Virologia: quali infezioni vengono studiate. Metodi di ricerca virologica

metodi per studiare la biologia dei virus e la loro identificazione. In virologia sono ampiamente utilizzati metodi di biologia molecolare, con l'aiuto dei quali è stato possibile stabilire la struttura molecolare delle particelle virali, i metodi della loro penetrazione nella cellula e le caratteristiche della riproduzione virale, la struttura primaria degli acidi nucleici virali e delle proteine. Sono in fase di sviluppo metodi per determinare la sequenza degli elementi costitutivi degli acidi nucleici virali e degli amminoacidi proteici. Diventa possibile collegare le funzioni degli acidi nucleici e delle proteine ​​che codificano con la sequenza nucleotidica e stabilire le cause dei processi intracellulari che svolgono un ruolo importante nella patogenesi dell'infezione virale.

I metodi di ricerca virologica si basano anche su processi immunologici (interazione dell'antigene con anticorpi), proprietà biologiche del virus (capacità di emoagglutinazione, emolisi, attività enzimatica), caratteristiche dell'interazione del virus con la cellula ospite (caratteristica dell'effetto citopatico , formazione di inclusioni intracellulari, ecc.).

Nella diagnosi delle infezioni virali, nella coltivazione, isolamento e identificazione dei virus, nonché nella produzione di preparati vaccinali, il metodo della coltura di tessuti e cellule è ampiamente utilizzato. Vengono utilizzate colture cellulari primarie, secondarie, stabili continue e diploidi. Le colture primarie si ottengono disperdendo i tessuti con enzimi proteolitici (tripsina, collagenasi). La fonte delle cellule può essere tessuti e organi (solitamente reni) di embrioni umani e animali. Una sospensione di cellule in un mezzo nutritivo viene posta nei cosiddetti materassi, bottiglie o capsule di Petri, dove, dopo essersi attaccate alla superficie del vaso, le cellule iniziano a moltiplicarsi. Per l'infezione da virus, viene solitamente utilizzato un monostrato cellulare. Il liquido nutriente viene drenato, viene aggiunta la sospensione virale in determinate diluizioni e, dopo il contatto con le cellule, viene aggiunto un mezzo nutritivo fresco, solitamente senza siero.

Le cellule della maggior parte delle colture primarie possono essere sottocoltivate; tale coltura è chiamata coltura secondaria. Con l'ulteriore passaggio delle cellule, si forma una popolazione di cellule simili ai fibroblasti, capaci di riprodursi rapidamente, la maggior parte delle quali conserva l'insieme originale di cromosomi. Queste sono le cosiddette cellule diploidi. Coltivando in serie le cellule si ottengono colture cellulari continue e stabili. Durante i passaggi compaiono cellule omogenee in rapida divisione con un set di cromosomi eteroploidi. Le linee cellulari stabili possono essere a strato singolo o in sospensione. Le colture a strato singolo crescono sotto forma di uno strato continuo sulla superficie del vetro, mentre le colture in sospensione crescono sotto forma di sospensioni in vari recipienti utilizzando dispositivi di miscelazione. Esistono più di 400 linee cellulari derivate da 40 diverse specie animali (tra cui primati, uccelli, rettili, anfibi, pesci, insetti) e umane.

Pezzi di singoli organi e tessuti (colture di organi) possono essere coltivati ​​in terreni nutritivi artificiali. Questi tipi di colture preservano la struttura dei tessuti, che è particolarmente importante per l’isolamento e il passaggio dei virus che non si riproducono nelle colture di tessuti indifferenziati (ad esempio i coronavirus).

Nelle colture cellulari infette, i virus possono essere rilevati dai cambiamenti nella morfologia cellulare, dagli effetti citopatici, che possono essere specifici, dalla comparsa di inclusioni, determinando gli antigeni virali nella cellula e nel fluido di coltura; determinazione delle proprietà biologiche della progenie virale nel fluido di coltura e titolazione dei virus nelle colture di tessuti, embrioni di pollo o animali sensibili; identificando singoli acidi nucleici virali nelle cellule mediante ibridazione molecolare o accumuli di acidi nucleici mediante metodo citochimico utilizzando la microscopia a fluorescenza.

L’isolamento dei virus è un processo laborioso e dispendioso in termini di tempo. Viene effettuato per determinare il tipo o la variante del virus che circola nella popolazione (ad esempio, per identificare una sierovariante del virus dell'influenza, un ceppo selvatico o vaccinale del virus della poliomielite, ecc.); nei casi in cui è necessario attuare misure epidemiologiche urgenti; quando compaiono nuovi tipi o varianti di virus; se necessario, confermare la diagnosi preliminare; per l'indicazione di virus negli oggetti ambientali. Quando si isolano i virus, viene presa in considerazione la possibilità della loro persistenza nel corpo umano, nonché il verificarsi di un'infezione mista causata da due o più virus. Una popolazione geneticamente omogenea del virus ottenuta da un virione è chiamata clone virale e il processo per ottenerlo è chiamato clonazione.

Per isolare i virus, viene utilizzata l'infezione di animali da laboratorio sensibili e embrioni di pollo, ma molto spesso viene utilizzata la coltura dei tessuti. La presenza di un virus è solitamente determinata dalla degenerazione cellulare specifica (effetto citopatico), dalla formazione di simplasti e sincizi, dal rilevamento di inclusioni intracellulari, nonché da un antigene specifico rilevato mediante immunofluorescenza, emoassorbimento, emoagglutinazione (per virus emoagglutinanti), ecc. . Questi segni possono essere rilevati solo dopo 2-3 passaggi del virus.

Per isolare un numero di virus, come i virus dell'influenza, vengono utilizzati embrioni di pollo e per isolare alcuni virus Coxsackie e un numero di arbovirus, vengono utilizzati topi neonati. L'identificazione dei virus isolati viene effettuata utilizzando reazioni sierologiche e altri metodi.

Quando si lavora con i virus, viene determinato il loro titolo. La titolazione dei virus viene solitamente effettuata in coltura tissutale, determinando la massima diluizione del liquido contenente virus alla quale si verifica la degenerazione dei tessuti, si formano inclusioni e antigeni specifici del virus. Il metodo della placca può essere utilizzato per titolare un numero di virus. Le placche, o colonie virali negative, sono focolai di cellule distrutte dal virus in una coltura di tessuto a strato singolo ricoperta di agar. Il conteggio delle colonie consente un'analisi quantitativa dell'attività infettiva dei virus sulla base del fatto che una particella virale infettiva forma una placca. Le placche vengono rilevate colorando la coltura con coloranti intravitali, solitamente rosso neutro; le placche non assorbono il colorante e sono quindi visibili come punti luminosi sullo sfondo delle cellule viventi colorate. Il titolo del virus è espresso come il numero di unità formanti placca per 1 ml.

La purificazione e la concentrazione dei virus vengono solitamente eseguite mediante ultracentrifugazione differenziale seguita da centrifugazione a concentrazione o in gradiente di densità. Per purificare i virus vengono utilizzati metodi immunologici, cromatografia a scambio ionico, immunoassorbenti, ecc.

La diagnosi di laboratorio delle infezioni virali comprende il rilevamento dell'agente patogeno o dei suoi componenti nel materiale clinico; isolare il virus da questo materiale; sierodiagnosi. La scelta del metodo diagnostico di laboratorio in ogni singolo caso dipende dalla natura della malattia, dal periodo di malattia e dalle capacità del laboratorio. La moderna diagnostica delle infezioni virali si basa su metodi rapidi che consentono di ottenere una risposta diverse ore dopo l'assunzione di materiale clinico nelle prime fasi dopo la malattia. Questi includono la microscopia elettronica e immunitaria, nonché l'immunofluorescenza, il metodo di ibridazione molecolare , rilevamento di anticorpi della classe IgM, ecc.

La microscopia elettronica dei virus colorati negativamente consente di differenziare i virus e determinarne la concentrazione. L’uso della microscopia elettronica nella diagnosi delle infezioni virali è limitato a quei casi in cui la concentrazione di particelle virali nel materiale clinico è piuttosto elevata (10 5 su 1 ml e superiori). Lo svantaggio del metodo è l'incapacità di distinguere virus appartenenti allo stesso gruppo tassonomico. Questa carenza viene superata mediante l’uso della microscopia elettronica immunitaria. Il metodo si basa sulla formazione di immunocomplessi aggiungendo siero specifico alle particelle virali, concentrando contemporaneamente le particelle virali, consentendone l'identificazione. Il metodo viene utilizzato anche per rilevare gli anticorpi. Per specifici scopi diagnostici, viene effettuato l'esame al microscopio elettronico di estratti di tessuti, feci, liquido delle vescicole e secrezioni del rinofaringe. La microscopia elettronica è ampiamente utilizzata per studiare la morfogenesi del virus; le sue capacità vengono ampliate con l'uso di anticorpi marcati;

Il metodo di ibridazione molecolare, basato sul rilevamento degli acidi nucleici specifici del virus, consente di rilevare singole copie di geni e non ha eguali in termini di sensibilità. La reazione si basa sull'ibridazione di filamenti complementari di DNA o RNA (sonde) e sulla formazione di strutture a doppio filamento. La sonda più economica è il DNA ricombinante clonato. La sonda è marcata con precursori radioattivi (solitamente fosforo radioattivo). L'uso di reazioni colorimetriche è promettente. Esistono diverse opzioni per l'ibridazione molecolare: ibridazione spot, ibridazione blot, ibridazione sandwich, ibridazione in situ, ecc.

Gli anticorpi della classe IgM compaiono prima degli anticorpi della classe G (al 3°-5° giorno di malattia) e scompaiono dopo alcune settimane, quindi la loro rilevazione indica un'infezione recente. Gli anticorpi della classe lgM vengono rilevati mediante immunofluorescenza o mediante dosaggio immunoenzimatico utilizzando antisieri anti-μ (sieri contro le catene pesanti di lgM).

I metodi sierologici in virologia si basano su reazioni immunologiche classiche (vedi Metodi di ricerca immunologica) : reazioni di fissazione del complemento, inibizione dell'emoagglutinazione, neutralizzazione biologica, immunodiffusione, emoagglutinazione indiretta, emolisi radiale, immunofluorescenza, dosaggio immunoenzimatico, dosaggio radioimmunologico. Sono stati sviluppati micrometodi per molte reazioni e le loro tecniche vengono costantemente migliorate. Questi metodi vengono utilizzati per identificare i virus utilizzando un set di sieri noti e per la sierodiagnosi per determinare l'aumento degli anticorpi nel secondo siero rispetto al primo (il primo siero viene prelevato nei primi giorni dopo la malattia, il secondo - dopo 2- 3 settimane). Un valore diagnostico non è inferiore a un aumento quadruplicato degli anticorpi nel secondo siero. Se il rilevamento di anticorpi della classe IgM indica un'infezione recente, gli anticorpi della classe IgC persistono per diversi anni e talvolta per tutta la vita.

Per identificare singoli antigeni di virus e anticorpi contro di essi in miscele complesse senza purificazione preliminare delle proteine, viene utilizzato l'immunoblotting. Il metodo combina il frazionamento delle proteine ​​mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide con la successiva immunoindicazione delle proteine ​​mediante il metodo del dosaggio immunoenzimatico. La separazione delle proteine ​​riduce i requisiti di purezza chimica dell'antigene e rende possibile l'identificazione delle singole coppie antigene-anticorpo. Questo compito è rilevante, ad esempio, nella sierodiagnosi dell'infezione da HIV, dove le reazioni false positive del test immunoassorbente legato all'enzima sono causate dalla presenza di anticorpi contro antigeni cellulari, che sono presenti a causa di un'insufficiente purificazione delle proteine ​​​​virali. L'identificazione degli anticorpi nei sieri dei pazienti contro gli antigeni virali interni ed esterni consente di determinare lo stadio della malattia e, quando si analizzano le popolazioni, la variabilità delle proteine ​​virali. L'immunoblotting per l'infezione da HIV viene utilizzato come test di conferma per identificare i singoli antigeni virali e gli anticorpi contro di essi. Quando si analizzano le popolazioni, il metodo viene utilizzato per determinare la variabilità delle proteine ​​virali. Il grande valore del metodo risiede nella possibilità di analizzare gli antigeni sintetizzati utilizzando la tecnologia del DNA ricombinante, determinandone le dimensioni e la presenza di determinanti antigenici.

20) Il principale componente strutturale dei virioni (particelle virali complete) è un nucleocapside, cioè l'involucro proteico (capside) che contiene il genoma virale (DNA o RNA). Il nucleocapside della maggior parte delle famiglie virali è circondato da un involucro lipoproteico. Tra l'involucro e il nucleocapside di alcuni virus (orto-, paramixo-, rabdo-, filo- e retrovirus) è presente una proteina della matrice non glicosilata che conferisce ulteriore rigidità ai virioni. I virus della maggior parte delle famiglie hanno un involucro, che svolge un ruolo importante nell'infettività. I virioni acquisiscono il loro guscio esterno quando il nucleocapside penetra nella membrana cellulare per gemmazione. Le proteine ​​dell'involucro sono codificate dal virus e i lipidi vengono prelevati dalla membrana cellulare. Le glicoproteine, solitamente sotto forma di dimeri e trimeri, formano peplomeri (sporgenze) sulla superficie dei virioni (orto-, paramixovirus, rabdo-, phylo-, corona-, bunya-, arena-, retrovirus). Le proteine ​​di fusione glicosilate sono associate ai peplomeri e svolgono un ruolo chiave nell'ingresso del virus nella cellula. I capsidi e gli involucri dei virioni sono formati da copie multiple di uno o più tipi di subunità proteiche attraverso un processo di autoassemblaggio. L'interazione nel sistema proteina-proteina, dovuta a deboli legami chimici, porta all'associazione di capsidi simmetrici. Le differenze tra i virus nella forma e nella dimensione dei virioni dipendono dalla forma, dalla dimensione e dal numero delle subunità proteiche strutturali e dalla natura dell'interazione tra loro. Il capside è costituito da molte subunità morfologicamente distinte (capsomeri), assemblate da polipeptidi virali in modo rigorosamente definito, secondo principi geometrici relativamente semplici. Le subunità proteiche, collegandosi tra loro, formano capsidi di due tipi di simmetria: isometrica ed elicoidale. La struttura del nucleocapside dei virus con involucro è simile alla struttura del nucleocapside dei virus senza involucro. Sulla superficie del guscio del virus si distinguono le strutture glicoproteiche morfologicamente espresse - i peplomeri. La composizione del guscio del supercapside comprende lipidi (fino al 20-35%) e carboidrati (fino al 7-8%) di origine cellulare. È costituito da un doppio strato di lipidi cellulari e proteine ​​virus-specifiche situate all'esterno e all'interno del biostrato lipidico. Lo strato esterno del guscio del supercapside è rappresentato da peplomeri (sporgenze) di uno o più tipi, costituiti da una o più molecole di glicoproteina. Il nucleocapside dei virus rivestiti è spesso chiamato nucleo, mentre la parte centrale dei virioni, contenente l'acido nucleico, è chiamata nucleoide. I capsomeri (peplomeri) sono costituiti da unità strutturali costituite da una o più catene polipeptidiche omologhe o eterologhe (subunità proteiche). classificazione dei virus I capsidi isometrici non sono sfere, ma poliedri regolari (icosaedri). Le loro dimensioni lineari sono identiche lungo gli assi di simmetria. Secondo Kaspar e Klug (1962), i capsomeri nei capsidi sono disposti secondo la simmetria icosaedrica. Tali capsidi sono costituiti da subunità identiche che formano un icosaedro. Hanno 12 vertici (angoli), 30 facce e 20 superfici sotto forma di triangoli isosceli. Secondo questa regola, il capside del poliovirus e del virus dell'afta epizootica è formato da 60 unità strutturali proteiche, ciascuna delle quali è costituita da quattro catene polipeptidiche. L'icosaedro risolve in modo ottimale il problema di compattare le subunità ripetitive in una struttura rigorosa e compatta con un volume minimo. Solo alcune configurazioni di subunità strutturali possono formare superfici e formare vertici e facce dell'icosaedro virale. Ad esempio, le subunità strutturali dell'adenovirus formano capsomeri esagonali (esoni) sulle superfici e sui bordi e capsomeri pentaedrici (peptoni) sulle parti superiori. In alcuni virus, entrambi i tipi di capsomeri sono formati dagli stessi polipeptidi, in altri da polipeptidi diversi. Poiché le subunità strutturali dei diversi virus differiscono tra loro, alcuni virus appaiono più esagonali, altri più sferici. Tutti i virus vertebrati conosciuti contenenti DNA, ad eccezione dei virus del vaiolo, così come molti virus contenenti RNA (7 famiglie), hanno una simmetria capside di tipo cubico. I Reovirus, a differenza di altri virus vertebrati, hanno un doppio capside (esterno ed interno), ciascuno costituito da unità morfologiche. I virus con simmetria di tipo elicoidale hanno l'aspetto di una struttura filiforme cilindrica; il loro RNA genomico ha la forma di un'elica e si trova all'interno del capside; Tutti i virus animali a simmetria elicoidale sono circondati da un involucro lipoproteico. I nucleocapsidi elicoidali sono caratterizzati da lunghezza, diametro, passo dell'elica e numero di capsomeri per giro dell'elica. Pertanto, nel virus Sendai (paramyxovirus), il nucleocapside è un'elica lunga circa 1 μm, 20 nm di diametro e 5 nm di passo. Il capside è costituito da circa 2400 unità strutturali, ciascuna delle quali è una proteina con un peso molecolare di 60 kDa. Ci sono 11-13 subunità per ogni giro dell'elica. Nei virus con un tipo elicoidale di simmetria nucleocapside, il ripiegamento delle molecole proteiche in un'elica garantisce la massima interazione tra l'acido nucleico e le subunità proteiche. Nei virus icosaedrici, l'acido nucleico è avvolto all'interno dei virioni e interagisce con uno o più polipeptidi situati all'interno del capside.

Antirecettori (recettori) Virali- proteine ​​virioniche di superficie, ad esempio l'emoagglutinina, che si legano in modo complementare al corrispondente recettore della cellula suscettibile.

21) Metodi immunologici negli studi virologici.

I test sierologici variano nella loro capacità di rilevare singole classi di anticorpi. Il test di agglutinazione, ad esempio, rileva bene gli anticorpi IgG, ma è meno sensibile per rilevare gli anticorpi IgG. Le reazioni di fissazione del complemento e di emolisi, che richiedono il complemento, non vengono rilevate dagli anticorpi che non fissano il complemento, come gli anticorpi IgA e gli anticorpi IgE. La reazione di neutralizzazione del virus coinvolge solo anticorpi diretti contro i determinanti antigenici della superficie virionica associati alla patogenicità. Sensibilità I. m. supera tutti gli altri metodi per lo studio degli antigeni e degli anticorpi; in particolare, i test radioimmunologici e immunoenzimatici consentono di rilevare la presenza di proteine ​​in quantità misurate in nanogrammi e persino picogrammi. Con l'aiuto di I. m. determinare il gruppo e verificare la sicurezza del sangue (epatite B e infezione da HIV). Durante il trapianto di tessuti e organi, I. m. consentono di determinare la compatibilità dei tessuti e di testare metodi per eliminare l'incompatibilità. In medicina legale, la reazione di Castellani viene utilizzata per determinare la specie-specificità di una proteina e la reazione di agglutinazione per determinare il gruppo sanguigno.

I metodi immunologici sono ampiamente utilizzati nella diagnosi di laboratorio delle malattie infettive. L'eziologia della malattia viene stabilita anche in base all'aumento degli anticorpi contro l'agente patogeno nel siero del sangue convalescente rispetto ad un campione prelevato nei primi giorni della malattia. Basato su I. m. studiare l'immunità della popolazione alle infezioni di massa, come l'influenza, e valutare anche l'efficacia delle vaccinazioni preventive.

A seconda del loro meccanismo e tenendo conto dei risultati di I. m. può essere suddiviso in reazioni basate sul fenomeno dell'agglutinazione; reazioni basate sul fenomeno della precipitazione; reazioni che coinvolgono il complemento; reazione di neutralizzazione; Reazioni che utilizzano metodi chimici e fisici.

Reazioni basate sul fenomeno dell'agglutinazione. L'agglutinazione è l'incollaggio di cellule o singole particelle che trasportano un antigene con l'aiuto del siero immunitario a questo antigene.

La reazione di agglutinazione batterica utilizzando l'apposito siero antibatterico è una delle reazioni sierologiche più semplici. Una sospensione di batteri viene aggiunta a varie diluizioni del siero sanguigno in esame e dopo un certo tempo di contatto a t°37° si registra a quale diluizione più alta si verifica l'agglutinazione del siero sanguigno. La reazione di agglutinazione batterica viene utilizzata per diagnosticare molte malattie infettive: brucellosi, tularemia, febbre tifoide e paratifoide, dissenteria bacillare, tifo.

Reazione di emoagglutinazione passiva o indiretta (RPHA, RNHA). Utilizza globuli rossi o materiali sintetici neutri (ad esempio particelle di lattice), sulla cui superficie vengono assorbiti antigeni (batterici, virali, tissutali) o anticorpi. La loro agglutinazione avviene quando vengono aggiunti sieri o antigeni appropriati.

La reazione di emoagglutinazione passiva viene utilizzata per diagnosticare malattie causate da batteri (febbre tifoide e paratifoide, dissenteria, brucellosi, peste, colera, ecc.), protozoi (malaria) e virus (influenza, infezioni adenovirus, epatite virale B, morbillo, zecca). encefalite trasmessa, febbre emorragica di Crimea, ecc.), nonché per determinare alcuni ormoni, per identificare l'ipersensibilità del paziente a farmaci e ormoni, come la penicillina e l'insulina.

La reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (HAI) si basa sul fenomeno del siero immunitario che previene (inibisce) l'emoagglutinazione degli eritrociti da parte dei virus e viene utilizzata per rilevare e titolare gli anticorpi antivirali. Serve come metodo principale per la sierodiagnosi dell'influenza, del morbillo, della rosolia, della parotite, dell'encefalite trasmessa dalle zecche e di altre infezioni virali, i cui agenti causali hanno proprietà emoagglutinanti. ad esempio, per la sierodiagnosi dell'encefalite trasmessa da zecche, nei pozzetti del pannello vengono versate diluizioni doppie del siero del paziente in una soluzione tampone di borato alcalino. Successivamente viene aggiunta una certa quantità, solitamente 8 AU (unità agglutinanti), di antigene dell'encefalite da zecche e dopo 18 ore di esposizione a t°4°, viene aggiunta una sospensione di globuli rossi d'oca preparati in una soluzione acida tamponata con fosfato. . Se il siero del sangue del paziente contiene anticorpi contro il virus dell'encefalite trasmessa dalle zecche, l'antigene viene neutralizzato e non si verifica l'agglutinazione dei globuli rossi.

Reazioni basate sul fenomeno delle precipitazioni. La precipitazione si verifica a seguito dell'interazione degli anticorpi con antigeni solubili. L'esempio più semplice di reazione di precipitazione è la formazione in una provetta di una banda di precipitazione opaca al limite della stratificazione dell'antigene sull'anticorpo. Sono ampiamente utilizzati vari tipi di reazioni di precipitazione in agar semiliquido o gel di agarosio (metodo della doppia immunodiffusione secondo Ouchterlohn, metodo dell'immunodiffusione radiale, immunoelettroforesi), che sono sia di natura qualitativa che quantitativa. Come risultato della libera diffusione di antigeni e anticorpi nel gel nella zona del loro rapporto ottimale, si formano complessi specifici: bande di precipitazione, che vengono rilevate visivamente o mediante colorazione. Una particolarità del metodo è che ciascuna coppia antigene-anticorpo forma una banda di precipitazione individuale e la reazione non dipende dalla presenza di altri antigeni e anticorpi nel sistema in esame.

Le reazioni che coinvolgono il complemento, che è siero di sangue fresco di cavia, si basano sulla capacità del sottocomponente Clq del complemento e quindi di altri componenti del complemento di legarsi agli immunocomplessi.

La reazione di fissazione del complemento (CFR) consente la titolazione di antigeni o anticorpi in base al grado di fissazione del complemento da parte del complesso antigene-anticorpo. Questa reazione consiste di due fasi: l'interazione dell'antigene con il siero del sangue analizzato (sistema di test) e l'interazione del siero emolitico con i globuli rossi di pecora (sistema di indicatori). Con una reazione positiva nel sistema in esame, si verifica la fissazione del complemento e quindi con l'aggiunta di eritrociti sensibilizzati dagli anticorpi non si osserva emolisi. La reazione viene utilizzata per la sierodiagnosi della sifilide (reazione di Wassermann), delle infezioni virali e batteriche.

La reazione di neutralizzazione si basa sulla capacità degli anticorpi di neutralizzare alcune funzioni specifiche degli antigeni macromolecolari o solubili, ad esempio l'attività enzimatica, le tossine batteriche e la patogenicità virale. La reazione di neutralizzazione delle tossine può essere valutata in base all'effetto biologico, ad esempio vengono titolati i sieri antitetanici e antibotulinici. Una miscela di tossina e antisiero somministrata agli animali non ne provoca la morte. In virologia vengono utilizzate varie versioni della reazione di neutralizzazione. Mescolando i virus con l'antisiero appropriato e introducendo questa miscela negli animali o nelle colture cellulari, la patogenicità dei virus viene neutralizzata e gli animali non si ammalano e le cellule delle colture non vengono distrutte.

Reazioni mediante etichette chimiche e fisiche. L'immunofluorescenza prevede l'uso di anticorpi marcati con fluorocromo, più precisamente, della frazione immunoglobulinica degli anticorpi IgG. Un anticorpo marcato con un fluorocromo forma un complesso antigene-anticorpo con un antigene, che diventa accessibile all'osservazione al microscopio nei raggi UV che eccitano il fluorocromo. La reazione di immunofluorescenza diretta viene utilizzata per studiare gli antigeni cellulari, rilevare virus nelle cellule infette e rilevare batteri e rickettsie negli strisci.

Il metodo dell'immunofluorescenza indiretta è più ampiamente utilizzato. basato sulla rilevazione del complesso antigene-anticorpo utilizzando siero immunitario luminescente contro gli anticorpi IgG e utilizzato per rilevare non solo gli antigeni, ma anche titolare gli anticorpi.

I metodi immunoenzimatici, o immunoenzimatici, si basano sull'uso di anticorpi coniugati con enzimi, principalmente perossidasi di rafano o fosfatasi alcalina. Simile all'immunofluorescenza, il metodo del dosaggio immunoenzimatico viene utilizzato per rilevare gli antigeni nelle cellule o titolare gli anticorpi sulle cellule contenenti antigeni.

Il metodo radioimmunologico si basa sull'uso di marcatori radioisotopici di antigeni o anticorpi. È il metodo più sensibile per la determinazione di antigeni e anticorpi; viene utilizzato per determinare ormoni, farmaci e antibiotici, per diagnosticare malattie batteriche, virali, da rickettsie, protozoari, per studiare le proteine ​​del sangue e gli antigeni dei tessuti.

L'immunoblotting viene utilizzato per rilevare anticorpi contro singoli antigeni o per "riconoscere" antigeni da sieri noti. Il metodo consiste in 3 fasi: separazione delle macromolecole biologiche (ad esempio un virus) in singole proteine ​​mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide; trasferire le proteine ​​separate dal gel ad un supporto solido (blot) posizionando una piastra di gel di poliacrilammide su carta attivata o nitrocellulosa (elettroblotting); rilevazione delle proteine ​​desiderate sul substrato mediante saggio immunoenzimatico diretto o indiretto. L'immunoblotting è utilizzato come metodo diagnostico per l'infezione da HIV. La rilevazione di anticorpi contro una delle proteine ​​dell'involucro esterno del virus ha valore diagnostico.

22) Tipi di simmetria dei virus (cubico, spirale, misto). Interazione di proteine ​​e acidi nucleici durante il confezionamento dei genomi virali.

A seconda dell'interazione del capside con l'acido nucleico, le particelle virali possono essere suddivise in diversi tipi di simmetria:

1). Tipo di simmetria cubica.

I capsidi cubici sono icosideri con circa 20 superfici triangolari e 12 vertici. Formano una struttura che ricorda una formazione sferica, ma in realtà è un poliedro. In alcuni casi, speciali formazioni lipoproteiche chiamate spine sono attaccate ai vertici di tali poliedri icosaedrici. Il ruolo di questi picchi è presumibilmente ridotto all'interazione dei virioni o particelle virali con le corrispondenti aree delle cellule ospiti ad essi sensibili. Con simmetria cubica, l'acido nucleico virale è strettamente compresso (arrotolato in una palla) e le molecole proteiche lo circondano, formando un poliedro (icosaedro). Un icosaedro è un poliedro con venti facce triangolari, avente simmetria cubica e forma approssimativamente sferica. I virus icosaedrici includono il virus dell'herpes simplex, i reovirus, ecc.

2). Tipo di simmetria a spirale. I capsidi elicoidali hanno una struttura leggermente più semplice. Quelli. I capsomeri che compongono il capside ricoprono l'NA elicoidale e formano anche un guscio proteico abbastanza stabile di questi virus. E quando si utilizzano microscopi elettronici ad alta risoluzione e metodi di preparazione adeguati, si possono vedere strutture elicoidali sui virus. Con la simmetria elicoidale del capside, l'acido nucleico virale forma una figura a spirale (o elicoidale), cava all'interno, e attorno ad essa si dispongono anche le subunità proteiche (capsomeri) a spirale (capside tubolare). Un esempio di virus con simmetria elicoidale del capside è il virus del mosaico del tabacco, che è a forma di bastoncino e lungo 300 nm con un diametro di 15 nm. La particella virale contiene una molecola di RNA di circa 6.000 nucleotidi. Il capside è costituito da 2000 subunità proteiche identiche disposte a spirale.

3). Tipo di simmetria mista o complessa. Di norma, questo tipo di simmetria viene rilevato principalmente tra i virus batterici. E gli esempi classici sono quelli dei fagi, dell'Escherichia coli o dei fagi temperati. Si tratta di formazioni complesse che hanno una testa con contenuto nucleico interno, vari tipi di appendici, un processo di coda e dispositivi di vari gradi di complessità. E ogni componente di tali particelle è dotato di una funzione specifica che si realizza durante l'interazione del virus con la cellula. In altre parole, un tipo complesso di simmetria è una combinazione di simmetria cubica, la testa è un poliedro icosiderico e le formazioni a forma di bastoncino sono i processi della coda. Sebbene tra i virus batterici ci siano anche virioni organizzati in modo abbastanza semplice che sono nucleocapsidi primitivi, di forma sferica o cubica. I virus batterici sono i più complessi rispetto ai virus vegetali e ai virus animali.

24) Interazione del fago con la cellula. Fagi virulenti e temperati.

Adsorbimento.

L'interazione inizia con l'attaccamento delle particelle virali alla superficie cellulare. Il processo diventa possibile in presenza di opportuni recettori sulla superficie della cellula e di antirecettori sulla superficie della particella virale.

I virus utilizzano recettori cellulari progettati per trasportare le sostanze necessarie: particelle nutrizionali, ormoni, fattori di crescita, ecc.

Recettori: proteine, componente glucidica delle proteine ​​e dei lipidi, lipidi. Recettori specifici determinano l'ulteriore destino della particella virale (trasporto, consegna ad aree del citoplasma o del nucleo). Il virus può anche attaccarsi a recettori non specifici e persino penetrare nella cellula. Tuttavia, questo processo non causa lo sviluppo di infezioni.

Innanzitutto si forma un singolo legame tra antirecettore e recettore. Tale connessione è fragile e può essere interrotta. Per la formazione di adsorbimento irreversibile è necessario l'attaccamento multivalente. Il legame stabile avviene grazie alla libera circolazione delle molecole recettoriali nella membrana. Quando un virus interagisce con una cellula, si osserva un aumento della fluidità dei lipidi e la formazione di campi recettoriali nell'area di interazione tra il virus e la cellula. I recettori di alcuni virus possono essere presenti solo in un insieme limitato di cellule ospiti. Ciò determina la sensibilità del corpo a questo virus. Pertanto, il DNA e l’RNA virali hanno la capacità di infettare una gamma più ampia di cellule ospiti.

Gli antirecettori possono essere trovati in organelli virali unici: strutture di appendice nei batteriofagi T, fibre negli adenovirus, punte sulla superficie delle membrane virali, corona nei coronavirus.

Penetrazione.

2 meccanismi: endocitosi del recettore e fusione della membrana.

Endocitosi del recettore:

Il meccanismo abituale per l'ingresso di nutrienti e sostanze regolatrici nella cellula. Si verifica in aree specializzate - dove sono presenti fosse speciali ricoperte di clatrina, sul fondo della fossa ci sono recettori specifici; Le fosse forniscono una rapida invaginazione e la formazione di vacuoli rivestiti di clatrina (non passano più di 10 minuti dal momento dell'adsorbimento; in un minuto possono formarsi fino a 2000 vacuoli). I vacuoli si fondono con vacuoli citoplasmatici più grandi, formando recettoriosomi (non contenenti più clatrina), che a loro volta si fondono con i lisosomi.

Fusione delle membrane virali e cellulari:

Nei virus con involucro, la fusione è causata da interazioni puntuali della proteina virale con i lipidi della membrana cellulare, a seguito delle quali l'involucro della lipoproteina virale si integra con la membrana cellulare. Nei virus senza involucro, una delle proteine ​​di superficie interagisce anche con i lipidi delle membrane cellulari e la componente interna attraversa la membrana (nei paramyxovirus è la proteina F, negli orthomyxovirus è la subunità emoagglutinante HA2). La conformazione delle proteine ​​di superficie è influenzata dal pH.

Striscia.

Durante questo processo, l'attività infettiva scompare, spesso appare la sensibilità alle nucleasi e si verifica la resistenza agli anticorpi. Il prodotto finale della svestizione sono gli acidi nucleici legati alla proteina virale interna. La fase di svestizione limita anche la possibilità di infezione (i virus non sono in grado di spogliarsi in ogni cellula). La spogliazione avviene in aree specializzate della cellula: lisosomi, apparato di Golgi, spazio perinucleare.

La spogliazione avviene come risultato di una serie di reazioni. Ad esempio, nei picornavirus, la svestizione avviene con la formazione di particelle subvirali intermedie con dimensioni da 156 a 12S. Negli adenovirus nel citoplasma e nei pori nucleari ha almeno 3 stadi:

Formazione di particelle subvirali con densità maggiore rispetto ai virioni;

Formazione di nuclei privi di 3 proteine ​​virali;

Formazione di un complesso DNA-proteina in cui il DNA è legato covalettivamente ad una proteina terminale.

Caratteristiche dei fagi virulenti e temperati.

Quando un batterio viene infettato da un fago si verifica una cosiddetta infezione litica, cioè un'infezione che termina con la lisi della cellula ospite, ma questa è caratteristica solo dei cosiddetti fagi virulenti, la cui interazione con il fago cellula porta alla morte cellulare e alla formazione di progenie fagica.

In questo caso, a seconda delle interazioni del fago con la cellula, si distinguono le seguenti fasi: miscelazione del fago con la coltura cellulare (la molteplicità dell'infezione è di 1 fago ogni 10 cellule) e la concentrazione deve essere sufficientemente elevata da consentire ai fagi per contattare le cellule. Per evitare la reinfezione - dopo l'infezione per un massimo di 5 minuti, quando i fagi vengono assorbiti - questa miscela di cellule con il fago viene diluita. C'è un periodo di latenza durante il quale il numero di fagi non aumenta, poi un periodo di rilascio molto breve, quando il numero di particelle fagiche aumenta bruscamente, quando la cellula viene lisata e la progenie fagica viene rilasciata, e poi il numero di fagi rimane allo stesso livello, perché non si verifica una reinfezione. Sulla base di questa curva, possiamo distinguere queste fasi: il periodo vegetativo di “crescita” (periodo di latenza), il periodo di rilascio e calcolare la resa fagica per 1 cellula infetta. Durante il periodo di latenza non è possibile rilevare nei batteri nulla di simile alle particelle fagiche e non è possibile isolare il principio infettivo da tali cellule durante il periodo di latenza. Solo le particelle fagiche mature sono in grado di causare l'infezione dei batteri. Pertanto, i fagi virulenti causano sempre la morte dei batteri e producono un'infezione, che si manifesta nella produzione di nuove particelle virali capaci di infettare le cellule successive e altre ad essi sensibili.

A differenza di quelle virulente, l'infezione da fagi temperati non porta alla lisi delle cellule batteriche, ma si realizza la formazione di uno speciale stato di convivenza del fago con la cellula batterica. Questa coesistenza si esprime nel fatto che un certo inizio del fago è presente nella cellula batterica senza condizioni sfavorevoli per esso e viene preservato di generazione in generazione. In alcune fasi di tale coesistenza, il fago viene attivato nella cellula ed entra in uno stato di ciclo di sviluppo litico, provocando la lisi cellulare e il rilascio della progenie dei fagi. Tali fagi sono chiamati fagi lisogeni o temperati, e lo stato di esistenza moderata con il fago è lisogenia, e i batteri che contengono un fago così nascosto sono batteri lisogeni. Il termine batteri lisogeni deriva dal fatto che una volta furono scoperte colture in cui appariva spontaneamente un fago, e questo batteriofago cominciò a essere considerato come una contaminazione della coltura, cioè un virus batterico entra nella coltura, e tali colture furono chiamate lisogeniche, cioè generano lisi.

Lavoro del corso

"Metodi di virologia clinica"

introduzione

La diagnosi di laboratorio delle infezioni virali viene effettuata principalmente utilizzando la microscopia elettronica, colture cellulari sensibili e metodi immunologici. Di norma, viene scelto un metodo per fare una diagnosi a seconda dello stadio dell'infezione virale. Ad esempio, tutti e tre gli approcci possono essere utili nella diagnosi della varicella, ma il successo dell’uso della microscopia e delle tecniche di coltura cellulare dipende dalla capacità di raccogliere campioni soddisfacenti in una fase relativamente precoce della malattia.

Il successo della diagnostica virale dipende in larga misura dalla qualità dei campioni ottenuti. Per questo motivo, lo stesso personale di laboratorio deve essere direttamente coinvolto nella raccolta dei campioni necessari. Le caratteristiche dei campioni, nonché i metodi per la loro consegna al laboratorio, sono descritti da Lennett, Schmidt, Christ et al.

La maggior parte dei reagenti e degli strumenti utilizzati nella diagnostica di laboratorio possono essere acquistati da varie aziende. Nella maggior parte dei casi, lo stesso reagente viene prodotto contemporaneamente da più aziende. Per questo motivo non abbiamo indicato le singole aziende, a meno che il reagente non venga fornito da una sola azienda. In tutti gli altri casi si dovrà fare riferimento all'elenco generale dei fornitori riportato in tabella. 1.

Non abbiamo mirato a fornire una descrizione completa di tutti i metodi attualmente disponibili per la diagnosi delle infezioni virali umane. Innanzitutto abbiamo caratterizzato i metodi principali. Man mano che acquisisci esperienza lavorando in modo indipendente, queste tecniche di base possono essere utilizzate per risolvere problemi più complessi.

1. Microscopia elettronica

Per la diagnosi al microscopio elettronico delle infezioni virali, è possibile utilizzare sezioni sottili del tessuto interessato. Il materiale più comune utilizzato per la microscopia elettronica sono le feci o il liquido.

Tabella 1. Elenco delle aziende fornitrici di reagenti e apparecchiature

vescicole che caratterizzano alcune malattie, come la varicella. Quando si analizza tale materiale, i virus possono essere rilevati utilizzando la colorazione negativa, che si traduce in materiale denso di elettroni che delinea i componenti del virione. Il metodo è efficace quando la concentrazione del virus è elevata nei campioni da testare, come nelle feci o nel fluido vescicolare. Nei casi in cui il contenuto di particelle virali nei campioni è basso, la probabilità di rilevare il virus può essere aumentata concentrando il virus mediante ultracentrifugazione o aggregandolo con anticorpi specifici. Quest'ultimo metodo è utile anche per identificare i virus. Qui descriveremo il metodo al microscopio elettronico per diagnosticare l'infezione da rotavirus e il metodo alla microscopia immunoelettronica utilizzando l'esempio della rilevazione di anticorpi specifici contro i parvovirus. I metodi di microscopia elettronica sono descritti più dettagliatamente da Field.

2.1 Esame al microscopio elettronico diretto delle feci

1. Immergere la punta di una pipetta Pasteur nelle feci e aspirare materiale sufficiente per ottenere uno striscio di 1 cm.

2. Risospendere lo striscio fecale in colorante di contrasto negativo al microscopio elettronico fino ad ottenere una sospensione traslucida. Il colorante di contrasto negativo è una soluzione al 2% di acido fosfotungstico in acqua distillata.

3. Per ottenere un campione al microscopio elettronico, una goccia della sospensione viene posizionata su una griglia per microscopio elettronico rivestita con una pellicola di carbonio-formvar. Durante questa operazione, la rete viene trattenuta con un paio di pinzette sottili.

4. Il farmaco viene lasciato in aria per 30 s.

5. Il liquido in eccesso viene rimosso toccando il bordo del vetro con carta da filtro.

6. Il farmaco viene essiccato all'aria.

7. Se necessario, il virus vitale viene inattivato irradiando entrambi i lati della griglia con luce ultravioletta con un'intensità di 440.000 μW-s/cm2. In questo caso viene utilizzata una lampada ultravioletta a onde corte con filtro. La lampada deve trovarsi ad una distanza di 15 cm dalla griglia; Il tempo di irradiazione per ciascun lato è di 5 minuti.

8. I virioni del rotavirus possono essere caratterizzati al microscopio elettronico a trasmissione con un ingrandimento compreso tra 30.000 e 50.000.

2.2 Microscopia immunoelettronica

Il metodo della microscopia immunoelettronica descritto di seguito è solo uno dei tanti metodi immunologici simili. Per studiare gli anticorpi specifici del virus, inoltre, viene utilizzato un metodo che prevede il legame alla rete microscopica della proteina A. La concentrazione di lavoro degli anticorpi antivirali è determinata mediante tentativi ed errori nell'intervallo da 1/10 a 1/1000. La concentrazione che indichiamo viene solitamente utilizzata nel lavoro di routine. Per ottenere risultati ottimali per l'interazione degli anticorpi con il virus, il siero contenente il parvovirus viene titolato allo stesso modo.

1. 10 µl di antisiero contro il parvovirus umano vengono diluiti 100 volte con PBS. La soluzione viene riscaldata a bagnomaria a 56°C.

2. Sciogliere 10 ml di agarosio al 2% in PBS nel modo consueto e raffreddare a 56 °C a bagnomaria.

3. A 56 °C, mescolare 1 ml di antisiero diluito con 1 ml di agarosio al 2%.

4. Trasferire 200 µl della miscela risultante in due pozzetti di una piastra per microtitolazione da 96 pozzetti.

5. L'agarosio viene lasciato solidificare a temperatura ambiente. La compressa può essere conservata a 4°C per diverse settimane se sigillata con nastro adesivo.

6. Aggiungere 10 µl di siero contenente parvovirus in un pozzetto contenente una miscela di agarosio e antisiero.

7. Una griglia per microscopio elettronico con un rivestimento pre-preparato di carbonio-formvar viene posizionata sul lato meno lucido su una goccia di siero.

8. La rete viene mantenuta per 2 ore a 37 °C in una camera umida.

9. Utilizzando una pinzetta sottile, estrarre la rete e applicare una goccia di acido fosfotungstico al 2% sulla superficie della rete che era a contatto con il siero.

10. Dopo 30 secondi, la vernice in eccesso viene lavata via, il preparato viene asciugato e il virus viene inattivato.

Le particelle virali aggregate vengono esaminate al microscopio elettronico a trasmissione con un ingrandimento compreso tra 30.000 e 50.000.

3. Identificazione degli antigeni virali

I virus presenti nei tessuti o nei fluidi tissutali possono essere identificati da proteine ​​virus-specifiche utilizzando la reazione antigene-anticorpo. Il prodotto della reazione antigene-anticorpo viene testato rispetto a un tag introdotto direttamente negli anticorpi antivirali o negli anticorpi diretti contro gli anticorpi specifici del virus. Gli anticorpi possono essere marcati con fluoresceina, iodio radioattivo o un enzima che scinde il substrato provocando un cambiamento di colore. Inoltre, la reazione di emoagglutinazione viene utilizzata per identificare il virus. Nella pratica quotidiana, i metodi descritti vengono utilizzati principalmente per rilevare gli antigeni del virus dell'epatite B nel sangue e per cercare antigeni di vari virus che causano varie malattie respiratorie.

Attualmente molte aziende producono diagnostici eritrocitari, radioattivi ed enzimatici, compresi quelli per la rilevazione del virus dell'epatite B. Non riteniamo opportuno delineare metodi per lavorare con questi diagnostici: è sufficiente seguire le istruzioni allegate. Di seguito ci concentreremo sul metodo di immunofluorescenza per identificare il virus respiratorio sinciziale nelle secrezioni nasofaringee.

3.1 Identificazione del virus respiratorio sinciziale nelle secrezioni nasofaringee mediante immunofluorescenza

Il metodo per ottenere preparati di secrezioni rinofaringee è descritto da Gardner e McQuillin. In condizioni di laboratorio, questa operazione viene eseguita in due fasi. Innanzitutto, viene preparato uno striscio di muco nasofaringeo su un vetrino. Gli strisci risultanti possono essere conservati fissati a -20 °C per molti mesi. Nella seconda fase, gli strisci vengono colorati per rilevare l'antigene del virus respiratorio sinciziale. A questo scopo viene utilizzato il metodo dell'immunofluorescenza indiretta.

3.1.1 Preparazione di preparati di secrezioni nasofaringee

1. Il muco proveniente da una pinza speciale viene lavato via con 1-2 ml di PBS e trasferito in una provetta da centrifuga.

2. Centrifugare per 10 minuti a 1500 giri/min in una centrifuga da tavolo.

3. Il surnatante viene drenato.

4. Il pellet cellulare viene risospeso con attenzione in 2-3 ml di PBS fino ad ottenere una sospensione omogenea. Per fare questo, utilizzare una pipetta Pasteur a collo largo.

5. La sospensione risultante viene trasferita in una provetta.

6. Aggiungere altri 2-4 ml di PBS alla sospensione e miscelare pipettando. Vengono rimossi grossi grumi di muco.

7. Centrifugare per 10 minuti a 1500 giri/min in una centrifuga da tavolo.

8. Il surnatante viene scartato, il sedimento viene risospeso in un volume di PBS tale che la sospensione risultante si separi facilmente dalle pareti della provetta.

9. La sospensione risultante viene applicata su un vetrino contrassegnato.

10. Il vetro viene asciugato all'aria.

Fissare in acetone per 10 minuti a 4°C.

12. Dopo il fissaggio il vetro viene nuovamente asciugato all'aria.

13. Le preparazioni risultanti vengono colorate immediatamente o conservate a -20 °C.

3.1.2. Tecnica di colorazione

1. Stampare e diluire l'antisiero RSV commerciale in PBS alla concentrazione di lavoro consigliata.

2. Utilizzando una pipetta Pasteur, applicare una goccia di antisiero al preparato preparato.

3. Il farmaco viene posto in una camera umida.

4. Il farmaco viene incubato per 30 minuti a 37 °C.

5. I campioni vengono lavati accuratamente con PBS per rimuovere gli anticorpi in eccesso in un serbatoio speciale.

6. I campioni vengono lavati in tre turni di PBS, 10 minuti ciascuno.

7. Asciugare i campioni, rimuovere il PBS in eccesso con carta da filtro e asciugare all'aria.

La diagnosi eziologica delle malattie virali viene effettuata utilizzando metodi virologici, virusoscopici, sierologici e genetici molecolari. Gli ultimi tre metodi possono essere utilizzati come metodi diagnostici rapidi.

Metodo diagnostico virologico.

L'obiettivo finale del metodo è identificare i virus in base alla specie o alla variante sierologica. Il metodo virologico comprende diverse fasi:

1) selezione del materiale per la ricerca;

2) lavorazione di materiale contenente virus;

3) contaminazione di sistemi viventi sensibili con materiale;

4) indicazione di virus nei sistemi viventi;

5) titolazione dei virus isolati;

6) identificazione dei virus nelle reazioni immunitarie.

1. Selezione del materiale per la ricerca .

Viene effettuato nelle prime fasi della malattia, nel rispetto delle regole che impediscono la contaminazione del materiale con microflora estranea e l'infezione del personale medico. Per prevenire l'inattivazione dei virus durante il trasporto, il materiale viene posto in un mezzo di trasporto virale (VTS) costituito da una soluzione salina bilanciata, antibiotici e albumina sierica. Il materiale viene trasportato in un apposito contenitore con isolamento termico e sacchetti di plastica chiusi contenenti ghiaccio. Se necessario, il materiale viene conservato a -20˚C. Ogni campione di materiale per la ricerca deve essere contrassegnato ed etichettato indicando il nome del paziente, la tipologia del materiale, la data di prelievo, la diagnosi clinica dettagliata ed altre informazioni.

A seconda della natura della malattia, il materiale per la ricerca può essere:

1) tamponi dalla parte nasale della faringe e un tampone dalla faringe;

2) liquido cerebrospinale;

3) feci e tamponi rettali;

6) liquido da cavità sierose;

7) striscio dalla congiuntiva;

8) contenuto delle vescicole;

8) materiale in sezione.

Per ottenere un lavaggio dell'orofaringe si utilizzano 15-20 ml di VTS. Il paziente effettua accuratamente dei gargarismi con il VTS per 1 minuto e raccoglie il risciacquo in una bottiglia sterile.

Si preleva uno striscio dalla parte posteriore della gola con un batuffolo di cotone sterile, premendo sulla radice della lingua con una spatola. Il tampone viene posto in 2-3 ml di VTS, risciacquato e strizzato.

Il liquido cerebrospinale si ottiene attraverso una rachicentesi. 1-2 ml di liquido cerebrospinale vengono posti in un contenitore sterile e consegnati al laboratorio.

I campioni di feci vengono raccolti entro 2-3 giorni in fiale sterili. Dal materiale risultante viene preparata una sospensione al 10% utilizzando la soluzione di Hanks. Si centrifuga la sospensione a 3000 giri al minuto, si raccoglie il surnatante, si addizionano gli antibiotici e si pone in un contenitore sterile.

Il sangue ottenuto mediante puntura venosa in un volume di 5-10 ml viene defibrinato aggiungendo eparina. Il sangue intero non viene congelato e non vengono aggiunti antibiotici. Per ottenere il siero, i campioni di sangue vengono conservati in un termostato a 37°C per 60 minuti.

Il liquido dalle cavità sierose si ottiene mediante puntura in una quantità di 1-2 ml. Il liquido viene utilizzato immediatamente o conservato congelato.

Uno striscio dalla congiuntiva viene prelevato con un tampone sterile e posto in un VTS, dopodiché il materiale raccolto viene centrifugato e congelato.

Il contenuto delle vescicole viene aspirato con una siringa dotata di ago sottile e posto nel VTS. Il materiale viene inviato al laboratorio sotto forma di strisci essiccati su vetrini o in capillari o fiale sterili sigillate.

Il materiale sezionale viene selezionato il prima possibile, osservando le regole asettiche. Per raccogliere ciascun campione vengono utilizzati set separati di strumenti sterili. La quantità di tessuto prelevato è di 1-3 g, che viene posta in fiale sterili. Innanzitutto vengono prelevati campioni da organi extracavitari (cervello, linfonodi, ecc.). Il tessuto dalla cavità toracica viene raccolto prima dell'apertura della cavità addominale. I campioni di tessuto risultanti vengono macinati in un mortaio con l'aggiunta di sabbia sterile e soluzione sterile di cloruro di sodio, dopodiché il materiale viene centrifugato. Il surnatante viene raccolto in fiale e vengono aggiunti gli antibiotici. Il materiale per la ricerca virologica viene utilizzato immediatamente o conservato a -20˚C.

2. Lavorazione di materiale contenente virus.

Viene effettuato con lo scopo di liberare il materiale dalla microflora batterica accompagnatoria. A questo scopo vengono utilizzati metodi fisici e chimici.

Metodi fisici:

1) filtrazione attraverso vari filtri batterici;

2) centrifugazione.

Metodi chimici:

1) trattamento del materiale con etere nei casi di isolamento di virus che non presentano supercapside;

2) aggiunta al materiale di una miscela di eptano e freon;

3) somministrazione di antibiotici (penicillina - 200-300 U/ml; streptomicina - 200-500 mcg/ml; nistatina - 100-1000 U/ml).

3. Contaminazione dei sistemi viventi sensibili da parte del materiale.

1) animali da laboratorio;

2) embrioni di pollo;

3) coltura d'organo;

4) coltura dei tessuti.

Animali da laboratorio. Vengono utilizzati topi bianchi, porcellini d'India, criceti, conigli, ecc. I topi bianchi sono i più sensibili a un gran numero di tipi di virus. Il metodo di infezione degli animali è determinato dal tropismo del virus nei tessuti. L'infezione nel cervello viene utilizzata quando si isolano virus neurotropi (virus della rabbia, poliovirus, ecc.). L'infezione intranasale viene effettuata quando vengono isolati gli agenti patogeni delle infezioni respiratorie. I metodi di infezione intramuscolare, endovenosa, intraperitoneale, sottocutanea e altri sono ampiamente utilizzati. Gli animali malati vengono soppressi con etere, aperti e il materiale viene raccolto da organi e tessuti.

Embrioni di pollo. Ampiamente disponibile e facile da usare. Vengono utilizzati embrioni di pollo di età compresa tra 5 e 14 giorni. Prima dell'infezione, gli embrioni di pollo sono ovoscopici: viene determinata la loro vitalità, il bordo della sacca d'aria e la posizione dell'embrione vengono segnati sul guscio (l'“occhio scuro” dell'embrione). Il lavoro con gli embrioni di pollo viene effettuato in una scatola sterile con strumenti sterili (pinzette, siringhe, forbici, lancia, ecc.). Dopo aver completato un frammento di lavoro, gli strumenti vengono immersi in alcool etilico al 70% e bruciati prima della successiva manipolazione. Prima dell'infezione, il guscio dell'embrione di pollo viene pulito con un tampone imbevuto di alcol e una soluzione alcolica di iodio. Il volume del materiale di prova iniettato nell'embrione è 0,1-0,2 ml. Per isolare i virus da un materiale vengono utilizzati almeno 4 embrioni di pollo.

La diagnosi di ACI viene stabilita sulla base di dati clinici ed epidemiologici, con conferma di laboratorio obbligatoria. Senza conferma di laboratorio, la diagnosi di ACI può essere fatta solo nei casi in cui esistono dati epidemiologici chiaramente stabiliti (nei focolai di infezione e nei focolai di malattie di gruppo decifrati in laboratorio nella maggior parte dei pazienti).

Per la diagnosi finale vengono utilizzati metodi di ricerca batteriologici, virologici e sierologici. Il metodo scatologico, così come i risultati della sigmoidoscopia (per la shigellosi), sono di valore ausiliario.

IO. Metodo batteriologicoè di massima importanza nelle infezioni intestinali acute causate dalla flora batterica (diarrea invasiva e secretiva). I migliori risultati si ottengono seminando le feci direttamente al letto del paziente, prima di prescrivere la terapia antibatterica e consegnandole al laboratorio batteriologico entro le prime due ore dal momento della raccolta. Per la ricerca è necessario selezionare particelle contenenti impurità patologiche, ma non sangue. Il biomateriale viene inoculato su terreni selettivi di Ploskirev, Levin, ecc. Un risultato negativo dell'esame batteriologico delle feci viene fornito al 3-5° giorno e un risultato positivo, di regola, al 5-7° giorno dal momento dell'inoculazione il materiale viene consegnato al laboratorio batteriologico. Frequenza dei risultati positivi (coltura del patogeno e sua identificazione), anche in presenza di manifestazioni cliniche tipiche delle infezioni intestinali acute. Non supera il 70-80%.

II. Metodi sierologici la diagnostica, di regola, viene utilizzata in casi dubbi e con risultati negativi dell'esame batteriologico delle feci. Nei bambini del primo mese. Nella vita, non è molto informativo, ma in tutti i casi è importante un aumento del titolo anticorpale di 4 volte o più. Vengono eseguiti in due direzioni: determinare il titolo di anticorpi specifici nel siero del sangue del paziente e l'antigene nelle feci.

Per determinare il titolo di anticorpi specifici, viene solitamente utilizzato RNGA, meno spesso RPGA o RA. Come antigeni viene presa una sospensione di una coltura quotidiana di batteri (RA) o un diagnostico eritrocitario. ( RPGA, RNGA). Un aumento dei titoli anticorpali nel corso della malattia dovrebbe essere considerato più affidabile. Gli anticorpi specifici nel sangue di un paziente con infezione intestinale acuta compaiono al 3-5o giorno di malattia e aumentano fino al massimo entro 2-3 settimane, per poi diminuire gradualmente. Nei bambini piccoli, soprattutto con un contesto premorboso modificato, gli anticorpi specifici nel sangue non vengono rilevati o hanno titoli bassi (1:50 – 1:100).

In presenza di sintomi clinici tipici e rilevamento di un titolo diagnostico di anticorpi specifici (1:200 e superiore con l'apposito diagnosticum), o di un aumento del loro titolo nella dinamica della malattia, la diagnosi clinica di infezione intestinale deve essere considerato stabilito anche in assenza di semina dell'agente patogeno dalle feci del paziente.

III. Metodi diagnostici espressi le infezioni intestinali si basano sul rilevamento dell'antigene patogeno (batteri o virus) dalle feci, per le quali viene utilizzato il metodo diretto degli anticorpi luminescenti (DMLA) o il metodo di immunoadsorbimento - reazione di agglomerazione del carbonio (CAR). Il risultato preliminare può essere ottenuto in 2-3 ore, il risultato finale in un giorno. La specificità del metodo è dell'82-94,6%.

Negli ultimi anni, per la diagnosi rapida della diarrea sono stati utilizzati il ​​test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) e il test di agglutinazione al lattice (LAR).

La decifrazione eziologica della diarrea virale viene effettuata utilizzando metodi virologici e batteriologici.

Il periodo ottimale per rilevare i virus nelle feci è considerato dal 1° al 4° giorno di malattia, sebbene l'agente patogeno spesso persista più a lungo.

Il metodo principale utilizzato è la microscopia elettronica, che consente di identificare un'ampia gamma di agenti virali che causano la gastroenterite in base alle caratteristiche morfologiche.

Viene utilizzata anche la microscopia immunoelettronica (basata sulla capacità delle particelle virali in presenza di sieri omologhi o sieri convalescenti di formare aggregati di particelle di rotavirus con immunoglobuline.

Tra i metodi tradizionali di sierodiagnosi vi sono la reazione di neutralizzazione, l'inibizione dell'emoagglutinazione e la fissazione del complemento. Un aumento da due a quattro volte degli anticorpi in sieri accoppiati ha un significato retrospettivo per la diagnosi di infezione da rotavirus. Per rilevare i rotavirus o i loro antigeni, vengono utilizzati ELISA, precipitazione diffusa, agglutinazione al lattice e reazione di coagglutinazione.

L'ELISA ha preso il posto più diffuso nel lavoro pratico. – isolamento degli antigeni del rotavirus in coprofiltri. È preferibile utilizzare queste metodiche nel tempo (il primo giorno di ricovero e dopo la guarigione clinica).

Al fine di escludere l'eziologia batterica delle infezioni intestinali acute, l'esame batteriologico delle feci viene effettuato mediante inoculazione su terreni nutritivi

Sigmoidoscopia Il metodo viene utilizzato raramente nei bambini, principalmente per determinare la causa dell'escrezione batterica prolungata e diagnosticare forme protratte e croniche della malattia. Questo metodo di esame consente di valutare solo la natura dei cambiamenti morfologici delle mucose dell'intestino distale, ma non può essere utilizzato per fare una diagnosi eziologica di infezione intestinale.

Le indicazioni per l'esame strumentale (ecografia, esame radiografico degli organi addominali, FGS) per le infezioni intestinali acute sono la necessità di una diagnosi differenziale con malattie chirurgiche degli organi addominali (intussuscezione, appendicite), malattie somatiche (gastrite, ulcera peptica, colecistopancreatite, ecc.) e disturbi funzionali del tratto gastrointestinale.

Determinazione della forma clinica della tossicosi (neurotossicosi, tossicosi con esicosi, ITS), il suo grado (stadio), tipo di disidratazione nella diarrea infettiva nei bambini e fornitura di cure di emergenza

Ricerca per la diagnosi di malattie di natura virale. Ciò è necessario per identificare il virus, studiarne la biologia e la capacità di colpire le cellule animali e umane. Pertanto, diventa possibile comprendere la patogenesi delle malattie virali e, di conseguenza, scegliere il giusto metodo di trattamento.

Qual è la diagnosi?

Nelle cellule viventi. Per studiarlo è necessario coltivarlo a livello di un organismo sperimentale o Per questo, nella pratica medica e nella microbiologia in generale, vengono eseguiti metodi di ricerca virologica, che hanno i seguenti approcci principali:

• Dritto;
• indiretto;
• sierologico.

Il materiale può essere esaminato direttamente per la presenza di acidi nucleici, antigene virale oppure, ad esempio, il virus può essere isolato e identificato da materiale clinico.

Oltre alla capacità di stabilire l’eziologia della malattia e monitorare l’effetto terapeutico, i metodi di ricerca virologica svolgono un ruolo importante nelle misure antiepidemiche. Per l'isolamento vengono utilizzati embrioni di pollo, animali da laboratorio o colture cellulari.

Come viene ricercato?

Il più veloce è il metodo diretto. Permette di rilevare un virus, un antigene o un NA (acido nucleico) nel materiale clinico stesso. Ci vogliono da due ore a un giorno.

1. EM - microscopia elettronica. Rileva direttamente il virus.
2. IEM: microscopia elettronica immunitaria. Utilizza anticorpi specifici contro i virus.
3. RIF - reazione di immunofluorescenza. Utilizza anticorpi legati a un colorante. Tali metodi di ricerca virologica sono ampiamente utilizzati per decifrare rapidamente l'eziologia dell'ARVI (infezioni virali respiratorie acute), quando vengono prelevati strisci di impronte digitali dalla mucosa del tratto respiratorio superiore.
4. ELISA - test immunoassorbente legato a un enzima - determinazione degli antigeni virali, simile al RIF, ma basato sulla marcatura degli anticorpi con enzimi.
5. RIA - dosaggio radioimmunologico. Utilizza la radiomarcatura degli anticorpi per fornire un'elevata sensibilità nel rilevamento dell'antigene virale.
6. Molecolare: ibridazione NK o isolamento dei genomi virali mediante PCR (reazione a catena della polimerasi).
7. La citologia viene utilizzata raramente, ma per alcune infezioni questi metodi di ricerca virologica sono molto efficaci. Vengono esaminati materiali bioptici, autopsie e strisci elaborati per la colorazione e l'analisi al microscopio.

Qual è lo scopo della ricerca?

Per isolare con successo i virus, il materiale clinico viene prelevato in conformità con la patogenesi e il più presto possibile. Spesso questo processo richiede diversi passaggi prima di applicare determinate metodiche di ricerca virologica.

La microbiologia è lo studio delle creature microscopiche. E il suo campo non è solo la medicina. È una scienza fondamentale per l'agricoltura, la medicina veterinaria, l'industria spaziale e tecnica e la geologia.

Ma ovviamente tutto è stato creato per l'uomo e il suo sviluppo su questo bellissimo pianeta. Pertanto, è molto importante individuare il pericolo in tempo e neutralizzarlo. I virus sono diversi dai batteri. Queste sono strutture che entrano nel corpo e provocano la formazione di una nuova generazione. Sembrano cristalli e mirano a controllare il processo della loro riproduzione, sebbene essi stessi non si nutrono, non crescono e non secernono prodotti metabolici.

Il virus è in grado di causare gravi malattie in qualsiasi organismo vivente in cui entra. Inoltre, può evolversi. Ecco perché i metodi di ricerca virologica in microbiologia devono essere sviluppati e migliorati, poiché la civiltà umana nel suo insieme potrebbe essere in pericolo.

Materiali

Per rilevare e identificare i virus in medicina, di norma, vengono presi quanto segue:

• lavaggio nasofaringeo (infezioni respiratorie);
• vampate di calore e feci (infezioni da enterovirali);
• raschiature, contenuto di vesciche (lesioni cutanee, mucose, come herpes, varicella);
• vampate (infezioni esantematiche come morbillo, rosolia);
• sangue, liquido cerebrospinale (infezioni da arbovirus).

Fasi

Tutte le fasi del metodo di ricerca virologica includono:

• raccolta di materiale;
• selezione, ottenimento di un sistema di test, determinazione della sua fattibilità;
• infezione del sistema di test;
• indicazione del virus;
• determinazione del tipo di virus.

Fondamentalmente, i virus patogeni differiscono in presenza di specificità tissutale e di tipo. Prendiamo ad esempio il poliovirus, che si riproduce solo nei primati (nelle loro cellule). Di conseguenza, una coltura tissutale specifica viene utilizzata per isolare un virus specifico. Se si tratta di un agente patogeno sconosciuto, sarebbe consigliabile infettare contemporaneamente tre o meglio quattro colture cellulari.

Quindi, forse uno di loro sarà sensibile. Per determinare la presenza di un virus nelle colture infette, esaminano lo sviluppo di degenerazione cellulare specifica, inclusioni intracellulari, identificazione di un antigene specifico, emoagglutinazione positiva e reazioni di emoassorbimento.

Tutti i metodi di ricerca virologica (diretti e indiretti, sierologici) dovrebbero essere selezionati come i più appropriati per il caso specifico di sospetta infezione.

I metodi indiretti si basano sull'isolamento e l'identificazione del virus. Sono laboriosi, richiedono molto tempo, ma sono accurati.

Sierodiagnosi

Questa diagnosi si riferisce ad un metodo basato sulla reazione antigene-anticorpo. Molto spesso vengono utilizzati sieri di sangue accoppiati, prelevati a intervalli di diverse settimane. Se il titolo anticorpale aumenta 4 volte o più, la reazione è considerata positiva. Per determinare la specificità del tipo del virus, viene utilizzata una reazione di neutralizzazione del virus. Per determinare la specificità del gruppo, è necessario ottenere una reazione di fissazione del complemento.

Sono ampiamente utilizzate varie varianti di dosaggio immunoenzimatico, reazione di inibizione dell'emoagglutinazione, emoagglutinazione passiva, emoagglutinazione passiva inversa e RIF. Anche nell’ingegneria genetica è stato sviluppato un metodo per produrre anticorpi monoclonali. La ristretta specificità dei monocloni può essere superata utilizzando diversi anticorpi monoclonali contro diversi determinanti virali. Pertanto, la specificità e la sensibilità del test di rilevamento dell'antigene sono state aumentate.

Alcune funzionalità

Oggi sono stati creati numerosi sistemi di test diversi per la diagnosi immunologica delle infezioni derivanti dall'ingresso di un virus in un organismo vivente.

Pertanto, i metodi di ricerca virologica sono metodi per isolare i virus, studiarne le proprietà e stabilire la loro connessione eziologica con determinate malattie.