Reazione di emoagglutinazione brevemente. Reazione di agglutinazione dettagliata (RA)

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Reazioni di agglutinazione si basano sull'interazione di un reagente (anticorpi) con antigeni situati sulla superficie di cellule o particelle estranee. Di conseguenza si formano grandi aggregati che precipitano e sono visibili anche ad occhio nudo. In questo modo, il gruppo sanguigno viene determinato secondo il sistema ABO, la presenza del fattore Rh in esso, ecc. Questo è un metodo diagnostico più sensibile rispetto alle reazioni di precipitazione, poiché il volume del sedimento (agglutinato) supera il volume di precipitato.

Emoagglutinazione diretta

La reazione di emoagglutinazione diretta (DHR) viene utilizzata per rilevare gli antigeni di superficie di microrganismi e globuli rossi, nonché gli anticorpi contro di essi.
Il materiale da testare (sangue) viene aggiunto ai sieri standard contenenti anticorpi. La velocità della reazione di agglutinazione diretta è correlata alla quantità di materiale da testare, alla quantità e alla concentrazione del siero e alla temperatura ambiente.

Emoagglutinazione indiretta

La reazione di emoagglutinazione indiretta viene eseguita per rilevare gli anticorpi nel sangue del paziente utilizzando un diagnostico eritrocitario. Il reagente è costituito da globuli rossi sulla cui superficie è presente un antigene (proteine ​​di microrganismi, tossine, allergeni, ecc.).
Il siero del sangue del paziente viene diluito con una soluzione di cloruro di sodio allo 0,9%, quindi viene aggiunto il diagnostico eritrocitario e il risultato viene monitorato. Questo metodo diagnostico altamente sensibile rileva gli antigeni anche in piccole concentrazioni.

Reazione di emoagglutinazione (HRA).

In laboratorio vengono utilizzate due reazioni di emoagglutinazione con diversi meccanismi d'azione.

La prima RGA è sierologica. In questa reazione, i globuli rossi vengono agglutinati quando interagiscono con anticorpi appropriati (emoagglutinine). La reazione è ampiamente utilizzata per determinare i gruppi sanguigni.

La seconda RGA non è sierologica. In esso, l'adesione dei globuli rossi non è causata da

anticorpi, ma sostanze speciali formate da virus. Ad esempio, il virus dell'influenza agglutina i globuli rossi dei polli e dei porcellini d'India, mentre il virus della poliomielite agglutina i globuli rossi delle pecore. Questa reazione consente di giudicare la presenza di un particolare virus nel materiale in esame.

La reazione viene condotta in provette o su apposite piastre con pozzetti. Il materiale analizzato per la presenza del virus viene diluito con una soluzione isotonica da 1:10 a 1:1280; 0,5 ml di ciascuna diluizione vengono miscelati con un volume uguale di sospensione di globuli rossi all'1-2%. Nel controllo, 0,5 ml di eritrociti vengono miscelati con 0,5 ml di soluzione isotonica. Le provette vengono poste in un termostato per 30 minuti e le piastre vengono lasciate a temperatura ambiente per 45 minuti.

Contabilità dei risultati. Se la reazione è positiva, sul fondo della provetta o del pozzetto appare un sedimento di globuli rossi con bordi smerlati (“ombrello”), che copre l'intero fondo del pozzetto. Se il risultato è negativo, i globuli rossi formano un sedimento denso con bordi lisci (“bottone”). Lo stesso sedimento dovrebbe essere nel controllo. L'intensità della reazione è espressa dai segni “+”.

Reazione di emoagglutinazione

Il titolo del virus è la diluizione massima del materiale in cui avviene l'agglutinazione.

Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione

Si tratta di una reazione sierologica in cui specifici anticorpi antivirali, interagendo con il virus (antigene), lo neutralizzano e lo privano della capacità di agglutinare i globuli rossi, cioè inibiscono la reazione di emoagglutinazione. Questa reazione consente di determinare il tipo e il tipo di virus.

Impostazione di una reazione. 0,25 ml di siero antivirale vengono miscelati con un uguale volume di materiale contenente il virus. La miscela viene agitata e posta in termostato per 30 minuti, dopodiché vengono aggiunti 0,5 ml di sospensione di globuli rossi all'1-2%.

Contabilità dei risultati. Se l'esperimento viene eseguito correttamente, dovrebbe formarsi un "pulsante" nel controllo del siero e degli eritrociti: non esiste alcun fattore che agglutina gli eritrociti; nel controllo dell'antigene si forma un "ombrello": il virus ha causato l'agglutinazione dei globuli rossi. Se il siero è omologo al virus studiato, si forma un “bottone”: il siero ha neutralizzato il virus.

Reazione di emoagglutinazione indiretta

La reazione di emoagglutinazione indiretta (passiva) (RIHA) si basa sul fatto che i globuli rossi, se un antigene solubile viene adsorbito sulla loro superficie, acquisiscono la capacità di agglutinarsi quando interagiscono con gli anticorpi contro l'antigene adsorbito.

Impostazione di una reazione. Il siero viene riscaldato per 30 minuti a 56 °C, diluito sequenzialmente in rapporto 1:10 - 1:1280 e versato in 0,25 ml in provette o pozzetti, dove vengono poi poste 2 gocce di globuli rossi con antigeni adsorbiti su di essi. aggiunto.

Controlli: una sospensione di eritrociti con antigeni adsorbiti su di essi con siero evidentemente immune, una sospensione di eritrociti con antigeni adsorbiti su di essi con siero normale; una sospensione di globuli rossi normali con siero in esame. Nel primo controllo dovrebbe verificarsi l'agglutinazione, nel secondo e nel terzo non dovrebbe verificarsi.

Domande di controllo.

1. Cosa indica un risultato positivo dell'analisi radiografica tra i globuli rossi e il materiale analizzato per la presenza del virus?

2. Si verificherà una reazione di agglutinazione dei globuli rossi se ad essi viene aggiunto un virus e il siero corrispondente? Qual è il nome della reazione che rivela questo fenomeno?

LAVORO PRATICO N. 12.

Reazione di fissazione del complemento.

La reazione di fissazione del complemento (CFR) si basa sul fatto che uno specifico complesso antigene-anticorpo adsorbe (si lega) sempre il complemento a se stesso.

Questa reazione è ampiamente utilizzata nell'identificazione degli antigeni e nella sierodiagnosi delle infezioni, in particolare delle malattie causate da spirochete (reazione di Wassermann), rickettsie e virus.

RKS è una reazione sierologica complessa. Coinvolge il complemento e due sistemi antigene-anticorpo. Si tratta essenzialmente di due reazioni sierologiche.

Il sistema principale corretto è costituito da un antigene e da un anticorpo (uno è noto, l'altro no). Ad esso viene aggiunta una certa quantità di complemento. Se l'antigene e l'anticorpo di questo sistema corrispondono, si collegheranno e legheranno un complemento. Il complesso risultante è finemente disperso e non visibile.

La formazione di questo complesso viene rilevata utilizzando un secondo sistema emolitico o indicatore. Comprende i globuli rossi di pecora (antigene) e il corrispondente siero emolitico (anticorpo), cioè complesso immunitario già pronto. In questo sistema, la lisi dei globuli rossi può avvenire solo in presenza del complemento. Se il complemento è vincolato dal primo sistema, nel secondo sistema non ci sarà emolisi, perché nessun complemento gratuito. L'assenza di emolisi (il contenuto della provetta è torbido o sul fondo è presente un sedimento di eritrociti) viene registrata come risultato RSK positivo.

Se nel primo sistema l'antigene non corrisponde all'anticorpo, allora non si formerà l'immunocomplesso e il complemento rimarrà libero. Rimanendo libero, il complimento partecipa al secondo sistema, provocando l'emolisi, il risultato dell'RSC è negativo (il contenuto delle provette è trasparente - “sangue laccato”).

Componenti, reazioni di fissazione del complemento:

1. Antigene - solitamente lisato, estratto, aptene,

meno spesso una sospensione di microrganismi.

2. Anticorpo: siero del paziente.

3. Complemento: siero di cavia.

4. Antigene: eritrociti di pecora.

5. Anticorpo: emolisina contro eritrociti di pecora.

6. Soluzione isotonica.

A causa del fatto che nella RSC sono coinvolti un gran numero di componenti complessi,

devono prima essere titolati e fatti reagire in quantità esatte e in volumi uguali: 0,5 o 0,25, meno spesso 0,2, 1,25 o 1,0 ml (volumi maggiori danno un risultato più accurato). La titolazione dei componenti della reazione viene effettuata nello stesso volume dell'esperimento, sostituendo gli ingredienti mancanti con una soluzione isotonica.

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Il test di emoagglutinazione indiretta o passiva (IRHA o RPHA) è più sensibile e specifico del test di agglutinazione. Questa reazione viene utilizzata anche in due direzioni.

1) Per rilevare gli anticorpi nel siero del sangue del paziente, viene utilizzata la diagnostica degli eritrociti, in cui l'antigene viene adsorbito sulla superficie degli eritrociti trattati con tannino. In relazione a questa reazione viene più spesso utilizzato il termine RPGA.

Il siero del test viene diluito nei pozzetti delle piastre di plastica e viene aggiunto il diagnostico eritrocitario. Con una reazione positiva, lungo le pareti del foro appare una pellicola sottile sotto forma di un “ombrello di pizzo”; con una reazione negativa, appare un denso sedimento di eritrociti a forma di “bottone”;

2) Per rilevare tossine e antigeni batterici nel materiale in studio, viene utilizzata la diagnostica eritrocitaria anticorpale, ottenuta mediante adsorbimento di anticorpi sugli eritrociti. In relazione a questa reazione viene più spesso utilizzato il termine RNGA. Ad esempio, con l'aiuto della diagnostica degli anticorpi, vengono rilevati l'antigene del bacillo della peste, l'esotossina della difterite e l'esotossina botulinica.

Che cos'è un diagnostico eritrocitario? Che cos'è un anticorpo eritrocitario diagnostico?

Gli eritrociti diagnostici sono globuli rossi (trattati con tannino o formalina) su cui sono adsorbiti antigeni estratti da batteri e vengono utilizzati nelle RPHA (reazioni di emoagglutinazione passiva). Nel caso in cui l'RPGA venga utilizzato per rilevare l'antigene nelle secrezioni dei pazienti, nei tessuti, ecc., vengono utilizzati gli "antibody diagnosticum", ovvero globuli rossi sensibilizzati con anticorpi.

Nell'RNGA, gli anticorpi del siero del sangue vengono rilevati utilizzando un diagnostico eritrocitario antigenico, ovvero eritrociti con antigeni adsorbiti su di essi.

Metodologia per impostare le reazioni. Reazione di coagglutinazione.

- fissazione dei globuli rossi con formaldeide o aldeidi glutariche o acriliche. Tali globuli rossi trattati vengono conservati per lungo tempo. Più spesso, a questo scopo vengono utilizzati eritrociti di pecore, esseri umani, polli, ecc.;
— trattamento degli eritrociti fissati con una soluzione di tannino. Di conseguenza, i globuli rossi acquisiscono la capacità di adsorbire in modo irreversibile le proteine ​​(virus e anticorpi) sulla loro superficie;
- sensibilizzazione degli eritrociti tanizzati da parte di virus o anticorpi.

Reazione di coagglutinazione (CAR)

La reazione di coagglutinazione viene utilizzata per determinare gli antigeni utilizzando anticorpi adsorbiti sulla proteina A delle cellule stafilococciche (anticorpo diagnostico).
La proteina A ha un'affinità per il frammento Fc delle immunoglobuline, pertanto tali batteri trattati con siero diagnostico immunitario assorbono in modo non specifico gli anticorpi sierici, che poi interagiscono con i centri attivi con i corrispondenti microbi isolati dai pazienti. Come risultato della coagglutinazione, si formano scaglie costituite da stafilococchi, anticorpi sierici diagnostici e il microbo rilevato.

Sieri agglutinanti: cosa contengono; come si ottengono, a cosa servono; Qual è il titolo del siero agglutinante?

Il siero agglutinante si ottiene immunizzando conigli (per via endovenosa, sottocutanea o intraperitoneale) con una sospensione di batteri uccisi, iniziando con una dose di 200 milioni, poi 500 milioni, 1 miliardo, 2 miliardi di corpi microbici in 1 ml, ad intervalli di 5 giorni. 7-8 giorni dopo l'ultima immunizzazione viene prelevato il sangue e viene determinato il titolo anticorpale.

Il titolo di un siero agglutinante è la diluizione massima del siero alla quale avviene l'agglutinazione con il corrispondente microrganismo.

I sieri agglutinanti vengono utilizzati per identificare i microbi in una reazione di agglutinazione su vasta scala.

Reazione di emoagglutinazione (HRA)

Se il microrganismo in studio risulta agglutinato dal siero al titolo o alla metà del valore del titolo, può essere considerato appartenente alla specie il cui nome è indicato sull'etichetta della fiala.

Quali sono le differenze tra sieri agglutinanti polivalenti e monovalenti (monorecettori); Perché quando un coniglio viene immunizzato con microbi di un tipo, si ottiene un siero contenente anticorpi contro diversi antigeni?

I sieri monorecettori sono sieri contenenti anticorpi contro un solo antigene e sieri polivalenti che danno reazioni di aglutinazione con due o tre batteri correlati che hanno un antigene comune. I sieri agglutinanti vengono utilizzati per identificare i microrganismi in una reazione di agglutinazione. Lo svantaggio di tali sieri è che sono in grado di dare reazioni di agglutinazione di gruppo, perché contengono anticorpi contro batteri che hanno antigeni comuni.

Reazione di emoagglutinazione. Descrizione e applicazione

Si basa sul fatto che i globuli rossi, sui quali sono precedentemente adsorbiti gli antigeni, acquisiscono la capacità di agglutinarsi in presenza di sieri omologhi (anticorpi).

In questo caso, i globuli rossi agiscono come trasportatori di determinanti specifici, la cui agglutinazione avviene a seguito della reazione antigene + anticorpo.

I globuli rossi alla cui superficie sono saldamente attaccati gli antigeni sono chiamati antigene eritrocitario diagnostico o eritrociti sensibilizzati con l'antigene.

Un altro tipo di RNGA: gli anticorpi vengono adsorbiti sulla superficie degli eritrociti e la loro successiva agglutinazione avviene in presenza di un antigene omologo. In questo caso, tali eritrociti sono chiamati eritrociti anticorpo diagnostico o eritrociti sensibilizzati dagli anticorpi.

Sulla base di questi due approcci metodologici fondamentali, sono state sviluppate e utilizzate molte modifiche dell'RNGA. Pertanto, come trasportatori vengono utilizzate piccole particelle di lattice standard. In questo caso, la reazione è chiamata reazione di agglutinazione al lattice (RLA) o viene utilizzato Staphylococcus aureus - reazione di coagglutinazione, ecc. Di solito, la diagnostica degli eritrociti viene preparata presso le imprese dell'industria biologica e l'esperienza principale di RNGA viene effettuata nei laboratori diagnostici.

La preparazione dei diagnostici eritrocitari comprende i seguenti passaggi:

• fissazione dei globuli rossi con formaldeide o aldeidi glutariche o acriliche. Tali globuli rossi trattati vengono conservati per lungo tempo. Più spesso, a questo scopo vengono utilizzati eritrociti di pecore, esseri umani, polli, ecc.;
• trattamento degli eritrociti fissati con soluzione di tannino. Di conseguenza, i globuli rossi acquisiscono la capacità di adsorbire in modo irreversibile le proteine ​​(virus e anticorpi) sulla loro superficie;
• sensibilizzazione degli eritrociti tanizzati da parte di virus o anticorpi.

Va notato che i metodi per preparare la diagnostica degli eritrociti per le infezioni virali sono diversi.

La procedura per eseguire l'RNGA per rilevare e determinare il titolo anticorpale è la seguente:

• dosi uguali di eritrociti sensibilizzati con l'antigene vengono aggiunte a successive diluizioni doppie di siero;
• la miscela viene lasciata per 2-3 ore a temperatura ambiente oppure per 16-18 ore a 4°C;
• tenere conto dei risultati. Se il siero contiene anticorpi contro il virus con cui sono stati sensibilizzati i globuli rossi, si osserva emoagglutinazione, che viene valutata negli incroci.

Si considera che il titolo anticorpale nel siero sia la diluizione del siero più alta che fornisce ancora emoagglutinazione di almeno due croci.

RNGA è accompagnato da tutti i controlli rilevanti. Di solito la reazione viene effettuata utilizzando il micrometodo.

RNGA consente di risolvere i seguenti problemi diagnostici:

• rilevare gli anticorpi e determinarne il titolo nel siero sanguigno utilizzando un noto diagnostico dell'antigene eritrocitario;
• rilevare e identificare un virus sconosciuto utilizzando una diagnostica anticorpale eritrocitaria nota.

Vantaggi dell'RNGA: elevata sensibilità, semplicità della tecnica di posizionamento e velocità di risposta. Tuttavia, è importante notare che sorgono grandi difficoltà nella preparazione della diagnostica eritrocitaria stabile (grande dipendenza dalla purezza dei componenti utilizzati, necessità di selezionare una modalità di fissazione, tanizzazione e sensibilizzazione degli eritrociti per ciascun tipo di virus).

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1. Reazione di emoagglutinazione

(RGA)

un metodo per rilevare e identificare i virus, basato sulla capacità di alcuni virus di agglutinare selettivamente i globuli rossi di determinate specie animali.

La RGA si basa sul fenomeno dell'adesione dei globuli rossi, che avviene sotto l'influenza di vari fattori. Esistono emoagglutinazione diretta e indiretta. Nella reazione di emoagglutinazione diretta, i globuli rossi si uniscono quando determinati antigeni, come i virus, vengono adsorbiti su di essi.

Negli studi sierologici viene utilizzata una reazione di inibizione diretta dell'emoagglutinazione, quando il virus isolato da un paziente viene neutralizzato con siero immunitario specifico e quindi combinato con globuli rossi. L'assenza di emoagglutinazione indica la consistenza del virus e del siero immunitario utilizzato.

La reazione di emoagglutinazione indiretta (emoagglutinazione passiva) si osserva nei casi in cui il siero immunitario o il siero del paziente contenente anticorpi appropriati viene aggiunto ai globuli rossi precedentemente trattati (sensibilizzati) con vari antigeni. Si verifica l'incollaggio specifico dei globuli rossi, la loro emoagglutinazione passiva.

La reazione di emoagglutinazione indiretta o passiva è superiore in sensibilità e specificità ad altri metodi sierologici e viene utilizzata nella diagnosi di infezioni causate da batteri, rickettsie e protozoi.

Il metodo per eseguire una reazione di emoagglutinazione indiretta consiste in diverse fasi. Innanzitutto, i globuli rossi vengono lavati con una soluzione isotonica di cloruro di sodio, quindi, se necessario (quando si utilizzano antigeni proteici), vengono trattati con una soluzione di tannino 1: 20.000 e sensibilizzati con antigeni solubili. Dopo il lavaggio con una soluzione isotonica tamponata di cloruro di sodio, l'antigene eritrocitario è pronto per l'uso. I sieri da testare vengono diluiti con una soluzione isotonica di cloruro di sodio in provette o speciali piastre di plastica con pozzetti, quindi ad ogni diluizione del siero viene aggiunto un diagnostico eritrocitario. I risultati della reazione di emoagglutinazione indiretta vengono presi in considerazione dalla natura del sedimento di globuli rossi formatosi sul fondo della provetta. Un risultato di reazione in cui i globuli rossi ricoprono uniformemente l'intero fondo della provetta è considerato positivo. In una reazione negativa, i globuli rossi sotto forma di un piccolo disco o "bottone" si trovano al centro del fondo della provetta.

Utilizzando l'RGA

L'RGA viene utilizzata per l'indicazione (rilevamento) dei virus durante la diagnostica preliminare, per la titolazione dei virus in base alle proprietà emoagglutinanti (istituzione di unità emoagglutinanti - AE).

Assorbimento del virus

La base del fenomeno dell'agglutinazione causata dai virus è l'adsorbimento dei virus sulla superficie dei globuli rossi, accompagnato dall'incollaggio (agglutinazione) di questi ultimi e dalla precipitazione.

Antigene per RGA

Qualsiasi materiale (materiale patologico sotto forma di sospensione di organi, materiale di EC infetto, colture di tessuti, ecc.) in cui si sospetta la presenza di un virus viene preso come antigene per RGA. Il materiale deve essere liquido, senza particelle di grandi dimensioni.

Impostazione di una RGA approssimativa

Per impostare una RGA approssimativa, si applica una goccia di materiale contenente virus su un vetrino di vetro pulito e ben sgrassato, si aggiunge una goccia di una sospensione di globuli rossi al 5% e si mescola con una bacchetta di vetro.

Valutazione della reazione della RGA

La reazione viene valutata in croci (più). Quando si valuta la reazione negli incroci, prestare attenzione alla natura del sedimento. Se i globuli rossi si depositano uniformemente in uno strato sottile sul fondo della provetta (a forma di ombrello), la reazione viene valutata come quattro croci

2. Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione- una reazione sierologica basata sulla capacità degli anticorpi di prevenire l'agglutinazione degli eritrociti mediante tipi di virus emoagglutinanti (adenovirus, arbovirus, alcuni enterovirus, virus influenzali e parainfluenzali, morbillo, reovirus). Anticorpi antivirali specifici interagiscono con le molecole di emoagglutinina superficiale dei virioni di questi virus e bloccano il loro legame con le molecole complementari della membrana eritrocitaria.

Recentemente, la reazione è stata ampiamente utilizzata nei laboratori di virologia clinica per determinare i titoli di anticorpi specifici contro determinati virus, nonché per l'identificazione sierologica e la tipizzazione di isolati virali da materiale clinico di pazienti. Il loro uso è alquanto limitato a causa della presenza nel siero del sangue umano di inibitori virali non specifici, nonché di anticorpi naturali: agglutinine.

Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (HAI). Nonostante il nome, il principio della reazione è per molti versi simile al pH dei virus, poiché si basa sulla capacità dell'AT di legarsi a vari virus e di neutralizzarli, rendendo impossibile l'agglutinazione dei globuli rossi. Visivamente, questo effetto si manifesta nella "inibizione" dell'emoagglutinazione. RTGA viene utilizzato nella diagnosi delle infezioni virali per identificare antiemoagglutinine specifiche e identificare vari virus in base alle loro emoagglutinine, che presentano le proprietà dell'Ag.

Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione

(RTGA)

un metodo per identificare un virus o rilevare anticorpi antivirali nel siero del sangue di un paziente, basato sul fenomeno dell'assenza di agglutinazione dei globuli rossi da parte di un farmaco contenente un virus in presenza di siero sanguigno ad esso immune.

Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione. Meccanismo e utilizzo pratico.

Molti virus hanno la capacità di agglutinare i globuli rossi di specie di mammiferi e uccelli strettamente definite. Pertanto, i virus dell'influenza e della parotite agglutinano gli eritrociti di polli, porcellini d'India e esseri umani, mentre gli adenovirus agglutinano gli eritrociti di ratti e topi. A questo proposito, rilevarli nel materiale dei pazienti o nelle colture di cellule, embrioni e animali, reazione di emoagglutinazione(RGA). Per fare ciò, nei pozzetti delle piastre vengono preparate diluizioni doppiamente crescenti di materiali e liquidi contenenti virus, aggiungendo ad esse sospensioni di eritrociti NaCl lavati con una soluzione isotonica. Per controllare l'agglutinazione spontanea, i globuli rossi vengono miscelati con un uguale volume di soluzione isotonica di NaCl. Le miscele vengono incubate in termostato a 37°C oa temperatura ambiente.

I risultati dell'analisi a raggi X vengono presi in considerazione dalla natura dell'agglutinazione degli eritrociti dopo 30-60 minuti, quando di solito sono completamente precipitati nel controllo. Una reazione positiva è indicata da vantaggi. “++++” – sedimento a forma di “ombrello”, “+++” – sedimento con lumi, “++” – sedimento con grandi lumi, “+” – sedimento flocculante circondato da una zona di eritrociti accartocciati e “–” – lo stesso sedimento di eritrociti nettamente definito sotto forma di “bottone” del controllo

Essendo gruppo-specifica, la RGA non consente di determinare la specie dei virus. Sono identificati utilizzando Reazioni di inibizione dell'emoagglutinazione(RTGA). Per la sua preparazione vengono utilizzati i noti sieri immunitari antivirali, che vengono diluiti in concentrazioni decrescenti due volte in una soluzione isotonica di cloruro di sodio e versati nei pozzetti. A ciascuna diluizione viene aggiunta una quantità uguale di liquido contenente virus. Il controllo è una sospensione del virus in una soluzione isotonica di cloruro di sodio. Le piastre con una miscela di sieri e virus vengono mantenute in termostato per 30 minuti o a temperatura ambiente per 2 ore, quindi a ciascuna di esse viene aggiunta una sospensione di globuli rossi. Dopo 30 minuti viene determinato il titolo del siero neutralizzante il virus (cioè la sua diluizione massima), che ha causato un ritardo nell'agglutinazione degli eritrociti.

L'RTGA viene utilizzato nella diagnosi sierologica delle malattie virali, in particolare dell'influenza e delle infezioni da adenovirus. È preferibile utilizzarlo come RN, con sieri abbinati. Un aumento di quattro volte del titolo anticorpale nel secondo siero conferma la diagnosi presuntiva

3. Studio sierologico consente di fare una diagnosi se vengono rilevati anticorpi specifici nel siero dei pazienti. Per le reazioni sierologiche vengono utilizzati sieri accoppiati, che vengono prelevati nei primi giorni dall'inizio della malattia e dopo 1 - 3 settimane, ma vengono studiati contemporaneamente. Un aumento del titolo anticorpale di 4 volte o più ha significato diagnostico. RTGA, RN, RSK, RTGads, RIF, RIA, ELISA vengono utilizzati con antigeni (diagnosticum) preparati da ceppi di riferimento dei virus corrispondenti.

4. Accoppiato: ciò significa che il sangue viene prelevato due volte con un certo intervallo di tempo. Aumentando il titolo anticorpale si determina che si è verificata un'infezione. Se il titolo anticorpale non cambia, significa che questi anticorpi sono nel corpo da molto tempo, non c'è una nuova infezione.

Il più grande valore diagnostico è lo studio di sieri accoppiati prelevati da animali all'inizio e alla fine della malattia (con un intervallo di 14-21 giorni). Il siero viene raccolto in provette sterili e conservato per i test.

In laboratorio vengono utilizzate due reazioni di emoagglutinazione con diversi meccanismi d'azione.

La prima RGA è sierologica. In questa reazione, i globuli rossi vengono agglutinati quando interagiscono con anticorpi appropriati (emoagglutinine). La reazione è ampiamente utilizzata per determinare i gruppi sanguigni.

La seconda RGA non è sierologica. In esso, l'adesione dei globuli rossi non è causata da

anticorpi, ma sostanze speciali formate da virus. Ad esempio, il virus dell'influenza agglutina i globuli rossi dei polli e dei porcellini d'India, mentre il virus della poliomielite agglutina i globuli rossi delle pecore. Questa reazione consente di giudicare la presenza di un particolare virus nel materiale in esame.

La reazione viene condotta in provette o su apposite piastre con pozzetti. Il materiale analizzato per la presenza del virus viene diluito con una soluzione isotonica da 1:10 a 1:1280; 0,5 ml di ciascuna diluizione vengono miscelati con un volume uguale di sospensione di globuli rossi all'1-2%. Nel controllo, 0,5 ml di eritrociti vengono miscelati con 0,5 ml di soluzione isotonica. Le provette vengono poste in un termostato per 30 minuti e le piastre vengono lasciate a temperatura ambiente per 45 minuti.

Contabilità dei risultati. Se la reazione è positiva, sul fondo della provetta o del pozzetto appare un sedimento di globuli rossi con bordi smerlati (“ombrello”), che copre l'intero fondo del pozzetto. Se il risultato è negativo, i globuli rossi formano un sedimento denso con bordi lisci (“bottone”). Lo stesso sedimento dovrebbe essere nel controllo. L'intensità della reazione è espressa dai segni “+”. Il titolo del virus è la diluizione massima del materiale in cui avviene l'agglutinazione.

Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione

Si tratta di una reazione sierologica in cui specifici anticorpi antivirali, interagendo con il virus (antigene), lo neutralizzano e lo privano della capacità di agglutinare i globuli rossi, cioè inibiscono la reazione di emoagglutinazione. Questa reazione consente di determinare il tipo e il tipo di virus.

Impostazione di una reazione. 0,25 ml di siero antivirale vengono miscelati con un uguale volume di materiale contenente il virus. La miscela viene agitata e posta in termostato per 30 minuti, dopodiché vengono aggiunti 0,5 ml di sospensione di globuli rossi all'1-2%.

Contabilità dei risultati. Se l'esperimento viene eseguito correttamente, dovrebbe formarsi un "pulsante" nel controllo del siero e degli eritrociti: non esiste alcun fattore che agglutina gli eritrociti; nel controllo dell'antigene si forma un "ombrello": il virus ha causato l'agglutinazione dei globuli rossi. Se il siero è omologo al virus studiato, si forma un “bottone”: il siero ha neutralizzato il virus.

Reazione di emoagglutinazione indiretta

La reazione di emoagglutinazione indiretta (passiva) (RIHA) si basa sul fatto che i globuli rossi, se un antigene solubile viene adsorbito sulla loro superficie, acquisiscono la capacità di agglutinarsi quando interagiscono con gli anticorpi contro l'antigene adsorbito.

Impostazione di una reazione. Il siero viene riscaldato per 30 minuti a 56 °C, diluito sequenzialmente in un rapporto di 1:10 - 1:1280 e versato in provette o pozzetti da 0,25 ml, dove vengono poi aggiunte 2 gocce di globuli rossi con gli antigeni adsorbiti su di essi.

Controlli: una sospensione di eritrociti con antigeni adsorbiti su di essi con siero evidentemente immune, una sospensione di eritrociti con antigeni adsorbiti su di essi con siero normale; una sospensione di globuli rossi normali con siero in esame. Nel primo controllo dovrebbe verificarsi l'agglutinazione, nel secondo e nel terzo non dovrebbe verificarsi.

Domande di controllo.

1. Cosa indica un risultato positivo dell'analisi radiografica tra i globuli rossi e il materiale analizzato per la presenza del virus?

2. Si verificherà una reazione di agglutinazione dei globuli rossi se ad essi viene aggiunto un virus e il siero corrispondente? Qual è il nome della reazione che rivela questo fenomeno?

LAVORO PRATICO N. 12.

Reazione di fissazione del complemento.

La reazione di fissazione del complemento (FFR) si basa sul fatto che uno specifico complesso antigene-anticorpo adsorbe (si lega) sempre il complemento a se stesso.

Questa reazione è ampiamente utilizzata nell'identificazione degli antigeni e nella sierodiagnosi delle infezioni, in particolare delle malattie causate da spirochete (reazione di Wassermann), rickettsie e virus.

RKS è una reazione sierologica complessa. Coinvolge il complemento e due sistemi antigene-anticorpo. Si tratta essenzialmente di due reazioni sierologiche.

Il sistema principale corretto è costituito da un antigene e da un anticorpo (uno è noto, l'altro no). Ad esso viene aggiunta una certa quantità di complemento. Se l'antigene e l'anticorpo di questo sistema corrispondono, si collegheranno e legheranno un complemento. Il complesso risultante è finemente disperso e non visibile.

La formazione di questo complesso viene rilevata utilizzando un secondo sistema emolitico o indicatore. Comprende i globuli rossi di pecora (antigene) e il corrispondente siero emolitico (anticorpo), cioè complesso immunitario già pronto. In questo sistema, la lisi dei globuli rossi può avvenire solo in presenza del complemento. Se il complemento è vincolato dal primo sistema, nel secondo sistema non ci sarà emolisi, perché nessun complemento gratuito. L'assenza di emolisi (il contenuto della provetta è torbido o sul fondo è presente un sedimento di eritrociti) viene registrata come risultato RSK positivo.

Se nel primo sistema l'antigene non corrisponde all'anticorpo, allora non si formerà l'immunocomplesso e il complemento rimarrà libero. Rimanendo libero, il complimento partecipa al secondo sistema, provocando l'emolisi, il risultato dell'RSC è negativo (il contenuto delle provette è trasparente - “sangue laccato”).

Componenti, reazioni di fissazione del complemento:

1. Antigene - solitamente lisato, estratto, aptene,

meno spesso una sospensione di microrganismi.

2. Anticorpo: siero del paziente.

3. Complemento: siero di cavia.

4. Antigene: eritrociti di pecora.

5. Anticorpo: emolisina contro eritrociti di pecora.

6. Soluzione isotonica.

A causa del fatto che nella RSC sono coinvolti un gran numero di componenti complessi,

devono prima essere titolati e fatti reagire in quantità esatte e in volumi uguali: 0,5 o 0,25, meno spesso 0,2, 1,25 o 1,0 ml (volumi maggiori danno un risultato più accurato). La titolazione dei componenti della reazione viene effettuata nello stesso volume dell'esperimento, sostituendo gli ingredienti mancanti con una soluzione isotonica.

Reazione di emoagglutinazione (HRA)

La RGA si basa sul fatto che alcuni tipi di batteri e virus hanno la capacità di adsorbirsi sulla superficie dei globuli rossi di diverse specie di animali (e uccelli), facendoli aderire tra loro e formare un agglutinato (RGA diretta).

L'adsorbimento dell'antigene (batteri, virus) sulla superficie degli eritrociti non si manifesta sempre con la formazione di un precipitato visibile; Inoltre, l’RHA non è specifico perché i globuli rossi della stessa specie animale possono adsorbire antigeni diversi.

La reazione di emoagglutinazione passiva (indiretta) (RPHA) è specifica. Per eseguire questa procedura, viene prima preparato un diagnostico eritrocitario (eritrociti su cui è adsorbito l'antigene). A questo scopo, il sangue di pecora (o di gallo) viene ottenuto sterilmente, defibrinato e lavato più volte in una soluzione tamponata con fosfato (pH 7,2) utilizzando una centrifugazione di 3-5 volte. Il surnatante viene rimosso, la concentrazione degli eritrociti viene regolata al 2,5% (1:40). Ad una sospensione di eritrociti al 2,5% aggiungere un volume uguale (1 ml o 0,5 ml) di una sospensione di batteri della specie microbica in studio ad una concentrazione di 5-10 miliardi di cellule per 1 ml. I globuli rossi assorbono facilmente gli antigeni polisaccaridici. Per adsorbire un antigene proteico, gli eritrociti vengono pretrattati con tannino ad una diluizione di 1:20.000. Gli eritrociti in combinazione con l'antigene aggiunto vengono lasciati per la sensibilizzazione (adsorbimento) per 2 ore in un termostato (37 °C), quindi centrifugati. sempre a 3-4mila giri al minuto per 5 minuti con soluzione tampone fosfato (Fig. 9.13).

Il diagnostico eritrocitario risultante viene posto in provette (o pozzetti su una tavola di plexiglass) e ad esso viene aggiunto siero immunitario standard.

In casi positivi si verificherà RHA: perdita di globuli rossi sotto forma di un caratteristico sedimento scaglioso o granulare distribuito su tutta la superficie del fondo della provetta (emoagglutinato). Ciò significa che il tipo di microbo studiato (antigene) è specifico per gli anticorpi del siero immunitario. In casi negativi, i globuli rossi non incollati si depositeranno sul fondo sotto forma di un piccolo cerchio uniforme.

Per una maggiore affidabilità dei risultati, viene eseguita RPGA ritardo della reazione(frenata) fenomeno dell'emoagglutinazione(RZGA) o sua modifica - reazione di neutralizzazione degli anticorpi(RIA).

Riso. 9.13. Reazione di emoagglutinazione passiva (schema): Er - globuli rossi: AG - antigene: AT - anticorpo

L'essenza di RZGA consiste nel fatto che viene eseguita una reazione di agglutinazione con un siero diagnostico specifico e un antigene del test (il tipo di microbo studiato viene utilizzato come antigene). Questa miscela viene mantenuta per 1-2 ore a 37 °C, quindi vengono aggiunti i globuli rossi. Se l'antigene del test è omologo agli anticorpi del siero diagnostico, questi interagiscono tra loro e i globuli rossi aggiunti non si agglutinano: il risultato della reazione è positivo. Se l'antigene del test non è omologo agli anticorpi del siero o non è contenuto nel materiale, gli eritrociti aggiunti assorbono l'antigene e si verifica la RGA: il risultato della RGA è negativo, il tipo di microbo (antigene) da testare non è stabilito.

Metodologia per impostare il PH A consiste nel prelevare volumi uguali e miscelare il siero immunitario diagnostico con varie diluizioni del materiale da testare (l'antigene desiderato), lasciandolo a contatto per 1-2 ore, quindi aggiungere globuli rossi sensibilizzati con un determinato antigene (noto) specifico degli anticorpi sierici (diagnosi eritrocitaria). Quando l'antigene desiderato reagisce con gli anticorpi sierici, questi vengono neutralizzati e i globuli rossi aggiunti non si agglutinano, l'RHA non si verifica: il risultato dell'RHA è positivo. Se il materiale del test non contiene un antigene specifico per gli anticorpi del siero utilizzato, la neutralizzazione degli anticorpi non avrà luogo. Pertanto, quando si aggiunge il diagnostico eritrocitario, appare l'agglutinazione degli eritrociti (emoagglutinazione) e il risultato dell'RNA è negativo. La reazione di neutralizzazione degli anticorpi è un metodo altamente sensibile per rilevare l'antigene non solo in una sospensione di batteri vivi (o uccisi), ma anche in una sospensione di tessuto macinato di vari organi, secrezioni native e riscaldate ed escrementi di un organismo malato.

Principio RTGA consiste nel mescolare volumi uguali di siero sanguigno e una sospensione del virus in una provetta e, dopo l'esposizione, determinare se il virus rimane nella miscela aggiungendo una sospensione di globuli rossi. L'agglutinazione degli eritrociti indica la presenza e l'assenza di emoagglutinazione indica l'assenza di virus nella miscela. La scomparsa del virus dalla miscela virus + siero è considerata un segno di interazione tra gli anticorpi sierici e il virus.

Ma gli anticorpi interagiscono con gli antigeni in rapporti quantitativi rigorosamente definiti. Pertanto, affinché una certa quantità di virus venga privata della sua capacità emoagglutinante, è necessario un certo minimo di anticorpi e, poiché uno dei componenti dell'RTHA è sempre sconosciuto, la reazione deve essere collocata in una serie di provette con dosi diverse di anticorpi e le stesse dosi di virus, o viceversa. Ciò si ottiene prelevando diverse diluizioni del siero e la stessa diluizione del virus, oppure diverse diluizioni del virus e la stessa diluizione del siero.

RTGA consente di risolvere i seguenti problemi: determinare il titolo degli anticorpi contro il virus emoagglutinante nel siero; identificare un virus emoagglutinante sconosciuto da sieri noti; stabilire il grado di parentela antigenica dei due virus.

Vantaggi dell'RTGA: semplicità della tecnica, velocità, non richiede lavoro sterile, specificità, basso costo. Svantaggio: la RTGA è possibile solo con virus emoagglutinanti.

Il principio della titolazione degli anticorpi in RTGAè come segue:

– preparare una serie di diluizioni successive (solitamente doppie) del siero in esame in volumi uguali (solitamente 0,25 o 0,2 ml);

– ad ogni diluizione aggiungere gli stessi volumi di virus omologo in un titolo di 4 HAE;

– le miscele vengono conservate per un certo tempo ad una certa temperatura (per il virus della malattia di Newcastle 40–60 minuti a temperatura ambiente);

– a tutte le miscele si aggiungono uguali volumi di una sospensione all'1% di eritrociti lavati;

– dopo l'esposizione, l'emoagglutinazione in ciascuna miscela viene valutata in croci.

La reazione include controlli di siero, virus e globuli rossi.

Come indicatore del titolo anticorpale in questo siero viene presa la diluizione del siero più alta che inibisce ancora completamente l'emoagglutinazione.

Utilizzo della reazione di emoassorbimento in virologia.

RGAd. L'emoadsorbimento - la connessione degli eritrociti con la superficie delle cellule colpite dal virus - fu scoperto per la prima volta da Vogel e Shchelokov (1957) su una coltura di tessuto infetto dal virus dell'influenza. Questo fenomeno si basa sull'affinità dei recettori del virus situati sulla superficie della cellula colpita con i recettori degli eritrociti, che porta alla loro reciproca adesione simile alla reazione di emoagglutinazione. Il vantaggio di questa reazione è che diventa positiva anche prima della comparsa di evidenti cambiamenti citopatici nelle cellule infette.

Tecnica RGAdè come segue. Il 3-4o giorno dopo l'infezione delle cellule, vengono prelevate due provette con la stessa coltura cellulare, una delle quali è infettata con materiale contenente virus e la seconda è di controllo. Il liquido di coltura viene drenato da entrambe le provette e ad entrambe vengono aggiunte 2-3 gocce di una sospensione allo 0,5% di eritrociti lavati. Entrambe le provette vengono lasciate per 5-10 minuti in modo che i globuli rossi siano sulla superficie delle cellule (posizionate orizzontalmente sul tavolo), quindi leggermente risciacquate con soluzione salina ed esaminate al microscopio (basso ingrandimento). Nella provetta di controllo i globuli rossi vengono completamente rimossi con la soluzione salina e una parte di quelli rimanenti galleggia insieme al liquido. Se in una provetta infetta i globuli rossi non sono stati rimossi con soluzione salina e non galleggiano, ma sono attaccati alla superficie delle cellule, RGAd deve essere considerato positivo.

A seconda del virus e del tipo di cellula, la disposizione dei globuli rossi può essere triplice:

– i globuli rossi vengono adsorbiti solo lungo la periferia dello strato cellulare sotto forma di “collana” (virus della peste suina africana);

– i globuli rossi si trovano sullo strato cellulare in focolai o grappoli (virus dell’influenza);

– i globuli rossi si trovano diffusamente sullo strato cellulare (virus della parainfluenza).

Ciascun virus è in grado di assorbire i globuli rossi di alcune specie di animali.

Diagnosi sierologica delle malattie virali mediante l'aumento del titolo anticorpale in sieri di sangue accoppiati.

Reazione di emoagglutinazione (HRA) e reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (HIR), meccanismo, componenti e applicazione delle reazioni.

La reazione di emoagglutinazione si basa sul fenomeno dell'incollaggio dei globuli rossi, che avviene sotto l'influenza di vari fattori. Esistono emoagglutinazione diretta e indiretta.

Innanzitutto, i globuli rossi vengono lavati con una soluzione isotonica di cloruro di sodio, quindi, se necessario (quando si utilizzano antigeni proteici), vengono trattati con una soluzione di tannino 1: 20.000 e sensibilizzati con antigeni solubili. Dopo il lavaggio con una soluzione isotonica tamponata di cloruro di sodio, l'antigene eritrocitario è pronto per l'uso.

I sieri da testare vengono diluiti con una soluzione isotonica di cloruro di sodio in provette o speciali piastre di plastica con pozzetti, quindi ad ogni diluizione del siero viene aggiunto un diagnostico eritrocitario. I risultati della reazione di emoagglutinazione indiretta vengono presi in considerazione dalla natura del sedimento di globuli rossi formatosi sul fondo della provetta. Un risultato di reazione in cui i globuli rossi ricoprono uniformemente l'intero fondo della provetta è considerato positivo. In caso di reazione negativa, al centro del fondo della provetta si trovano i globuli rossi sotto forma di un piccolo disco o "bottone"

Componenti principali del RP:

A) antigene solubile,

B) Anticorpi specifici (siero)

(RTGA) è un metodo per identificare un virus o rilevare anticorpi antivirali nel siero di un paziente, basato sul fenomeno dell'assenza di agglutinazione dei globuli rossi da parte di un farmaco contenente un virus in presenza di siero sanguigno ad esso immune.
si basa sul blocco, sulla soppressione degli antigeni virali da parte degli anticorpi del siero immunitario, a seguito dei quali i virus perdono la capacità di agglutinare i globuli rossi.

RTGA viene utilizzato per diagnosticare molte malattie virali, i cui agenti causali (virus dell'influenza, morbillo, rosolia, encefalite trasmessa da zecche, ecc.) Possono agglutinare gli eritrociti di vari animali.
Meccanismo. La tipizzazione del virus viene effettuata utilizzando una reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (HAI) con un set di sieri tipo-specifici. I risultati della reazione vengono presi in considerazione dall'assenza di emoagglutinazione. Sottotipi di virus A con antigeni H0N1, H1N1, H2N2, H3N2, ecc.

possono essere differenziati in RTGA con un set di sieri omologhi tipo-specifici.

Al centro Reazioni di emoagglutinazione si trova il fenomeno dell'adesione dei globuli rossi, che si verifica sotto l'influenza di vari fattori.

Esistono emoagglutinazione diretta e indiretta.
Nella reazione di emoagglutinazione diretta, i globuli rossi si uniscono quando determinati antigeni, come i virus, vengono adsorbiti su di essi.
Negli studi sierologici viene utilizzata una reazione di inibizione diretta dell'emoagglutinazione, quando il virus isolato da un paziente viene neutralizzato con siero immunitario specifico e quindi combinato con globuli rossi.

L'assenza di emoagglutinazione indica la consistenza del virus e del siero immunitario utilizzato.

La reazione di emoagglutinazione indiretta (emoagglutinazione passiva) si osserva nei casi in cui il siero immunitario o il siero del paziente contenente anticorpi appropriati viene aggiunto ai globuli rossi precedentemente trattati (sensibilizzati) con vari antigeni.

Si verifica l'incollaggio specifico dei globuli rossi, la loro emoagglutinazione passiva.

La reazione di emoagglutinazione indiretta o passiva è superiore in sensibilità e specificità ad altri metodi sierologici e viene utilizzata nella diagnosi di infezioni causate da batteri, rickettsie e protozoi.

Il metodo per eseguire una reazione di emoagglutinazione indiretta consiste in diverse fasi.

Innanzitutto, i globuli rossi vengono lavati con una soluzione isotonica di cloruro di sodio, quindi, se necessario (quando si utilizzano antigeni proteici), vengono trattati con una soluzione di tannino 1: 20.000 e sensibilizzati con antigeni solubili.

Dopo il lavaggio con una soluzione isotonica tamponata di cloruro di sodio, l'antigene eritrocitario è pronto per l'uso. I sieri da testare vengono diluiti con una soluzione isotonica di cloruro di sodio in provette o speciali piastre di plastica con pozzetti, quindi ad ogni diluizione del siero viene aggiunto un diagnostico eritrocitario.

I risultati della reazione di emoagglutinazione indiretta vengono presi in considerazione dalla natura del sedimento di globuli rossi formatosi sul fondo della provetta. Un risultato di reazione in cui i globuli rossi ricoprono uniformemente l'intero fondo della provetta è considerato positivo. In una reazione negativa, i globuli rossi sotto forma di un piccolo disco o "bottone" si trovano al centro del fondo della provetta.

Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione- una reazione sierologica basata sulla capacità degli anticorpi di prevenire l'agglutinazione degli eritrociti mediante tipi di virus emoagglutinanti (adenovirus, arbovirus, alcuni enterovirus, virus influenzali e parainfluenzali, morbillo, reovirus).

Anticorpi antivirali specifici interagiscono con le molecole di emoagglutinina superficiale dei virioni di questi virus e bloccano il loro legame con le molecole complementari della membrana eritrocitaria.

Recentemente, la reazione è stata ampiamente utilizzata nei laboratori di virologia clinica per determinare i titoli di anticorpi specifici contro determinati virus, nonché per l'identificazione sierologica e la tipizzazione di isolati virali da materiale clinico di pazienti.

Il loro uso è alquanto limitato a causa della presenza nel siero del sangue umano di inibitori virali non specifici, nonché di anticorpi naturali: agglutinine.

La reazione di neutralizzazione è la reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (HAI).

RTGA viene utilizzato:
-per la sierotipizzazione dei virus;
-per la sierodiagnosi delle infezioni.
Esistono due metodi di impostazione:
— metodo a goccia su vetro (reazione approssimativa), utilizzato per la sierocopia dei virus;
- espanso in provette.

Meccanismo.

Alcuni virus (come quello dell'influenza) contengono emoagglutinina, che provoca l'agglutinazione dei globuli rossi di vari animali, a seconda del tipo di virus.

In presenza di anticorpi - antiemoagglutinine - nel siero si osserva l'inibizione dell'attività virale.
RTGA.
Obiettivo: sierotipizzazione del virus dell’influenza A

Componenti:
1. Il materiale in studio è il fluido allantoico di un embrione di pollo,
2. Sieri diagnostici anti-influenzali tipo-specifici,
3. Sospensione al 5% di eritrociti di pollo.
4.

Salino.

La reazione viene condotta su vetro utilizzando il metodo della goccia. Applicare 1 goccia di sieri diagnostici e materiale di prova sul vetro, mescolare, quindi aggiungere 1 goccia di sospensione di globuli rossi. Con una reazione positiva si osserva un rossore omogeneo e con una reazione negativa cadono scaglie rosse (emoagglutinazione).

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Caratteristiche dei virus influenzali. Epidemiologia e diagnosi dell'influenza. Utilizzo dell'RTGA per la sierotipizzazione dei virus influenzali. Preparati per la prevenzione e il trattamento specifici.

L'influenza o l'influenza è una malattia infettiva acuta caratterizzata da danni alle mucose del tratto respiratorio superiore, febbre, intossicazione generale e interruzione del sistema cardiovascolare e nervoso.

L’influenza è soggetta a diffusione epidemica e pandemica a causa dell’elevata contagiosità e variabilità dell’agente patogeno.

Caratteristiche degli agenti patogeni. Agenti patogeni: i virus dell'influenza appartengono alla famiglia. Orthomyxoviridae, generi Influenzavirus A, B e Influenzavirus C. I virus dell'influenza sono virus a RNA. Il virus dell'influenza di tipo A fu isolato nel 1933 da W. Smith, K. Andrews e P. Laidlaw. Nel 1940 T.

Applicazione del metodo dell'emoagglutinazione in virologia.

Francis e R. Magill isolarono virus influenzali di tipo B, nel 1949 R. Taylor - tipo C. In Russia, i primi virus influenzali furono isolati nel 1936 da A. A. Smorodintsev e classificati come tipo A. Morfologia. I virus dell'influenza hanno una forma sferica (forma sferica) - 80 - 120 nm, meno spesso hanno una forma filamentosa. Sono costituiti da: 1) nucleo - nucleocapside di tipo elicoidale di simmetria (filamento lineare “-” a filamento singolo di RNA + capside proteico); 2) membrana basale - membrana lipoproteica esterna - supercapside.

Sulla superficie del guscio sono presenti glicoproteine ​​​​(sotto forma di punte e villi) di 2 tipi: 1) emoagglutinina - promuove l'attaccamento ai recettori cellulari; 2) neuraminidasi: promuove il rilascio del virus dalla cellula. Coltivazione. Per la coltivazione vengono utilizzati embrioni di pollo, colture cellulari primarie trypsinizzate e talvolta animali da laboratorio.

Il modello più conveniente sono gli embrioni di pollo di 10-12 giorni. Permette di ottenere grandi quantità del virus, necessario nella produzione di vaccini e farmaci antibatterici.

L'infezione viene effettuata nella cavità allontoica, nella membrana corion-allontoica, nella cavità amniotica, nell'amnio. La presenza del virus in un embrione di pollo viene rilevata mediante una reazione di emoagglutinazione. Struttura antigenica. I virus hanno un antigene interno - S e antigeni di superficie: HA-emoagglutinina e NA-neuraminidasi. L'antigene S è specifico del gruppo, comune a tutto il tipo, secondo questo antigene i virus dell'influenza sono divisi in tipi A, B e C. Questo è un antigene stabile (immutabile) che fissa il complemento;

Gli antigeni HA e NA sono antigeni specifici. L'antigene HA provoca la formazione di anticorpi neutralizzanti il ​​virus e l'adesione dei globuli rossi.

L'antigene NA provoca la formazione di anticorpi che neutralizzano parzialmente i virus.

Il virus di tipo B è meno variabile, mentre il tipo C è altamente stabile.

Proprietà tossiche. L'effetto tossico del virus sull'organismo (mal di testa, dolori muscolari, febbre, sintomi catarrali) è causato dalle proteine ​​del virus (la particella virale stessa). Questa azione è strettamente specifica e viene neutralizzata solo dal siero immunitario del tipo o sottotipo appropriato o dal siero di coloro che sono guariti dalla malattia. Resistenza. I virus dell'influenza sono sensibili ai raggi UV, ai disinfettanti (formalina, alcool, fenolo, cloramina) e ai solventi grassi.

In ambiente liquido muoiono ad una temperatura di 50 - 60°C per diversi minuti. A temperatura ambiente nell'aria, i virus mantengono le proprietà infettive per diverse ore. Durano a lungo una volta essiccati, e una volta congelati (-70°C) non solo durano a lungo, ma non perdono nemmeno la virulenza.

Suscettibilità degli animali. In condizioni naturali, i virus di tipo A infettano l’uomo e gli animali (sono colpiti cavalli e maiali), mentre i virus di tipo B e C infettano solo l’uomo. Tra gli animali da laboratorio, i topi bianchi, i furetti africani, i criceti siriani e le scimmie sono sensibili ai virus.

La malattia negli animali è caratterizzata da danni ai polmoni, stato febbrile e può provocare la morte degli animali. Epidemiologia della malattia. La fonte dell'infezione è una persona malata con una forma clinicamente pronunciata o asintomatica. Una persona malata rilascia il virus nell'ambiente quando tossisce, parla, starnutisce con gocce di saliva, muco, espettorato già durante il periodo di incubazione.

Il paziente diventa contagioso 24 ore prima della comparsa dei sintomi principali e costituisce un pericolo epidemico entro 48 ore dalla loro scomparsa.

Il meccanismo di trasmissione è aerogeno. La via di trasmissione è aerea. La suscettibilità delle persone all'influenza è molto elevata. Sono colpite tutte le fasce d’età, soprattutto in inverno. I bambini e gli anziani sono i più sensibili. Il nome della malattia riflette le peculiarità dell'epidemiologia: influenza dal francese. gripper - afferrare, influenza - dall'italiano. Influenza da freddo - l'influenza del freddo.

Di tutte le malattie respiratorie acute, l’influenza è la malattia più diffusa e grave. Le pandemie e le epidemie influenzali colpiscono fino al 30-50% o più della popolazione mondiale, causando enormi danni alla salute e all’economia dei Paesi. Le prime descrizioni di epidemie influenzali risalgono al XII-XIV secolo. Il verificarsi di pandemie e di grandi epidemie è causato dal virus dell'influenza di tipo A, che è dovuto all'elevata variabilità del virus ed è associato alla comparsa di un nuovo sottotipo a seguito dello spostamento dell'antigene.

Tra una pandemia e l'altra, ogni 1,5-2 anni si verificano epidemie, che sono associate alla deriva antigenica dei virus. Nel 1918, la pandemia di influenza spagnola (1,5 miliardi di persone si ammalò, 20 milioni di persone morirono) fu causata dal virus influenzale A1. Inizialmente registrata in Spagna, questa pandemia colpì quasi tutta la popolazione della Terra; la malattia era caratterizzata dallo sviluppo di una polmonite emorragica estremamente grave con un tasso di mortalità record (fino all'1% di tutti i casi).

Nel 1957, la pandemia “asiatica” (2 miliardi di persone si ammalarono) fu causata da un nuovo sottotipo, il sottotipo A2. Nel 1968, la pandemia “Hong Kong” (1 miliardo di persone si ammalò) fu causata da un sottotipo emergente, il sottotipo A3. In genere, una nuova variante del virus sostituisce la variante precedentemente circolante nella popolazione umana.

Ma nel 1977, dopo una pausa di 20 anni, il tipo A1 “ritornò” inaspettatamente, provocando una grave epidemia. Di conseguenza, le varianti dislocate del virus influenzale persistono e, a determinati intervalli, possono nuovamente causare un’epidemia. Il virus di tipo B provoca epidemie locali, ma il tipo C non causa epidemie. Patogenesi e quadro clinico della malattia. La porta d'ingresso è il tratto respiratorio superiore. Il virus invade le cellule epiteliali della mucosa e si moltiplica in esse.

L'effetto del virus sulle cellule epiteliali provoca la necrosi e la desquamazione (rigetto) dell'epitelio, a seguito della quale la mucosa diventa permeabile a virus e batteri. Penetrano nel sangue e si diffondono in tutto il corpo. La viremia è accompagnata da lesioni multiple dell'endotelio capillare con aumento della loro permeabilità.

Nei casi più gravi si osservano estese emorragie nei polmoni, nel miocardio e negli organi parenchimali. I prodotti di degradazione delle cellule danneggiate e delle proteine ​​virali hanno un effetto tossico su vari organi e sistemi di organi. Le tossine del virus deprimono fortemente il sistema nervoso centrale e, sebbene il processo non duri a lungo (3 - 5 giorni), il malato rimane indebolito per molto tempo e qualche infezione secondaria si unisce al corpo indebolito e sorgono complicazioni: polmonite influenzale , edema polmonare acuto, danno renale , cuore, bronchi.

Una complicanza comune dell'influenza è la polmonite batterica (streptococchi di gruppo B). Durante la pandemia di influenza spagnola, le persone morirono principalmente di polmonite batterica secondaria.

Nella patogenesi dell'influenza, non solo l'intossicazione, ma anche l'allergia, nonché la violazione delle proprietà funzionali delle cellule immunocompetenti con lo sviluppo dell'immunodeficienza sono importanti. Il periodo di incubazione è di diverse ore - 1-3 giorni. Caratterizzato da esordio acuto, aumento della temperatura a 37,5 - 38 ° C, intossicazione generale, espressa in malessere, mal di testa, dolore agli occhi, processi infiammatori delle vie respiratorie di varia gravità (rinite, laringite, tracheite, faringite).

Lo stato febbrile dell'influenza senza complicazioni dura 5-6 giorni. Immunità. Dopo una malattia si forma l'immunità tipo-specifica e ceppo-specifica, fornita da fattori cellulari e umorali specifici e aspecifici. Gli anticorpi Ig A sono di grande importanza. L'immunità crociata non si sviluppa dopo aver sofferto di influenza di tipo A1, si può contrarre l'influenza di tipo A2, ecc. Dopo un virus di tipo B, l'immunità dura 1-2 anni, dopo un virus di tipo B - 3-5 anni.

Immunità naturale passiva - nei bambini di età inferiore a 8-11 mesi. A causa dell'elevata variabilità antigenica del virus, la guarigione non porta allo sviluppo di un'immunità stabile alle infezioni ripetute.

Diagnostica di laboratorio. Materiale in studio: impronte di strisci dalla mucosa della cavità nasale, secrezione nasofaringea, pezzi di polmoni, cervello in caso di morte.

Metodi diagnostici: 1) metodo citorinoscopico - rilevamento di inclusioni intracellulari specifiche del virus - quando colorato con piottanina al microscopio, sono visibili inclusioni rosso vivo del virus dell'influenza nelle cellule dell'epitelio ciliare; 2) metodo virologico: isolamento del virus dell'influenza dal corpo umano infettando embrioni di pollo con un tampone prelevato dal rinofaringe del paziente; l'indicazione (presenza) del virus viene effettuata utilizzando l'RGA (i virus dell'influenza agglutinano gli eritrociti dell'uomo e di vari animali), l'identificazione del virus viene effettuata in più fasi: il tipo è determinato nell'RSC, il sottotipo dell'emoagglutinina è determinato nell'RSC RGA e il sottotipo neuraminidasi vengono determinati nella reazione di inibizione dell'attività enzimatica; 3) metodo sierologico - rilevamento di un aumento del titolo (4 volte) di anticorpi specifici nel siero del paziente utilizzando RSK, RTGA, RN in coltura cellulare, reazione di precipitazione in gel, ELISA; 4) metodo biologico - infezione intranasale dei topi - iniezione di materiale nei polmoni sotto anestesia con etere; i topi muoiono dopo 2 - 3 giorni a causa della polmonite; 5) diagnostica rapida: rilevamento dell'antigene virale mediante RIF.

Trattamento e prevenzione.

Per la prevenzione e il trattamento nei primi giorni della malattia, viene utilizzato l'interferone leucocitario umano (per via intranasale). Per scopi medicinali vengono utilizzati farmaci antivirali - remantadina (influenza di tipo A), adapromina, virazolo e farmaci immunomodulatori - dibazolo, prodigiosan, levomisolo.

In caso di influenza grave, soprattutto nei bambini, vengono utilizzate immunoglobuline anti-influenzali da donatori e farmaci inibitori delle proteasi cellulari (Gordox, Contrical, acido aminocaproico).

Prevenzione speciale. Vengono utilizzati i seguenti farmaci antivirali e immunomodulatori, nonché vaccini - vivi e inattivati: 1) monovaccini vivi per uso orale - ceppi attenuati dei virus attualmente circolanti (A1, A3 e B); mostrare la massima immunogenicità; 2) vaccini a virioni interi da ceppi virulenti inattivati ​​dalla formaldeide o dai raggi UV; 3) vaccini antinfluenzali a subunità solo da antigeni di superficie - antigeni HA e NA (hanno reattogenicità minima).

Per ottenere vaccini, i virus vengono coltivati ​​in embrioni di pollo e in colture cellulari di embrioni di pollo.

Quando vengono somministrati i vaccini si forma l'immunità locale e umorale. La vaccinazione viene effettuata nei periodi di maggior rischio di epidemie. È indicato soprattutto per i giovani e gli anziani. L'uso di vaccini uccisi richiede una rivaccinazione annuale; la loro efficacia non supera il 60 - 70%.

Perché Spesso si osservano variazioni antigeniche dell'agente patogeno, quindi l'insieme di antigeni del virus corrispondente per l'immunizzazione può essere determinato solo dopo l'inizio dello scoppio della malattia.

Biglietto 15.

Reazione di emoagglutinazione (HRA).

In laboratorio vengono utilizzate due reazioni di emoagglutinazione con diversi meccanismi d'azione.

La prima RGA è sierologica. In questa reazione, i globuli rossi vengono agglutinati quando interagiscono con anticorpi appropriati (emoagglutinine).

La reazione è ampiamente utilizzata per determinare i gruppi sanguigni.

La seconda RGA non è sierologica. In esso, l'adesione dei globuli rossi non è causata da

anticorpi, ma sostanze speciali formate da virus. Ad esempio, il virus dell'influenza agglutina i globuli rossi dei polli e dei porcellini d'India, mentre il virus della poliomielite agglutina i globuli rossi delle pecore. Questa reazione consente di giudicare la presenza di un particolare virus nel materiale in esame.

La reazione viene condotta in provette o su apposite piastre con pozzetti.

Il materiale analizzato per la presenza del virus viene diluito con una soluzione isotonica da 1:10 a 1:1280; 0,5 ml di ciascuna diluizione vengono miscelati con un volume uguale di sospensione di globuli rossi all'1-2%. Nel controllo, 0,5 ml di eritrociti vengono miscelati con 0,5 ml di soluzione isotonica. Le provette vengono poste in un termostato per 30 minuti e le piastre vengono lasciate a temperatura ambiente per 45 minuti.

Contabilità dei risultati. Se la reazione è positiva, sul fondo della provetta o del pozzetto appare un sedimento di globuli rossi con bordi smerlati (“ombrello”), che copre l'intero fondo del pozzetto.

Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione

Se il risultato è negativo, i globuli rossi formano un sedimento denso con bordi lisci (“bottone”). Lo stesso sedimento dovrebbe essere nel controllo.

L'intensità della reazione è espressa dai segni “+”. Il titolo del virus è la diluizione massima del materiale in cui avviene l'agglutinazione.

Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione

Si tratta di una reazione sierologica in cui specifici anticorpi antivirali, interagendo con il virus (antigene), lo neutralizzano e lo privano della capacità di agglutinare i globuli rossi, cioè di agglutinare i globuli rossi.

e. inibire la reazione di emoagglutinazione. Questa reazione consente di determinare il tipo e il tipo di virus.

Impostazione di una reazione. 0,25 ml di siero antivirale vengono miscelati con un uguale volume di materiale contenente il virus. La miscela viene agitata e posta in termostato per 30 minuti, dopodiché vengono aggiunti 0,5 ml di sospensione di globuli rossi all'1-2%.

Contabilità dei risultati. Se l'esperimento viene eseguito correttamente, dovrebbe formarsi un "pulsante" nel controllo del siero e degli eritrociti: non esiste alcun fattore che agglutina gli eritrociti; nel controllo dell'antigene si forma un "ombrello": il virus ha causato l'agglutinazione dei globuli rossi.

Se il siero è omologo al virus studiato, si forma un “bottone”: il siero ha neutralizzato il virus.

Reazione di emoagglutinazione indiretta

La reazione di emoagglutinazione indiretta (passiva) (RIHA) si basa sul fatto che i globuli rossi, se un antigene solubile viene adsorbito sulla loro superficie, acquisiscono la capacità di agglutinarsi quando interagiscono con gli anticorpi contro l'antigene adsorbito.

Impostazione di una reazione.

Il siero viene riscaldato per 30 minuti a 56 °C, diluito sequenzialmente in rapporto 1:10 - 1:1280 e versato in 0,25 ml in provette o pozzetti, dove vengono poi poste 2 gocce di globuli rossi con antigeni adsorbiti su di essi. aggiunto.

Controlli: una sospensione di eritrociti con antigeni adsorbiti su di essi con siero evidentemente immune, una sospensione di eritrociti con antigeni adsorbiti su di essi con siero normale; una sospensione di globuli rossi normali con siero in esame.

Nel primo controllo dovrebbe verificarsi l'agglutinazione, nel secondo e nel terzo non dovrebbe verificarsi.

Domande di controllo.

1. Cosa indica un risultato positivo dell'analisi radiografica tra i globuli rossi e il materiale analizzato per la presenza del virus?

2. Si verificherà una reazione di agglutinazione dei globuli rossi se ad essi viene aggiunto un virus e il siero corrispondente?

Qual è il nome della reazione che rivela questo fenomeno?

LAVORO PRATICO N. 12.

Reazione di fissazione del complemento.

La reazione di fissazione del complemento (CFR) si basa sul fatto che uno specifico complesso antigene-anticorpo adsorbe (si lega) sempre il complemento a se stesso.

Questa reazione è ampiamente utilizzata nell'identificazione degli antigeni e nella sierodiagnosi delle infezioni, in particolare delle malattie causate da spirochete (reazione di Wassermann), rickettsie e virus.

RKS è una reazione sierologica complessa.

Coinvolge il complemento e due sistemi antigene-anticorpo. Si tratta essenzialmente di due reazioni sierologiche.

Il sistema principale corretto è costituito da un antigene e da un anticorpo (uno è noto, l'altro no). Ad esso viene aggiunta una certa quantità di complemento. Se l'antigene e l'anticorpo di questo sistema corrispondono, si collegheranno e legheranno un complemento. Il complesso risultante è finemente disperso e non visibile.

La formazione di questo complesso viene rilevata utilizzando un secondo sistema emolitico o indicatore.

Comprende i globuli rossi di pecora (antigene) e il corrispondente siero emolitico (anticorpo), cioè complesso immunitario già pronto. In questo sistema, la lisi dei globuli rossi può avvenire solo in presenza del complemento. Se il complemento è vincolato dal primo sistema, nel secondo sistema non ci sarà emolisi, perché

nessun complemento gratuito. L'assenza di emolisi (il contenuto della provetta è torbido o sul fondo è presente un sedimento di eritrociti) viene registrata come risultato RSK positivo.

Se nel primo sistema l'antigene non corrisponde all'anticorpo, allora non si formerà l'immunocomplesso e il complemento rimarrà libero. Rimanendo libero, il complimento partecipa al secondo sistema, provocando l'emolisi, il risultato dell'RSC è negativo (il contenuto delle provette è trasparente - “sangue laccato”).

Componenti, reazioni di fissazione del complemento:

Antigene: solitamente lisato, estratto, aptene,

meno spesso una sospensione di microrganismi.

2. Anticorpo: siero del paziente.

3. Complemento: siero di cavia.

Antigene: globuli rossi di pecora.

5. Anticorpo: emolisina contro eritrociti di pecora.

6. Soluzione isotonica.

A causa del fatto che nella RSC sono coinvolti un gran numero di componenti complessi,

devono prima essere titolati e fatti reagire in quantità esatte e in volumi uguali: 0,5 o 0,25, meno spesso 0,2, 1,25 o 1,0 ml (volumi maggiori danno un risultato più accurato). La titolazione dei componenti della reazione viene effettuata nello stesso volume dell'esperimento, sostituendo gli ingredienti mancanti con una soluzione isotonica.

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Si basa sul fatto che i globuli rossi, sui quali sono precedentemente adsorbiti gli antigeni, acquisiscono la capacità di agglutinarsi in presenza di sieri omologhi (anticorpi).

In questo caso, i globuli rossi agiscono come trasportatori di determinanti specifici, la cui agglutinazione avviene a seguito della reazione antigene + anticorpo.

I globuli rossi alla cui superficie sono saldamente attaccati gli antigeni sono chiamati antigene eritrocitario diagnostico o eritrociti sensibilizzati con l'antigene.

Un altro tipo di RNGA: gli anticorpi vengono adsorbiti sulla superficie degli eritrociti e la loro successiva agglutinazione avviene in presenza di un antigene omologo.

In questo caso, tali eritrociti sono chiamati eritrociti anticorpo diagnostico o eritrociti sensibilizzati dagli anticorpi.

Sulla base di questi due approcci metodologici fondamentali, sono state sviluppate e utilizzate molte modifiche dell'RNGA. Pertanto, come trasportatori vengono utilizzate piccole particelle di lattice standard.

Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione (HAI)

In questo caso, la reazione è chiamata reazione di agglutinazione al lattice (RLA) o viene utilizzato Staphylococcus aureus - reazione di coagglutinazione, ecc. Di solito, la diagnostica degli eritrociti viene preparata presso le imprese dell'industria biologica e l'esperienza principale di RNGA viene effettuata nei laboratori diagnostici.

La preparazione dei diagnostici eritrocitari comprende i seguenti passaggi:

• fissazione dei globuli rossi con formaldeide o aldeidi glutariche o acriliche.

  Tali globuli rossi trattati vengono conservati per lungo tempo. Più spesso, a questo scopo vengono utilizzati eritrociti di pecore, esseri umani, polli, ecc.;

• trattamento degli eritrociti fissati con soluzione di tannino. Di conseguenza, i globuli rossi acquisiscono la capacità di adsorbire in modo irreversibile le proteine ​​(virus e anticorpi) sulla loro superficie;
• sensibilizzazione degli eritrociti tanizzati da parte di virus o anticorpi.

Va notato che i metodi per preparare la diagnostica degli eritrociti per le infezioni virali sono diversi.

La procedura per eseguire l'RNGA per rilevare e determinare il titolo anticorpale è la seguente:

• dosi uguali di eritrociti sensibilizzati con l'antigene vengono aggiunte a successive diluizioni doppie di siero;
• la miscela viene lasciata per 2-3 ore a temperatura ambiente oppure per 16-18 ore a 4°C;
• tenere conto dei risultati.

  Se il siero contiene anticorpi contro il virus con cui sono stati sensibilizzati i globuli rossi, si osserva emoagglutinazione, che viene valutata negli incroci.

Si considera che il titolo anticorpale nel siero sia la diluizione del siero più alta che fornisce ancora emoagglutinazione di almeno due croci.

RNGA è accompagnato da tutti i controlli rilevanti. Di solito la reazione viene effettuata utilizzando il micrometodo.

RNGA consente di risolvere i seguenti problemi diagnostici:

• rilevare gli anticorpi e determinarne il titolo nel siero sanguigno utilizzando un noto diagnostico dell'antigene eritrocitario;
• rilevare e identificare un virus sconosciuto utilizzando una diagnostica anticorpale eritrocitaria nota.

Vantaggi dell'RNGA: elevata sensibilità, semplicità della tecnica di posizionamento e velocità di risposta.

Tuttavia, è importante notare che sorgono grandi difficoltà nella preparazione della diagnostica eritrocitaria stabile (grande dipendenza dalla purezza dei componenti utilizzati, necessità di selezionare una modalità di fissazione, tanizzazione e sensibilizzazione degli eritrociti per ciascun tipo di virus).

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Utilizza globuli rossi o materiali sintetici neutri (ad esempio particelle di lattice), sulla cui superficie vengono assorbiti antigeni (batterici, virali, tissutali) o anticorpi.

La loro agglutinazione avviene quando vengono aggiunti sieri o antigeni appropriati. I globuli rossi sensibilizzati con antigeni sono chiamati diagnostici eritrocitari antigenici e vengono utilizzati per rilevare e titolare gli anticorpi. Eritrociti sensibilizzati con anticorpi. sono chiamati immunoglobuline eritrocitarie diagnostiche e vengono utilizzate per identificare gli antigeni.

La reazione di emoagglutinazione passiva viene utilizzata per diagnosticare malattie causate da batteri (febbre tifoide e paratifoide, dissenteria, brucellosi, peste, colera, ecc.), protozoi (malaria) e virus (influenza, infezioni adenovirus, epatite virale B, morbillo, zecca). encefalite trasmessa, febbre emorragica di Crimea, ecc.), nonché per determinare alcuni ormoni, per identificare l'ipersensibilità del paziente a farmaci e ormoni, come la penicillina e l'insulina.

Reazione di emoagglutinazione passiva (RPHA).

Il test di emoagglutinazione passiva è un metodo sensibile di diagnosi sierologica e viene utilizzato sia per la diagnosi precoce che retrospettiva, nonché per determinare lo stato immunopogico delle persone vaccinate. Nei pazienti con tularemia, gli anticorpi vengono solitamente rilevati alla fine della 1a o 2a settimana della malattia dopo 1-1,5 mesi, i titoli RPHA raggiungono i livelli massimi (1: 100.000-1: 20.000, meno spesso più alti), dopo di che si verificano; diminuzione al livello 1:100-1:200 vengono conservati per lungo tempo.

Nelle persone vaccinate gli anticorpi vengono rilevati costantemente anche in titoli più bassi, non superiori a 1:2000-1:5000 1-1,5 mesi dopo la vaccinazione, e rimangono per diversi anni a un livello basso di 1:20-1:80.

L'antigene per la stadiazione dell'RPHA è la tularemia eritrocitaria diagnostica (antigenica).

Il farmaco è costituito da globuli rossi di pecora formalinizzati, sensibilizzati con l'antigene della tularemia, disponibile in forma liquida e secca. Preparazione liquida: sospensione al 10% di globuli rossi in una soluzione di formaldeide con una concentrazione del 10%. La preparazione liofilizzata secca è una sospensione di globuli rossi al 10% essiccata sotto vuoto senza conservanti. Prima dell'uso va diluito secondo le indicazioni riportate in etichetta. Per eseguire la reazione in lastre di polistirene, entrambi i farmaci vengono utilizzati alla concentrazione del 2,5% e quando si esegue la reazione in microvolumi - alla concentrazione dello 0,5%.

Tecnica per impostare RPGA.

I sieri da testare vengono diluiti con soluzione fisiologica 1:5 (1:10) e riscaldati a 56°C per 30 minuti.

Reazione di emoagglutinazione (HRA) e

Successivamente, per rimuovere gli anticorpi eterogenei diretti agli eritrociti di pecora, i sieri vengono trattati con una sospensione al 50% di eritrociti di pecora formalinizzati. Per fare ciò, aggiungere globuli rossi in ragione di 2 gocce (0,05 ml) per 1 ml di siero e mescolare accuratamente agitando.

Il siero viene lasciato fino alla completa sedimentazione degli eritrociti, oppure viene centrifugato dopo un'ora a temperatura ambiente, dopodiché è pronto per l'esame.

Il liquido di diluizione viene versato in un volume di 0,5 ml in una fila di pozzetti su una piastra di polistirolo.

Durante lo studio preliminare dei sieri, è consigliabile testarli predisponendo la reazione in una fila corta della piastra (6 pozzetti). Se gli anticorpi vengono rilevati in una serie breve, i sieri vengono nuovamente analizzati in una lunga serie di diluizioni (12 pozzetti).

Dopo aver versato il liquido di diluizione, aggiungere 0,5 ml di sieri da testare in una diluizione 1:5 nel primo pozzetto di ciascuna fila (corta o lunga). Successivamente gli stessi volumi di siero vengono titolati con diluizioni doppie. Pertanto, si ottengono diluizioni del siero nella serie breve da 1:10 a 1:320, e nella serie lunga da 1:10 a 1:20480. Dopo la titolazione dei sieri, viene aggiunta a ciascun pozzetto una goccia (0,05 ml) di una sospensione operativa al 2,5% di eritrociti sensibilizzati.

Il contenuto delle piastre viene agitato accuratamente fino ad ottenere una sospensione omogenea. Le piastre vengono lasciate a temperatura ambiente su una superficie fissa del tavolo. La registrazione preliminare della reazione viene effettuata dopo 2-3 ore, la determinazione finale del titolo viene effettuata dopo la completa sedimentazione dei globuli rossi nei pozzetti. Per la reazione vengono forniti i seguenti controlli: 1) siero in esame diluito 1:10 in un volume di 0,5 ml + 1 goccia di sospensione al 2,5% di eritrociti non sensibilizzati; 2) liquido di diluizione in un volume di 0,5 ml + 1 goccia di sospensione al 2,5% di eritrociti non sensibilizzati; 3) liquido di diluizione in un volume di 0,5 ml + 1 goccia di sospensione al 2,5% di eritrociti sensibilizzati.

Tutti i controlli dovrebbero dare una reazione chiaramente negativa.

Contabilità e valutazione di RPGA. La reazione viene valutata secondo il seguente schema:

1) una reazione nettamente positiva (++++) - i globuli rossi cadono sul fondo del foro in uno strato uniforme sotto forma di un "ombrello", che spesso presenta uno scioglimento smerlato dei bordi;

2) reazione positiva (+++) - i globuli rossi coprono almeno 2/3 del fondo del pozzetto;

3) reazione debolmente positiva (++) - l'agglutinato è piccolo e si trova proprio al centro del pozzetto;

4) reazione discutibile (+) - attorno al sedimento degli eritrociti al centro del pozzetto si trovano singoli granelli di agglutinato;

5) negativo (-) - sul fondo del foro, i globuli rossi si depositano sotto forma di un "bottone" o di un piccolo anello con bordi lisci e ben definiti.

Il titolo del siero viene preso in considerazione in base all'ultima diluizione del siero, che ha dato una reazione molto chiara (almeno tre più).

Una diluizione pari o superiore a 1:100 è considerata titolo diagnostico ma, come nel caso dell'artrite reumatoide, è necessario monitorarne l'aumento;

L'RPHA per la tularemia è abbastanza specifico e rileva alcune reazioni crociate solo con i sieri di brucellosi. La diagnosi differenziale è possibile in base all'altezza dei titoli nell'RPGA, che sono significativamente più alti con l'antigene omologo.

Tecnica per allestire RPHA in microvolumi.

L'RPGA può essere eseguita in microvolumi utilizzando un microtitolatore di tipo Takachi (o micropiastre a fondo tondo con micropipette), che consente la titolazione del materiale in volumi di 25 μl e 50 μl. La tecnica di reazione e la sequenza di tutte le operazioni sono le stesse di quando si studia su lastre di polistirene. Va tenuto presente, tuttavia, che la sensibilità del micrometodo è solitamente una diluizione (cioè

2 volte) inferiore al macrometodo.

Per impostare la reazione in un microtitolatore, un liquido di diluizione in un volume di 50 μl viene aggiunto a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta contagocce. Successivamente, utilizzando titolatori con testa da 50 μl, si raccoglie il siero in esame immergendovi la testa.

Assicurarsi che il liquido abbia riempito la testa del titolatore. Il titolatore con siero viene trasferito nel primo pozzetto e, mantenendolo in posizione verticale, vengono effettuati diversi movimenti rotatori in entrambe le direzioni. Quindi il titolatore viene trasferito nel pozzetto successivo e la manipolazione viene ripetuta. La titolazione può essere eseguita simultaneamente su più file. Dopo aver titolato l'intera serie, il titolatore viene lavato con acqua distillata (cambiando 2 porzioni) mediante movimenti rotatori, l'acqua viene rimossa dalla testa mediante un tampone e bruciata sulla fiamma di un bruciatore.

Dopo la titolazione, aggiungere ai pozzetti 25 μl di liquido diagnostico eritrocitario.

La concentrazione del diagnosticum per RPHA in microvolumi deve essere dello 0,5% (vale a dire, una sospensione di globuli rossi al 2,5% viene ulteriormente diluita 5 volte). Dopo aver aggiunto i globuli rossi, le piastre devono essere agitate leggermente fino ad ottenere una sospensione omogenea. I risultati possono essere registrati entro 1-1,5 ore, il che rappresenta un vantaggio significativo dell'RPGA in una microtitolazione.

Inoltre, questa tecnica richiede piccole quantità di tutti gli ingredienti di reazione e dei sieri da testare.

La reazione viene presa in considerazione secondo il seguente schema:

1) “+” – emoagglutinazione completa, in cui i globuli rossi cadono sul fondo del pozzetto in uno strato uniforme a forma di “ombrello”, occupando almeno 2/3 del fondo;

2) “+-“ - emoagglutinazione parziale, in cui i globuli rossi cadono sul fondo sotto forma di un anello sciolto di piccole dimensioni;

3) “-“ – assenza di emoagglutinazione, quando i globuli rossi cadono sul fondo sotto forma di un piccolo bottone o anello con il bordo liscio.

La specificità di un risultato positivo ottenuto in RPHA può essere testata utilizzando una reazione a tre componenti: la reazione passiva di inibizione dell'emoagglutinazione (PHA).

Tecnica per impostare RTPGA.

Questa reazione viene utilizzata per confermare la specificità di un risultato RPGA positivo quando è in dubbio o è di particolare interesse epidemiologico. Il meccanismo di reazione consiste nell'inibizione specifica dell'emoagglutinazione quando una sospensione di batteri della tularemia uccisi viene aggiunta al siero in esame. Tre componenti interagiscono nella reazione: il siero del test, l'antigene specifico della tularemia e l'antigene diagnostico eritrocitario RTPHA viene solitamente posizionato in una fila di 7-8 pozzetti.

Si consiglia di installare un RPGA ripetuto in parallelo all'RTPGA. 0,25 ml di liquido di diluizione vengono versati in due file di pozzetti, quindi il siero in esame in un volume di 0,25 ml viene aggiunto ai primi pozzetti di entrambe le file e si ottengono due file identiche di diluizioni di siero. Aggiungere 0,25 ml di liquido di diluizione a tutti i pozzetti della seconda fila e 0,25 ml di una sospensione di batteri della tularemia ai pozzetti della prima fila.

Utilizzare tularemia diagnosticum (contenente 25 miliardi di batteri di tularemia in 1 ml), precedentemente diluito 50 volte.

Questa sospensione contiene 500 milioni di batteri in 1 ml o 125 milioni in un volume di 0,25 ml. Dopo l'aggiunta dell'antigene, la piastra viene lasciata per 1 ora a temperatura ambiente, dopodiché viene aggiunta una goccia (0,05 ml) di eritrociti diagnosticum a tutti i pozzetti di entrambe le file, la piastra viene agitata e lasciata su una superficie piana del tavolo.

La contabilità viene effettuata dopo 2-3 ore.

Contabilità e valutazione di RTPGA. Se il siero in esame contiene anticorpi specifici contro la tularemia, questi verranno neutralizzati dall'antigene aggiunto e non si verificherà emoagglutinazione nella prima fila di pozzetti oppure, con un titolo sierico elevato, si osserverà emoagglutinazione in un numero minore (2-4) di pozzetti. pozzi che nella fila con RPHA. In questo caso, la specificità dei risultati è stata confermata.

Se si nota emoagglutinazione in entrambe le file, ad es. Se i risultati di RTPGA e RPGA coincidono, ciò indica l'assenza di anticorpi contro la tularemia nel siero del test. In questo caso, il risultato primario dell'RPGA è considerato non specifico.

Tecnica per la stadiazione dell'RTHG in microvolumi. L'RTPGA, come l'RPGA, può essere eseguito in microvolumi utilizzando un microtitolo di tipo Takachi.

A tale scopo, aggiungere 0,25 μl di liquido diluente nei pozzetti delle micropiastre in due file da 7-8 pozzetti ciascuna. Quindi, utilizzando un titolatore, vengono aggiunti 0,25 μl del siero in esame e titolati in entrambe le file. Successivamente, 25 μl di antigene della tularemia (la cui concentrazione è di 500 milioni di batteri di tularemia in 1 ml) vengono aggiunti a ciascun pozzetto della prima fila e 25 μl di liquido di diluizione vengono aggiunti alla seconda fila.

Le piastre vengono lasciate per 1 ora a temperatura ambiente, dopodiché vengono aggiunti 25 μl di antigene zritrocytic diagnosticum (concentrazione 0,5%) a tutti i pozzetti di entrambe le file.

La contabilità e la valutazione dei risultati vengono eseguite in modo simile alle reazioni nei macrovolumi.

Data di pubblicazione: 2015-02-03; Leggi: 3176 | Violazione del copyright della pagina

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