante, gli antigeni migrano nello strato di agarosio, dove interagiscono con le immunoglobuline. Come risultato di questa interazione, si formano precipitati AG-AT, che acquisiscono una forma allungata e appuntita, che ricorda un razzo. Da qui un altro nome per il metodo: immunoelettroforesi a razzo. La lunghezza della zona di precipitazione, a parità di altre condizioni (concentrazione del gel, concentrazione dell'antisiero nel gel, spessore dello strato di gel, modalità dell'elettroforesi) dipende direttamente dalla concentrazione dell'antigene. L'EIA viene utilizzata per la determinazione quantitativa delle proteine ​​nei fluidi corporei.

Controelettroforesi

Il principio della controelettroforesi fu utilizzato nel 1969 da Bedarida per rilevare i precipitati AG-AT. L'immunoprecipitazione avviene nello strato portante e, a differenza del metodo Uchterlony, il contatto dell'antigene con l'anticorpo non avviene per libera diffusione, ma sotto l'influenza di un campo elettrico costante. Le proteine ​​sono anfoliti; a causa delle differenze nella composizione aminoacidica, possono migrare in un ambiente alcalino a velocità diverse e in direzioni diverse (anodica, catodica). Se l'antigene e il corrispondente antisiero precipitante migrano in direzioni diverse, diventa possibile che si muovano l'uno verso l'altro nello strato di gel o sulla pellicola di acetato di cellulosa. Si osserva precipitazione tra i pozzetti iniziali di entrambi i componenti per 30-180 minuti a seconda della tensione applicata. La controimmunoelettroforesi (CIEF) è destinata alla rilevazione e all'identificazione dei sistemi antigene-antigene precipitanti, a condizione che l'antigene abbia una mobilità elettroforetica diversa da quella delle immunoglobuline. Il VIEF viene utilizzato per identificare gli antigeni virali dell'epatite B, gli anticorpi contro l'Aspergillus nell'aspergillosi broncopolmonare, gli anticorpi contro N.meningitidis, gli anticorpi contro il DNA nel LES.

Immunoelettroforesi- uno dei metodi ampiamente utilizzati per l'analisi qualitativa degli antigeni. Avendo l'appropriato AS precipitante, può essere utilizzato per studiare qualsiasi miscela antigenica. In particolare vengono analizzate con successo le proteine ​​del siero del sangue, del liquido cerebrospinale, dell'urina, del latte, degli estratti di organi, nonché le proteine ​​di origine vegetale e batterica. In clinica, questo metodo viene spesso utilizzato nella diagnosi di paraproteinemia e condizioni di immunodeficienza. Nella medicina legale viene utilizzato per analizzare i sistemi dell'aptoglobina e del componente specifico del gruppo Gc.

Nel lavoro di ricerca, l'immunoelettroforesi funge da metodo principale per identificare le proteine ​​contenute in miscele complesse. È indispensabile come metodo di monitoraggio coerente del processo di purificazione dei preparati proteici. Viene spesso utilizzato anche per controllare l'autenticità e la purezza di questi farmaci. Naturalmente un metodo di così vasta applicazione ha dovuto essere modificato e migliorato in varie direzioni. Sono stati proposti nuovi supporti: gel di agarosio, PAGE, film di acetato di cellulosa.

Allo stesso tempo, l'IEF cominciò ad essere combinato con vari metodi di colorazione specifica e fluorocromatura per rilevare enzimi, carboidrati, lipoproteine ​​e nucleoproteine. Come risultato della combinazione con altri metodi analitici, sono recentemente emerse l'immunoelettroforesi su disco, l'immunoelettrofocalizzazione, la radioimmunoelettroforesi, ecc. Per la determinazione quantitativa utilizzando AS polispecifico è stata proposta l'IEF bidimensionale. Una modifica speciale dell'IEF bidimensionale può aumentare la sua sensibilità al livello RIA. Ciò si ottiene mediante eluizione elettroforetica dell'antigene da piccoli serbatoi di vetro da 0,1-10 ml. Per l'IEF con raffreddamento, Wime ha progettato un dispositivo che mantiene automaticamente una temperatura e una corrente costanti durante il processo di separazione.

Questo dispositivo è molto conveniente per determinare la mobilità elettroforetica di varie sostanze. L'uso del raffreddamento termoelettrico (batteria Peltier) in questo dispositivo è particolarmente consigliato quando si lavora con enzimi e altre sostanze termolabili. Recentemente è stato proposto un metodo semplice per separare le proteine ​​mediante elettroforesi bidimensionale. È noto un metodo sensibile per la determinazione dei sistemi antigene-anticorpo non precipitanti, basato sull'uso di mAbs, il cosiddetto IEF a cascata, che comprende la fissazione degli antigeni dopo l'elettroforesi, l'attacco degli anticorpi agli antigeni, la rimozione degli anticorpi legati e la loro quantità quantitativa valutazione.

Nel caso dell'elettroforesi di immunofissazione, viene separato l'AT, non l'antigene. Si tratta di un metodo rapido ed economico, particolarmente indicato per lo screening di massa per l'individuazione della paraproteinemia e per l'ottenimento di preparati proteici. Con l'IEF si osservano spesso disturbi nel normale corso del processo e non è sempre possibile rilevarne immediatamente la causa. Se, ad esempio, viene utilizzato un agar non sufficientemente purificato, ciò porta molto spesso a tre violazioni: scarsa formazione di gel, forte elettrosmosi e scarsa decolorazione dei preparati. L'agar non sufficientemente puro deve essere sempre pulito. Quando inizi a lavorare con una nuova porzione di agar, devi prima testarne l'idoneità. Si riscontra spesso che gli stessi antigeni hanno mobilità elettroforetica diversa e si colorano in modo diverso quando vengono consumati lotti diversi di agar. La causa dei disturbi dell'IEF può essere l'idrolisi dell'agar dovuta al riscaldamento ripetuto o troppo lungo.

L'idrolisi è indicata da un indebolimento delle proprietà di formazione del gel e dalla comparsa di irregolarità sulla superficie del gel. La separazione elettroforetica può essere compromessa se viene utilizzata la soluzione tampone sbagliata. La maggior parte dei tamponi costituisce un buon terreno fertile per batteri e muffe. Pertanto, la scorta tampone deve essere conservata in frigorifero oppure è necessario aggiungervi un conservante. Il tampone che riempie la camera elettroforetica deve essere cambiato almeno una volta alla settimana. Quando si utilizza più volte il tampone dell'elettrodo, è necessario cambiare i poli dell'elettrodo dopo ogni separazione. L'entità della tensione ai terminali della camera di solito non consente di giudicare l'intensità fisica della corrente che passa attraverso il gel, quindi è necessario collegare un milliamperometro in serie al circuito. Durante il processo di separazione la corrente aumenta quasi sempre. Questo fenomeno è causato dal riscaldamento del gel, che aumenta con l'aumentare della durata dell'elettroforesi.

Tuttavia, dopo l'aumento iniziale, la corrente nel circuito potrebbe diminuire. Ciò si verifica spesso a causa dell'essiccazione delle strisce di carta da filtro che collegano il gel al tampone, o anche a causa dell'essiccazione del gel stesso. In questo caso è necessario ridurre la forza ionica del buffer o la tensione ai terminali della camera. Inoltre, è possibile prevenire l'essiccazione avvolgendo la piastra di gel e le strisce di carta con una pellicola polimerica prima dell'elettroforesi. È più conveniente lavorare con una fonte che fornisca una intensità di corrente costante (stabilizzazione della corrente). Inutile dire che i risultati dell'IEF dipendono dalla qualità degli antigeni e degli antisieri.

ARTICOLO GENERALE DEI FARMACOPEI

Introdotto in sostituzione del metodo previsto dalla FS 42-3874-99

Questa monografia generale della farmacopea ha lo scopo di studiare la composizione antigenica dei materiali biologici, nonché di determinare la purezza, la composizione qualitativa e quantitativa dei medicinali immunobiologici (IMP) utilizzando il metodo dell'immunoelettroforesi (IEF) in un gel di agar, combinando i metodi di elettroforesi zonale e immunodiffusione.

Nel processo di immunoelettroforesi su gel o su pellicole di acetato di cellulosa utilizzando metodi di immunodiffusione semplice o doppia, si verifica una reazione tra proteine ​​solubili e anticorpi precipitanti specifici per esse. La determinazione quantitativa delle proteine ​​può essere effettuata mediante elettroforesi in un mezzo contenente anticorpi (test elettroimmunometrico, elettroimmunodiffusione, immunoelettroforesi a razzo). La natura antigenica dei componenti proteici può essere studiata confrontandoli con marcatori noti.

L'efficacia dei test immunochimici dipende dalla specificità degli antisieri utilizzati, nonché dal loro titolo e dalla loro affinità per gli antigeni.

Tipicamente, l'immunoelettroforesi è una combinazione di elettroforesi su gel di agar (o agarosio) seguita da doppia immunodiffusione nello stesso mezzo. Nella doppia immunodiffusione bidimensionale, l'antigene e gli anticorpi, posti in depressioni rotonde o rettangolari nel gel, migrano l'uno verso l'altro, dando luogo alla formazione di linee di precipitazione (archi) quando si incontrano. La posizione delle bande di precipitazione dipende dal coefficiente di diffusione dell'antigene e dalla sua concentrazione rispetto agli anticorpi (la velocità di diffusione dell'anticorpo può essere considerata costante). Un certo rapporto tra le concentrazioni di antigene e anticorpo, che è ottimale per la formazione di un precipitato, è chiamato zona di equivalenza. Ciò produce linee di precipitazione chiare.

Anche la concentrazione (titolo) degli anticorpi nel siero immune può variare in modo significativo. È possibile una situazione in cui le zone di equivalenza per i diversi componenti della miscela non si sovrappongono. Per selezionare un rapporto antigene-anticorpo equivalente, si consiglia di eseguire l'immunoelettroforesi di miscele multicomponente a diverse concentrazioni relative antigene-anticorpo, poiché l'utilizzo di una sola di tali concentrazioni potrebbe non rilevare alcuni componenti.

Metodo di immunoelettroforesi su gel di agar

Sul piano portaoggetti è posta rigorosamente in orizzontale una lastra di vetro di dimensioni 90x120 mm trattata con alcool. Il gel di agar raffreddato ad una temperatura di (45±5) 0 C viene applicato su una lastra di vetro in una quantità di 18,0-20,0 ml. Dopo l'indurimento a temperatura ambiente, dopo 20-30 minuti, sulla piastra si forma uno strato di agar dello spessore di 2,0 - 2,5 mm.

Dopo che il gel si è indurito, vengono ritagliati 6-7 fori con un diametro di 1-2 mm utilizzando uno stampino speciale. I pozzetti vengono riempiti con il campione in esame in un volume non superiore al volume del pozzetto (2 pozzetti per ciascun campione in esame). In questo caso, un campione di controllo viene aggiunto ai pozzetti superiore e inferiore della lastra di vetro con il gel - siero di sangue umano normale ("Campione standard del sistema di test per determinare la composizione frazionaria (antigenica) dei preparati da siero di sangue umano mediante immunoelettroforesi" o altro campione di controllo in conformità con le istruzioni nella monografia della farmacopea o nella documentazione normativa), colorato con pironina B (o altro colorante specificato nella monografia della farmacopea o nella documentazione normativa).

Aggiungere 500 ml di soluzione tampone veronal-medinale o borato in un cilindro graduato con una capacità di 1000 ml, regolare il volume della soluzione fino alla tacca con acqua purificata e mescolare. La soluzione risultante (o un'altra soluzione tampone specificata nella monografia della farmacopea o nella documentazione normativa) viene versata nelle sezioni degli elettrodi della camera del dispositivo per elettroforesi.

La piastra con il gel preparato viene posta in un dispositivo per elettroforesi e collegata ad una soluzione tampone nelle camere degli elettrodi del dispositivo utilizzando diversi strati di carta da filtro. Nel caso di un dispositivo per elettroforesi che prevede il collegamento dell'agar su una piastra con un tampone per elettrodi utilizzando colonne di agar, la piastra viene installata in un dispositivo bilanciato e colata con agar fuso fino a quando non si combina con le colonne di agar e uno strato di gel Si forma uno spessore di 1 - 2 mm.

Il dispositivo per elettroforesi è coperto da un coperchio e la fonte di alimentazione è accesa (tensione 70-200 V, corrente 10-40 mA). L'elettroforesi viene condotta per 1,5-3 ore finché la macchia della pironina B, corrispondente alla migrazione dell'albumina, si trova ad una distanza di 20-25 mm dal pozzetto.

Dopo l'elettroforesi, tra i pozzetti nel gel di agar vengono tagliate delle “scanalature” longitudinali (parallele alla direzione di migrazione) utilizzando uno stencil speciale. Nelle “scanalature” vengono aggiunti 0,25 ml di antisiero precipitante: contro le proteine ​​del siero del sangue umano (durante il test della composizione frazionata) o siero polivalente contro le proteine ​​del siero del sangue umano, bovino, equino e suino (per confermare l'autenticità).

La piastra con gel di agar viene posta in una camera umida e mantenuta ad una temperatura di (5 ± 3) 0 C per 24 - 48 ore.

Per lavare via le proteine ​​che non sono entrate nella reazione di precipitazione, la piastra di agar viene posta in cuvette, riempita con una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% e incubata per 16-18 ore. La soluzione viene cambiata 3-4 volte. La piastra viene quindi rimossa dalla soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%, ricoperta con carta da filtro imbevuta di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% ed essiccata all'aria fino a quando il gel di agar si trasforma in una pellicola sottile. Successivamente la piastra con il gel essiccato viene ricoperta con carta da filtro imbevuta in una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%, senza lasciare bolle d'aria, ed essiccata a temperatura ambiente o in forno a temperatura non superiore a 40°C. Dopo aver asciugato la piastra, la carta da filtro viene inumidita con acqua e rimossa con cura.

Per colorare le proteine, utilizzare il colorante nero ammidico 10B o un altro colorante adatto (secondo le istruzioni della monografia della farmacopea o della documentazione normativa), ponendo la piastra in una cuvetta con una soluzione colorante per 30-40 minuti. Quindi la piastra viene lavata in una soluzione per il lavaggio dell'agar (soluzione di acido acetico al 2% o altra soluzione, secondo le istruzioni nella documentazione normativa) per 15-40 minuti fino alla completa assenza dello sfondo colorato e nuovamente asciugata a temperatura ambiente oppure in armadio di essiccazione a temperatura non superiore a 40°C.

Le lipoproteine ​​vengono colorate con il nero Sudan B. Per la colorazione, le piastre completamente essiccate vengono poste in una soluzione colorante per 3 ore, quindi decolorate con etanolo al 50% fino a quando lo sfondo non è completamente schiarito. Le lipoproteine ​​sono colorate in blu scuro. La colorazione deve essere eseguita su una preparazione completamente asciutta, poiché il nero Sudan B è insolubile in acqua e colora il gel bagnato.

La contabilità dei risultati quando si studia la composizione frazionaria dei preparati immunoglobulinici umani viene effettuata visivamente confrontando l'elettroferogramma del campione di prova con l'elettroferogramma del campione di controllo - siero di sangue umano normale ("Campione standard del sistema di test per determinare il frazionario ( antigenico) composizione di preparati da siero di sangue umano mediante immunoelettroforesi" o altro campione di controllo secondo le istruzioni nella documentazione normativa), che deve presentare un numero regolamentato di linee di precipitazione con siero contro proteine ​​del siero umano (almeno 15 linee di precipitazione quando si utilizza il "Sistema di analisi dei campioni standard per determinare la composizione frazionaria (antigenica) dei farmaci dal metodo di immunoelettroforesi su siero di sangue umano"). Il componente principale della preparazione immunoglobulinica umana deve corrispondere all'immunoglobulina G (Ig G) del siero di sangue umano normale.

La contabilità dei risultati quando si conducono studi per confermare l'autenticità dei prodotti sanguigni umani viene effettuata visivamente identificando le linee di precipitazione con siero contro proteine ​​sieriche nel sangue di esseri umani, bovini, cavalli e suini. Le linee di precipitazione devono essere rilevate solo con siero contro proteine ​​del siero umano.

Appunti

1. Preparazione della soluzione tampone veronal-medinale 0,05 M(pH 8,6±0,1). Aggiungere in un matraccio tarato da 1000 ml 1,38 g di veronal e 8,76 g di medinal, aggiungere acqua depurata fino a volume e mescolare fino a completa dissoluzione.

1. Preparazione della soluzione tampone borato 0,05 M(pH 8,6±0,1). In un matraccio tarato da 1000 ml aggiungere 6,7 g di acido borico, 13,4 g di tetraborato di sodio 10-acquoso, aggiungere acqua depurata fino a portare a volume e mescolare.
2. Preparazione del gel di agar all'1,25%.. Il gel di agar viene preparato utilizzando uno dei seguenti metodi:
3. Per preparare un gel di agar all'1,25%, utilizzare tampone veronal-medinale 0,05 M (pH 8,6 ± 0,1) con una concentrazione doppia di sali (rispettivamente 2,76 g di veronal e 17,52 g di medinale per 1000 ml di acqua purificata).
4. Per preparare il gel di agar all'1,25%, utilizzare una soluzione tampone borato (pH 8,6±0,1) con una concentrazione doppia di sali (rispettivamente: 13,4 g di acido borico e 26,8 g di sodio tetraborato 10-acquoso per 1000 ml di acqua depurata).

In un becher della capacità di 1000 ml si aggiungono 12,5 g di agar, si aggiungono 500 ml di acqua purificata e si lascia rigonfiare il gel per un'ora alla temperatura di (20±1) 0 C. Il becher con il contenuto viene posto a bagnomaria bollente e conservato fino al completo scioglimento dell'agar. Il volume della soluzione gel viene regolato a 500 ml con acqua, quindi viene aggiunto un volume uguale di soluzione tampone veronal-medinale o borato (o altra soluzione tampone specificata nella monografia della farmacopea o nella documentazione normativa). La soluzione di agar viene filtrata attraverso 2-3 strati di garza, si aggiunge tiomersale ad una concentrazione di 100 μg/ml e si versa in flaconi da 40-50 ml (la quantità necessaria per due piastre). L'agar fuso dovrebbe essere limpido.

1. Preparazione della soluzione colorante amido nero 10B. La soluzione colorante viene preparata in uno dei seguenti modi:
2. Aggiungere 1,0 g di ammide nera 10B, 450 ml di soluzione di acido acetico 0,1 M, 550 ml di soluzione di acetato di sodio 0,1 M in un matraccio tarato da 1000 ml e mescolare.
3. Aggiungere 1,0 g di amido nero 10B e 100 ml di acido acetico glaciale in un matraccio tarato da 1000 ml, portare il volume alla tacca con acqua depurata e mescolare. Dopo 12 ore filtrare su filtro di carta.
4. Preparazione della soluzione colorante Nero Sudan V. Aggiungere 1,2 g di Sudan B nero, 20 ml di soluzione di idrossido di sodio 1M, 380 ml di acqua depurata in un matraccio tarato da 1000 ml e portare il volume della soluzione con etanolo assoluto alla tacca e mescolare. La miscela viene fatta bollire per un breve periodo, raffreddata a temperatura ambiente e dopo il raffreddamento la tintura viene versata in una bottiglia scura con tappo smerigliato. Il reagente viene conservato a temperatura ambiente per 3 mesi.
5. Preparazione di una soluzione di acido acetico al 2% per il lavaggio dell'agar. Aggiungere 20,0 ml di acido acetico glaciale in un matraccio tarato da 1000 ml, portare il volume della soluzione alla tacca con acqua depurata e mescolare. Il reagente viene conservato a temperatura ambiente per 3 mesi.