Componenti e meccanismo delle reazioni immunologiche. Reazioni sierologiche

Nel XVIII secolo Molte persone, essendo sicure che un giorno nella loro vita sarebbero state comunque infettate dal vaiolo, si sono esposte deliberatamente alla possibilità di infezione per riprendersi da questa malattia in condizioni più favorevoli e non averne paura in futuro. Ancora oggi alcuni genitori, per gli stessi motivi, non proteggono i propri figli dal contrarre malattie infantili, sapendo che le persone si ammalano di alcune malattie solo una volta nella vita. Questo tipo di resistenza è chiamata immunità acquisita. Ma un uomo che è immune al vaiolo perché ha sofferto di quella malattia è altrettanto suscettibile al morbillo, o a qualsiasi altra malattia, quanto uno che non ha mai avuto il vaiolo; quindi diciamo che l'immunità è specifica.

L'immunità acquisita attivamente è causata dalla formazione nel corpo di proteine ​​specifiche, i cosiddetti anticorpi, che vengono rilasciati nel sangue e nei fluidi tissutali dopo la penetrazione di qualsiasi proteina estranea, chiamata antigene, nel corpo. L'antigene e l'anticorpo reagiscono tra loro e questo protegge il corpo dai danni. Se, ad esempio, si inietta in un coniglio l'albumina dell'uovo (una sostanza proteica), le cellule dell'animale rispondono producendo anticorpi specifici contro questa albumina. Inoltre, l’organismo è in grado di produrre un tipo speciale di anticorpo, chiamato antitossina, in risposta alla presenza di una tossina (solitamente una proteina) secreta dal batterio. Una volta che si è formata una quantità sufficiente di antitossina, la tossina non può più causare danni al corpo.

Diversi decenni fa si sapeva che gli anticorpi formati in risposta all'introduzione di un determinato antigene non sono sempre omogenei: possono differire nella loro specificità, nel grado di attività in relazione alla reazione con l'antigene e nelle proprietà fisico-chimiche (dimensione e forma della molecola, sua carica totale e sequenza aminoacidica).

Gli anticorpi circolanti nel sangue sono associati ad una certa frazione di plasma - gamma globuline. Le gammaglobuline sono proteine ​​molto simili nelle loro proprietà fisiche e chimiche, ma differiscono nella loro specificità per gli antigeni. Le differenze tra i diversi anticorpi sono piuttosto sottili; sono ancora più sottili delle differenze tra i diversi enzimi. Apparentemente solo una piccola parte della molecola proteica (avente un peso molecolare di circa 160.000) è immunologicamente attiva. Differenze tra diversi

gli anticorpi, a quanto pare, si riducono a piccole differenze nella forma della molecola bedka, nella disposizione dei suoi atomi costituenti, garantendo la complementarità delle configurazioni geometriche dell'antigene e dell'anticorpo, che devono combaciare come una chiave e una serratura.

I tessuti linfatici solitamente sintetizzano anticorpi solo contro proteine ​​“estranee”, cioè verso proteine ​​che non si trovano nell’organismo in condizioni normali. Ma a volte alcuni componenti normali del corpo possono essere antigenici e causare tumori.

la formazione di anticorpi; Come risultato della risultante reazione antigene-anticorpo, una persona può ammalarsi.

Dopo l'iniezione dell'antigene inizia un periodo di latenza, che dura circa una settimana, e poi nel sangue compaiono gli anticorpi. Il titolo anticorpale aumenta lentamente, raggiunge un picco basso (reazione primaria) e diminuisce nuovamente. Un'iniezione secondaria di antigene alcuni giorni, settimane o addirittura mesi dopo provoca una rapida produzione di anticorpi dopo un periodo di latenza più breve (reazione secondaria). Il titolo anticorpale raggiunge un livello più elevato e diminuisce più lentamente. Le successive iniezioni di antigene causano ulteriori reazioni secondarie fino al raggiungimento del titolo massimo. Nel tempo, questo titolo solitamente diminuisce e l’immunizzazione periodica aiuta a mantenere l’immunità a un livello soddisfacente. In una persona precedentemente immunizzata, una reazione secondaria può essere provocata anche infettandola con un agente infettivo naturale; Gli anticorpi di solito si formano abbastanza rapidamente e prevengono la comparsa dei sintomi della malattia.

Il meccanismo di formazione di anticorpi specifici sotto l'influenza di un antigene è sconosciuto. È noto soltanto che gli anticorpi vengono sintetizzati nuovamente a partire da aminoacidi e non si formano semplicemente modificando la conformazione spaziale di una catena polipeptidica preesistente. La sintesi di queste proteine ​​specifiche avviene probabilmente allo stesso modo della normale sintesi delle proteine ​​nei ribosomi cellulari, cioè sotto il controllo di matrici di acido ribonucleico (vedi sezione 342). L'antigene sembra entrare nei plasmaciti e in altre cellule “immunologicamente competenti” e provoca la formazione di una specifica matrice di acido nucleico, che a sua volta determina la formazione di uno specifico anticorpo. È possibile che l'informazione necessaria per la sintesi di anticorpi specifici sia fornita dall'antigene stesso, oppure che sia costantemente presente nella cellula, essendo contenuta nei geni, ma possa essere utilizzata solo in presenza di un antigene specifico. È stato anche suggerito che la penetrazione di un antigene in una cellula porta alla manifestazione di una capacità geneticamente determinata di sintetizzare un anticorpo specifico, che precedentemente era in uno stato latente. Quest'ultima teoria fornisce la migliore spiegazione dei fatti sperimentali attualmente conosciuti ed è più coerente con la teoria generale della regolazione della sintesi proteica. Quando le plasmacellule che producono uno specifico anticorpo si dividono, entrambe le cellule figlie mantengono la capacità di produrre gli stessi anticorpi e questa informazione viene trasmessa a molte generazioni di cellule.

Gli anticorpi reagiscono con l'antigene in uno o più modi diversi. Possono combinarsi con la tossina, neutralizzandone le proprietà tossiche; possono dissolvere le cellule batteriche; infine, possono sensibilizzare i batteri, rendendoli più vulnerabili ai leucociti. Alcuni anticorpi agglutinano i microbi, impedendone così la diffusione e garantendo in modo ancora più accurato la loro ritenzione nei linfonodi.

Gli anticorpi vengono marcati attaccando un colorante fluorescente, dopo di che possono essere rilevati in aree specifiche del tessuto utilizzando un microscopio. Questo metodo, sviluppato nel 1941 da Koons, ha permesso di effettuare numerosi studi per determinare la localizzazione nella cellula di reazioni specifiche tra antigene e anticorpo; viene utilizzato anche nella diagnosi delle malattie infettive.

Un altro modo per acquisire l’immunità è attraverso la vaccinazione. Un vaccino è un antigene prodotto appositamente in grandi quantità specifico per una particolare malattia, abbastanza forte da stimolare la formazione di anticorpi nell'organismo, ma non così forte da causare la malattia stessa. La tossicità dell'antigene viene ridotta in vari modi. Alcuni vaccini contengono solo piccole quantità di tossina. Altri sono una combinazione di una tossina con un'antitossina: while

l'antigene induce l'organismo a produrre più anticorpi, gli anticorpi del vaccino stesso proteggono le cellule dai danni. Alcune tossine sono sottoposte a trattamenti termici o chimici, che ne distruggono le proprietà nocive, ma mantengono la loro capacità di stimolare la formazione di anticorpi; Questo tipo di vaccino è chiamato tossoide. Un altro metodo consiste nell’indebolire le colture batteriche facendole crescere per lunghi periodi in provette, dove alla fine perdono parte della loro tossicità. Il vaccino contro la rabbia (vaccino contro la rabbia) viene indebolito dall'essiccazione, altri vaccini vengono indeboliti dall'inoculazione sequenziale di un numero di animali da laboratorio; Il vaccino contro il tifo può essere preparato da batteri tifo uccisi.

Il metodo di vaccinazione fu scoperto alla fine del XVIII secolo. Il medico inglese E. Jenner, il quale notò che i lavoratori che si occupavano di mucche malate di vaiolo bovino non si ammalavano mai di vero vaiolo. Quando tentò di strofinare un liquido prelevato dalle vescicole del vaiolo sulla mammella di una mucca su un graffio sulla pelle di una persona, si manifestò una lieve malattia con la comparsa di un vaiolo localizzato nel punto dello sfregamento. Le persone vaccinate in questo modo non hanno mai contratto il vaiolo. Il vaiolo bovino e il vaiolo sono causati da due virus diversi ma strettamente correlati; la vaccinazione con il virus del vaiolo bovino provoca la formazione di anticorpi che possono reagire anche con il virus del vaiolo umano, strettamente correlato. In teoria è possibile creare l’immunità contro tutte le malattie attraverso la vaccinazione, ma per molte malattie importanti, tra cui la tubercolosi, l’influenza e la sifilide, i metodi di vaccinazione non sono ancora stati sviluppati.

Accade spesso che il corpo non sia in grado di produrre anticorpi abbastanza velocemente per combattere gli antigeni microbici. In questi casi vengono iniettati anticorpi di un animale (di solito un cavallo) per fornirli all'organismo fino al momento in cui esso stesso può produrli in quantità sufficienti per la protezione. L'unico modo per ottenere l'immunità passiva è l'iniezione di un preparato anticorpale (chiamato siero); Sebbene questa immunità abbia un effetto immediato, scompare completamente dopo poche settimane.

Per preparare il siero, i batteri vengono coltivati ​​in provette fino a produrre grandi quantità di tossina. Poi

questa tossina viene iniettata in dosi crescenti nel cavallo, e il corpo dell'animale produce gradualmente enormi quantità di antitossina, che si accumula nel sangue. Successivamente, di tanto in tanto viene prelevato il sangue dal cavallo, vengono rimossi i globuli rossi e l'antitossina viene concentrata.

Immunità naturale. In tutti gli animali e le piante l'immunità verso alcune malattie è una proprietà ereditaria e non deve essere acquisita. Esistono prove che le diverse razze umane differiscono ereditariamente nella loro resistenza a malattie come la tubercolosi, la difterite e l'influenza. L’immunità ereditaria alle malattie, chiamata immunità naturale, viene trasmessa di generazione in generazione.

Un tipo di immunità naturale è l'immunità sviluppata in una popolazione che è stata in contatto con l'agente eziologico di una particolare malattia per molte generazioni. Molte malattie (ad esempio il morbillo) sono relativamente lievi al giorno d'oggi

Gli europei furono estremamente severi nei confronti degli indiani d'America e degli isolani del Pacifico meridionale quando si diffusero per la prima volta tra questi popoli. Inoltre, la sifilide è oggi una malattia molto più lieve rispetto a quando è apparsa per la prima volta in Europa, quando spesso portava alla morte nel primo mese. Molte malattie tropicali, come la malaria e la malattia del sonno, sono più gravi negli stranieri che nella popolazione locale. Altre malattie, inizialmente molto comuni, divennero col tempo rare: ad esempio, la lebbra era estremamente diffusa nei tempi biblici.

Questi cambiamenti in meglio sono solitamente interpretati come il risultato di una graduale “selezione naturale”: le persone che soffrivano di questa malattia nei tempi antichi hanno trasmesso la loro “resilienza” ai loro discendenti, e così via. È anche possibile che in alcuni casi siano stati i microrganismi stessi ad adattarsi, il che è stato accompagnato da una diminuzione della loro virulenza.

Un virus normale o un virus ucciso dal calore moderato o dalla luce ultravioletta può inibire la crescita di altri virus nell’ospite. Ciò potrebbe spiegare la bassa prevalenza di malattie come la poliomielite in aree in cui altri virus enterici sono endemici. La presenza di questi virus inibisce la crescita del virus della poliomielite; tuttavia, il loro effetto non è quello di provocare la formazione di anticorpi, ma di indurre le cellule ospiti a produrre una sostanza chiamata interferone. Questa sostanza è stata isolata; è una proteina con un peso molecolare di circa 63.000.

Questo fenomeno scoperto di recente può servire come un altro fattore importante nella protezione del corpo dalle malattie. Gli anticorpi sono particolarmente importanti nel creare l'immunità alla reinfezione con un dato agente patogeno; l'interferone svolge probabilmente un ruolo importante nella protezione durante la prima infezione dal virus.

I ricercatori hanno dimostrato che l'interferone viene prodotto in risposta a un'infezione virale; la sua concentrazione raggiunge il massimo nel 3o-5o giorno dopo l'infezione, mentre gli anticorpi contro l'agente infettivo compaiono molto più tardi, non prima dell'8o giorno.

L'interferone non agisce direttamente sul virus, ma sulla cellula ospite. Il virus entra nelle cellule trattate con interferone, ma non è in grado di moltiplicarsi in esse. Sembra che l'interferone riduca la quantità di ATP che può essere utilizzata per la propagazione del virus, possibilmente disaccoppiando i processi di fosforilazione e ossidazione (vedere sezione 57). Le prove disponibili suggeriscono che esiste un solo tipo di interferone e che è efficace contro un’ampia varietà di virus. Link correlati

46. ​​​​Utilizzo pratico delle reazioni sierologiche.

Le reazioni immunitarie vengono utilizzate negli studi diagnostici e immunologici su persone malate e sane. A questo scopo vengono utilizzati metodi sierologici, ovvero metodi per studiare anticorpi e antigeni utilizzando reazioni antigene-anticorpo determinate nel siero del sangue e in altri fluidi, nonché nei tessuti corporei.

La rilevazione di anticorpi contro antigeni patogeni nel siero del paziente consente di formulare la diagnosi della malattia. Gli studi sierologici vengono anche utilizzati per identificare antigeni microbici, varie sostanze biologicamente attive, gruppi sanguigni, antigeni tissutali e tumorali, complessi immunitari, recettori cellulari, ecc.

Quando si isola un microbo da un paziente, l'agente patogeno viene identificato studiando le sue proprietà antigeniche utilizzando sieri immunodiagnostici, cioè sieri di sangue di animali iperimmunizzati contenenti anticorpi specifici. Questa è la cosiddetta identificazione sierologica dei microrganismi.

In microbiologia e immunologia, sono ampiamente utilizzate agglutinazione, precipitazione, reazioni di neutralizzazione, reazioni che coinvolgono il complemento, utilizzando anticorpi e antigeni marcati (radioimmunologici, test immunoenzimatici, metodi immunofluorescenti).

Le reazioni elencate differiscono nell'effetto registrato e nella tecnica di produzione, tuttavia si basano tutte sulla reazione di interazione di un antigene con un anticorpo e vengono utilizzate per rilevare sia anticorpi che antigeni. Le reazioni immunitarie sono caratterizzate da elevata sensibilità e specificità.

Le caratteristiche dell'interazione degli anticorpi con gli antigeni sono la base delle reazioni diagnostiche nei laboratori. La reazione in vitro tra antigene e anticorpo consiste in una fase specifica e una non specifica. Nella fase specifica si verifica un rapido legame specifico del centro attivo dell'anticorpo con il determinante dell'antigene. Poi arriva una fase non specifica, più lenta, che si manifesta con fenomeni fisici visibili, ad esempio la formazione di scaglie (fenomeno di agglutinazione) o precipitati sotto forma di torbidità. Questa fase richiede la presenza di determinate condizioni (elettroliti, pH ottimale dell'ambiente).

Il legame del determinante dell'antigene (epitopo) al centro attivo del frammento Fab degli anticorpi è dovuto alle forze di van der Waals, ai legami idrogeno e all'interazione idrofobica. La forza e la quantità di antigene legato dagli anticorpi dipendono dall'affinità, dall'avidità degli anticorpi e dalla loro valenza.

47. Reazioni immunologiche nella diagnosi di malattie infettive e non infettive.

Le reazioni immunologiche (IR) sono ampiamente utilizzate nella diagnosi di laboratorio delle infezioni. Sono utilizzati:

1) per rilevare gli anticorpi nel siero del sangue, ad es. nella diagnosi sierologica delle malattie infettive;

2) determinare il tipo o il sierotipo di un microrganismo, ad es. la sua identificazione antigenica.

L'IR rivela la formazione del complesso AG-AT. In questo caso la componente sconosciuta viene determinata a partire da quella nota. Gli IR si distinguono per l'elevata sensibilità (legame di AT con AG in quantità trascurabilmente piccole) e specificità (determinata dalle caratteristiche strutturali del centro attivo dei determinanti AT e AG). Sono caratterizzati da fasi di sviluppo. Il primo stadio è specifico, invisibile all'occhio, ed è caratterizzato dalla connessione del gruppo determinante di AG con il centro attivo di AT. Di conseguenza, si forma un complesso AGATA, che ha perso la sua solubilità in soluzioni isotoniche. Il secondo stadio è aspecifico, visibile all'occhio, e la natura della manifestazione dipende dallo stato di AG, AT e dalle condizioni ambientali in cui avviene l'interazione di AG e AT.

Quando gli anticorpi interagiscono con gli antigeni corpuscolari (batteri, cellule animali, altre cellule), si verificano cambiamenti visibili ad occhio nudo (ad esempio scaglie di agglutinazione, lisi cellulare). Se gli AG solubili (finemente dispersi) vengono combinati con AT, la formazione di complessi viene rilevata come risultato dell'adsorbimento preliminare di AG (AT) su sostanze corpuscolari (eritrociti, particelle di carbone, ecc.)

La velocità della reazione dipende da:

Rapporto ottimale tra AG e AT;

Gradi di specificità di AG e AT; - pH dell'ambiente (7,2-7,4);

Concentrazioni di elettroliti (0,85% cloruro di sodio).

A seconda dello stato di AG, AT e delle caratteristiche dell'ambiente in cui AG e AT interagiscono, si distinguono reazioni di agglutinazione, precipitazione, lisi, complemento, neutralizzazione, ecc.

Gli IR sono divisi in semplici (due componenti, sono coinvolti solo AG e AT) e complessi (tre componenti e multicomponenti, sono coinvolti AG, AT e il sistema reagente: eritrociti sensibilizzati, coltura cellulare, pelle di un animale sensibile, ecc. ).

Attualmente, gli IR in cui sono coinvolti Ag e Ab marcati (metodi di immunofluorescenza, radioimmune e immunoenzimatica) sono ampiamente utilizzati.

48. Reazione di agglutinazione. Componenti, meccanismo, metodi di installazione. Applicazione.

Una reazione di agglutinazione è una reazione semplice in cui gli anticorpi legano antigeni corpuscolari (batteri, eritrociti o altre cellule, particelle insolubili con antigeni adsorbiti su di essi, nonché aggregati macromolecolari). Si verifica in presenza di elettroliti, ad esempio, quando viene aggiunta una soluzione isotonica di cloruro di sodio.

Vengono utilizzate varie varianti della reazione di agglutinazione: estesa, indicativa, indiretta, ecc. La reazione di agglutinazione si manifesta con la formazione di scaglie o sedimenti (cellule “incollate” con anticorpi aventi due o più centri di legame con l'antigene - Fig. 13.1). RA è utilizzato per:

1) determinazione degli anticorpi nel siero del sangue di pazienti, ad esempio, con brucellosi (reazione di Wright, Heddelson), febbre tifoide e febbre paratifo (reazione di Vidal) e altre malattie infettive;

2) determinazione del patogeno isolato dal paziente;

3) determinazione dei gruppi sanguigni mediante anticorpi monoclonali contro alloantigeni eritrocitari.

Per determinare gli anticorpi del paziente, viene eseguita una reazione di agglutinazione dettagliata: un diagnosticum (sospensione dei microbi uccisi) viene aggiunto alle diluizioni del siero del sangue del paziente e, dopo diverse ore di incubazione a 37 °C, la diluizione del siero più alta (titolo del siero) si nota il momento in cui si è verificata l'agglutinazione, cioè si è formato un precipitato.

La natura e la velocità dell'agglutinazione dipendono dal tipo di antigene e di anticorpi. Un esempio sono le peculiarità dell'interazione dei diagnostici (antigeni O e H) con anticorpi specifici. La reazione di agglutinazione con O-diagnosticum (batteri uccisi dal calore, che conservano l'antigene O termostabile) avviene sotto forma di agglutinazione a grana fine. La reazione di agglutinazione con H-diagnosticum (batteri uccisi dalla formaldeide, che conservano l'antigene H flagellare termolabile) è grossolana e procede più velocemente.

Se è necessario determinare l'agente patogeno isolato dal paziente, viene eseguito un test di agglutinazione approssimativo utilizzando anticorpi diagnostici (siero agglutinante), ovvero viene eseguita la sierotipizzazione dell'agente patogeno. Una reazione indicativa viene effettuata su un vetrino. Una coltura pura dell'agente patogeno isolato dal paziente viene aggiunta ad una goccia di siero agglutinante diagnostico ad una diluizione di 1:10 o 1:20. Accanto viene posto un controllo: al posto del siero viene applicata una goccia di soluzione di cloruro di sodio. Quando in una goccia con siero e microbi appare un sedimento flocculante, in provette viene eseguita una reazione di agglutinazione dettagliata con diluizioni crescenti del siero agglutinante, a cui vengono aggiunte 2-3 gocce di una sospensione dell'agente patogeno. L'agglutinazione viene presa in considerazione dalla quantità di sedimento e dal grado di limpidezza del liquido. La reazione è considerata positiva se si osserva agglutinazione in una diluizione vicina al titolo del siero diagnostico. Allo stesso tempo, vengono presi in considerazione i controlli: il siero diluito con una soluzione isotonica di cloruro di sodio deve essere trasparente, la sospensione dei microbi nella stessa soluzione deve essere uniformemente torbida, senza sedimenti.

Diversi batteri correlati possono essere agglutinati dallo stesso siero agglutinante diagnostico, il che rende difficile la loro identificazione. Pertanto, utilizzano sieri agglutinanti adsorbiti, dai quali gli anticorpi che reagiscono in modo crociato sono stati rimossi mediante adsorbimento da parte dei batteri correlati. Tali sieri trattengono anticorpi specifici solo per un dato batterio.

49. Reazione di Coombs- test dell'antiglobulina per determinare gli anticorpi anti-eritrociti incompleti. Il test di Coombs viene utilizzato per rilevare gli anticorpi contro il fattore Rh nelle donne in gravidanza e per determinare l'anemia emolitica nei neonati con incompatibilità Rh, che porta alla distruzione dei globuli rossi.

L'essenza di questo metodo è che il siero antiglobulina contenente anticorpi contro le immunoglobuline umane, quando reagisce con globuli rossi sensibilizzati con anticorpi incompleti, porta alla loro agglutinazione.

A seconda che gli anticorpi siano fissati sulla superficie dei globuli rossi o si trovino allo stato libero nel plasma sanguigno, viene utilizzato un test di Coombs diretto o indiretto.

Un test di Coombs diretto viene eseguito nei casi in cui vi è motivo di supporre che i globuli rossi in esame siano già stati sensibilizzati in vivo dagli anticorpi corrispondenti, ad es. la prima fase della reazione - la fissazione degli anticorpi sulla superficie dei globuli rossi - avviene nell'organismo e la successiva aggiunta di siero antiglobulina provoca l'agglutinazione delle cellule sensibilizzate.

Utilizzando il test indiretto di Coombs vengono rilevati gli anticorpi incompleti presenti nel siero in esame. In questo caso, la reazione avviene in due fasi. La prima fase è l'incubazione degli eritrociti in esame con il siero in esame, durante la quale gli anticorpi contenuti nel campione di siero in esame vengono fissati sulla superficie degli eritrociti. La seconda fase è l'aggiunta del siero antiglobulina.

Reazione diretta di Coombs(test antiglobulina diretto)

Materiale per la ricerca: sangue dalla vena ulnare.

Adulti – 3 ml di sangue;

Bambini – 1-2 ml di sangue.

Normalmente la reazione di Coombs è negativa.

Metodo di ricerca: filtrazione su gel

Il test diretto di Coombs viene utilizzato per rilevare anticorpi o componenti del complemento fissati sulla superficie dei globuli rossi. Se gli anticorpi o i componenti del complemento vengono fissati sulla superficie dei globuli rossi, l'aggiunta di antiglobulina o di siero anti-complemento provoca l'agglutinazione dei globuli rossi.

Un test di Coombs diretto positivo implica che in vivo i globuli rossi sono rivestiti con immunoglobuline o complemento. I reagenti polispecifici e anti-IgG possono rilevare circa 500 molecole di IgG su un globulo rosso, ma è stato dimostrato che nell'anemia emolitica autoimmune i globuli rossi sono rivestiti con un minor numero di immunoglobuline.

Positivo quando:

emolisi autoimmune;

malattia emolitica dei neonati;

anemia emolitica immunitaria indotta da farmaci;

Reazioni trasfusionali emolitiche.

La reazione di Coombs è indiretta

Il materiale per lo studio è il sangue della vena ulnare. Il siero deve essere rapidamente separato dal sangue.

Adulti – 3 ml di sangue;

Bambini – 1-2 ml di sangue.

Normale: negativo.

Metodo: filtrazione su gel

Il test indiretto di Coombs rileva gli anticorpi contro i globuli rossi nel siero. Dimostra la presenza nel plasma del paziente di anticorpi inattesi contro eritrociti ABO e Rh compatibili. L'agglutinazione mostra che il siero contiene anticorpi contro gli antigeni presenti sulla superficie dei globuli rossi reagenti.

Reazione indiretta utilizzato nei seguenti casi:

determinare la compatibilità individuale del sangue del donatore e del ricevente;

per rilevare gli alloanticorpi, compresi gli anticorpi che causano reazioni trasfusionali emolitiche;

per la determinazione degli antigeni eritrocitari di superficie nella genetica medica e nella medicina legale;

per confermare l'identità dei gemelli durante il trapianto di midollo osseo.

Positivo per:

presenza di alloanticorpi;

presenza di autoanticorpi.

REAZIONI IMMUNOBIOLOGICHE, si basano sull'interazione di un antigene e un anticorpo presenti nel siero immunitario (secondo le idee di Ehrlich) o di un antigene e un siero modificati appositamente sotto l'influenza dell'irritazione immunizzante (secondo le opinioni più recenti). Le reazioni più importanti sono l'agglutinazione, la precipitazione, la batteriolisi, la reazione di rigetto del complemento e una reazione basata sull'azione delle opsonine. L'aglutinazione e la precipitazione si verificano quando un antigene e il suo corrispondente anticorpo si incontrano; Per effettuare la batteriolisi, la reazione di rigetto del complemento, ecc., oltre all'antigene e all'anticorpo, è necessaria anche la partecipazione del complemento. Il significato di I. reazioni è duplice. Con il loro aiuto è possibile diagnosticare una particolare malattia infettiva mettendo in contatto il siero del paziente con un microbo, l'agente eziologico dell'infezione sospetta (reazione Vidal per la febbre tifoide e la febbre paratifoide, reazione di rigetto del complemento per varie infezioni). Disponendo invece di un siero immune ad una specifica infezione, è possibile identificare un microbo di cui non si conosce la natura. Anche le precipitazioni contano in termini di dignità. e medicina legale pratica, consentendo di determinare la specie dell'animale a cui appartiene il materiale oggetto di studio.

Reazioni immunologiche(IR) sono ampiamente utilizzati nella diagnosi di laboratorio delle infezioni. Sono utilizzati:
1) per rilevare gli anticorpi nel siero del sangue, ad es. nella diagnosi sierologica delle malattie infettive;
2) determinare il tipo o il sierotipo di un microrganismo, ad es. la sua identificazione antigenica.

IR Viene rilevata la formazione del complesso AG-AT. In questo caso la componente sconosciuta viene determinata a partire da quella nota. Gli IR si distinguono per l'elevata sensibilità (legame di AT con AG in quantità trascurabilmente piccole) e specificità (determinata dalle caratteristiche strutturali del centro attivo dei determinanti AT e AG). Sono caratterizzati da fasi di sviluppo. Il primo stadio è specifico, invisibile all'occhio, ed è caratterizzato dalla connessione del gruppo determinante di AG con il centro attivo di AT. Di conseguenza, si forma un complesso AGATA, che ha perso la sua solubilità in soluzioni isotoniche. Il secondo stadio è aspecifico, visibile all'occhio, e la natura della manifestazione dipende dallo stato di AG, AT e dalle condizioni ambientali in cui avviene l'interazione di AG e AT.

Quando gli anticorpi interagiscono con gli antigeni corpuscolari (batteri, cellule animali, altre cellule), si verificano cambiamenti visibili ad occhio nudo (ad esempio scaglie di agglutinazione, lisi cellulare). Se gli AG solubili (finemente dispersi) vengono combinati con AT, la formazione di complessi viene rilevata come risultato dell'adsorbimento preliminare di AG (AT) su sostanze corpuscolari (eritrociti, particelle di carbone, ecc.)

La velocità della reazione dipende da:
- rapporto ottimale tra AG e AT;
- grado di specificità di AG e AT; - pH dell'ambiente (7,2-7,4);
- concentrazioni di elettroliti (0,85% cloruro di sodio).

A seconda dello stato di AG, AT e delle caratteristiche dell'ambiente in cui AG e AT interagiscono, si distinguono reazioni di agglutinazione, precipitazione, lisi, complemento, neutralizzazione, ecc.

Gli IR sono divisi in semplici (due componenti, sono coinvolti solo AG e AT) e complessi (tre componenti e multicomponenti, sono coinvolti AG, AT e il sistema reagente: eritrociti sensibilizzati, coltura cellulare, pelle di un animale sensibile, ecc. ).

Le reazioni immunitarie vengono utilizzate negli studi diagnostici e immunologici su persone malate e sane. A tale scopo vengono utilizzati metodi sierologici (dal latino siero - siero e logos - insegnamento), ad es. metodi per studiare anticorpi e antigeni utilizzando reazioni antigene-anticorpo determinate nel siero del sangue e altri fluidi, nonché nei tessuti corporei. La rilevazione di anticorpi contro antigeni patogeni nel siero del paziente consente di formulare la diagnosi della malattia.

Gli studi sierologici vengono anche utilizzati per identificare antigeni microbici, varie sostanze biologicamente attive, gruppi sanguigni, antigeni tissutali e tumorali, complessi immunitari, recettori cellulari, ecc.

Quando un microbo viene isolato da un paziente, l'agente patogeno viene identificato studiando le sue proprietà antigeniche utilizzando sieri immunodiagnostici, ad es. siero sanguigno di animali iperimmunizzati contenente anticorpi antimicrobici. Questa è la cosiddetta identificazione sierologica dei microrganismi.

Reazione di agglutinazione: La reazione di agglutinazione (dal latino oggiutinatio - incollare) è l'incollaggio dei globuli (batteri, globuli rossi, ecc.) da parte degli anticorpi in presenza di elettroliti. La reazione di agglutinazione si manifesta sotto forma di scaglie o sedimenti costituiti da corpuscoli (ad esempio batteri) “incollati insieme” da anticorpi (Fig. 7.37).

La reazione di agglutinazione viene utilizzata per: determinare l'agente patogeno isolato dal paziente; determinazione degli anticorpi nel siero del sangue del paziente; determinazione dei gruppi sanguigni.

1. Determinazione dell'agente patogeno isolato dal paziente

Reazione di agglutinazione approssimativa su vetro. Una sospensione di batteri isolati dal paziente viene aggiunta ad una goccia di siero agglutinante (diluizione 1:20). Si forma un precipitato flocculante.

Una vasta reazione di agglutinazione con un agente patogeno isolato da un paziente.

Alle diluizioni del siero agglutinante viene aggiunta una sospensione di batteri isolati dal paziente.

2. Determinazione degli anticorpi nel siero del paziente:

Una vasta reazione di agglutinazione con il siero del sangue del paziente. Diagnosticum viene aggiunto alle diluizioni del siero del paziente.

— L'agglutinazione con O-diagnosticum (batteri uccisi dal calore, che trattengono l'antigene Q) avviene sotto forma di agglutinazione a grana fine.

— L’agglutinazione con H-diagnosticum (batteri uccisi dalla formaldeide, che conservano l’antigene H flagellare) è ampia e avviene più velocemente.

Reazione di emoagglutinazione indiretta (passiva). rilevare gli anticorpi nel siero del paziente utilizzando la diagnostica settica antigenica, che sono globuli rossi con antigeni adsorbiti su di essi

I globuli rossi (o particelle di lattice) con antigeni adsorbiti su di essi interagiscono con i corrispondenti anticorpi nel siero del sangue, facendo sì che i globuli rossi si uniscano e cadano sul fondo della provetta o della cellula sotto forma di una smerlatura sedimento. In una reazione negativa, i globuli rossi si depositano sotto forma di un “bottone”. L'RPHA viene posto in compresse di plastica o in provette con diluizioni del siero del sangue del paziente, a cui viene aggiunto un diagnostico eritrocitario.

A volte viene utilizzato un anticorpo eritrocitario diagnosticum: globuli rossi su cui sono adsorbiti gli anticorpi. Ad esempio, la tossina botulinica può essere rilevata aggiungendo ad esso l'anticorpo eritrocitario botulinum diagnosticum (questa reazione è chiamata reazione di emoagglutinazione indiretta inversa - RONGA).

Reazione di Coombs Test di agglutinazione per la determinazione degli anticorpi anti-Rhesus (test di Coombs indiretto). Alcuni pazienti presentano anticorpi anti-Rhesus, che sono incompleti e monovalenti. Interagiscono specificamente con gli eritrociti Rh-positivi (Rh+), ma non ne provocano l'agglutinazione. La presenza di tali anticorpi incompleti viene determinata mediante il test di Coombs indiretto. Per fare ciò, nel sistema vengono aggiunti anticorpi anti-Rh + eritrociti Rh-positivi con anti-globuli e nuovo siero (anticorpi contro le immunoglobuline umane), che provoca l'agglutinazione degli eritrociti

Utilizzando la reazione di Coombs, vengono diagnosticate condizioni patologiche associate alla lisi intravascolare dei globuli rossi, ad esempio la malattia emolitica del neonato: i globuli rossi di un feto Rh positivo si combinano con anticorpi incompleti contro il fattore Rh circolanti nel sangue, che hanno attraversato la placenta da una madre Rh negativa.

Possono essere rilevati anche anticorpi incompleti contro i microbi antigenici.

Reazione di inibizione dell'emoagglutinazione Le emoagglutinine virali incollano insieme i globuli rossi. Questa proprietà viene utilizzata nella reazione di emoagglutinazione per l'indicazione e la titolazione dei virus, necessaria per la successiva stadiazione della MRI. La reazione di inibizione dell'emoagglutinazione si basa sul blocco, sulla soppressione degli antigeni virali (emoagglutinine) da parte degli antigeni sierici immunitari, a seguito dei quali i virus perdono la capacità di agglutinare i globuli rossi. RTGA viene utilizzato per diagnosticare molte malattie virali, i cui agenti causali (virus dell'influenza, morbillo, rosolia, encefalite trasmessa da zecche, ecc.) Possono agglutinare i globuli rossi di vari animali.

Reazione di precipitazione La reazione di precipitazione (dal latino praecipito - precipitare) è la formazione e la precipitazione di un complesso di antigene molecolare solubile con anticorpi sotto forma di una torbidezza chiamata precipitato. Si forma mescolando antigeni e anticorpi in quantità equivalenti; un eccesso di uno di essi riduce il livello di formazione del complesso immunitario. La reazione di precipitazione viene effettuata in provette (reazione di precipitazione ad anello), in gel, mezzi nutritivi, ecc.

Reazione di precipitazione dell'anello La reazione viene effettuata in strette provette di precipitazione: un antigene solubile viene stratificato sul siero immunitario. Con un rapporto ottimale tra antigene e anticorpi, al confine di queste due soluzioni si forma un anello opaco di precipitato. Se come antigeni nella reazione vengono utilizzati estratti di tessuto bolliti e filtrati, questa reazione viene chiamata reazione di termoprecipitazione (reazione di Ascoli, in cui viene rilevato l'aptene dell'antrace).

Immunoelettroforesi- una combinazione di elettroforesi e immunoprecipitazione: una miscela di antigeni viene introdotta nei pozzetti del gel e separata nel gel mediante elettroforesi, quindi il siero immune viene aggiunto nella scanalatura del gel parallela alle zone di elettroforesi. Gli anticorpi del siero immunitario si diffondono nel gel e formano linee di precipitazione nel punto di “incontro” con l'antigene.

Reazione di flocculazione (secondo Ramon)(dal latino floccus - scaglie di lana) - comparsa di opalescenza o massa flocculante (immunoprecipitazione) in una provetta durante una reazione tossina-antitossina o tossoide-antitossina. Viene utilizzato per determinare l'attività del siero antitossico o del tossoide.

I ceppi dell'agente eziologico della difterite - C, cliphtheriae possono essere tossigeni (producendo un'esotossina) e non tossigeni. La formazione di un'esotossina dipende dalla presenza nei batteri di un profago che trasporta un gene tox che codifica per la formazione di un'esotossina. Quando si verifica la malattia, tutti gli isolati vengono testati per la tossigenicità, ovvero la produzione di esotossina difterica utilizzando una reazione di precipitazione sull'agar.

Reazione di neutralizzazione Gli anticorpi sierici immunitari sono in grado di neutralizzare gli effetti dannosi dei microbi o delle loro tossine su cellule e tessuti sensibili, che è associato al blocco degli antigeni microbici da parte degli anticorpi, cioè alla loro neutralizzazione. La reazione di neutralizzazione (RN) viene effettuata introducendo una miscela antigene-anticorpo negli animali o in oggetti di test sensibili (colture cellulari, embrioni). In assenza degli effetti dannosi dei microrganismi o dei loro antigeni o tossine negli animali e negli oggetti da testare, parliamo dell'effetto neutralizzante del siero immunitario e, quindi, della specificità dell'interazione del complesso antigene-anticorpo.

Reazione di fissazione del complemento La reazione di fissazione del complemento (CFR) consiste nel fatto che quando antigeni e anticorpi corrispondono tra loro, formano un immunocomplesso al quale il complemento (C) è attaccato attraverso il frammento Fc degli anticorpi, cioè. Il complemento è legato dal complesso antigene-anticorpo. Se il complesso antigene-anticorpo non si forma, il complemento rimane libero

L'RSK si effettua in due fasi: 1a fase - incubazione di una miscela contenente antigene + anticorpo + complemento; 2a fase (indicatore) - rilevamento del complemento libero nella miscela aggiungendo ad esso un sistema emolitico costituito da eritrociti di pecora e siero emolitico contenente anticorpi contro di essi. Nella 1a fase della reazione, quando si forma il complesso antigene-anticorpo, il complemento si lega, quindi nella 2a fase non si verificherà l'emolisi degli eritrociti sensibilizzati dagli anticorpi (la reazione è positiva). Se l'antigene e l'anticorpo non corrispondono tra loro (non c'è antigene o anticorpo nel campione analizzato), il complemento rimane libero e nella 2a fase si unisce al complesso eritrociti-anticorpo antieritrocitario, provocando l'emolisi (reazione negativa). La RSC viene utilizzata per diagnosticare molte malattie infettive, in particolare la sifilide (reazione di Wassermann).

Reazione di immunofluorescenza Reazione di immunofluorescenza (metodo RIF o Koons). Esistono tre tipi di metodo: diretto, indiretto, con complemento. La reazione di Koons è un metodo diagnostico rapido per identificare gli antigeni microbici o determinare gli anticorpi.

Il metodo RIF diretto si basa sul fatto che gli antigeni tissutali o i microbi trattati con sieri immunitari con anticorpi marcati con fluorocromi sono in grado di brillare ai raggi UV di un microscopio a fluorescenza (Fig. 7.61). I batteri in uno striscio trattato con un siero così luminescente si illuminano lungo la periferia della cellula sotto forma di un bordo verde.

Il metodo RIF indiretto prevede la rilevazione del complesso antigene-anticorpo utilizzando anti-globuli e nuovo siero (anti-anticorpo) marcato con fluorocromo. A questo scopo, gli strisci ottenuti da una sospensione microbica vengono trattati con anticorpi provenienti da siero diagnostico antimicrobico di coniglio. Quindi gli anticorpi che non sono legati dagli antigeni microbici vengono lavati e gli anticorpi rimasti sui microbi vengono rilevati trattando lo striscio con anti-globuli e nuovo siero (anti-coniglio) marcato con fluorocromi. Di conseguenza, un complesso microbo + antimicrobico si formano anticorpi di coniglio + anticorpi anti-coniglio marcati con fluorocromo. Questo complesso viene osservato al microscopio a fluorescenza, come nel metodo diretto.

ESSO. Quando si determina l'antigene si aggiunge un antigene ai pozzetti con gli anticorpi assorbiti (ad esempio, siero sanguigno con l'antigene desiderato), si aggiunge un siero diagnostico contro di esso e si aggiungono anticorpi secondari (contro il siero diagnostico) marcati con un enzima, quindi un substrato/cromogeno per l'enzima.

ELISA competitivo per la determinazione degli antigeni (Fig. 7.65).

ELISA competitivo per la determinazione degli anticorpi: gli anticorpi desiderati e gli anticorpi marcati con l'enzima competono tra loro per gli antigeni adsorbiti sulla fase solida.

Immunoblot- un metodo altamente sensibile per l'identificazione delle proteine, basato su una combinazione di elettroforesi e ICH>A o RIA). L'immunoblotting viene utilizzato come metodo diagnostico per l'infezione da HIV, ecc. Gli antigeni dell'agente patogeno vengono separati mediante elettroforesi in un gel di poliacrilammide, quindi vengono trasferiti (blotting - dall'inglese blot - spot) dal gel su carta attivata o su una membrana di nitrocellulosa e sviluppato utilizzando ELISA, l'azienda produce tali strisce con “macchie” di antigeni*. Su queste strisce viene applicato il siero del paziente B). Quindi, dopo l'incubazione, il paziente viene lavato dagli anticorpi non legati e viene applicato il siero contro le immunoglobuline umane marcate con l'enzima C. Il complesso formato sulla striscia [antigene 4 - anticorpo del paziente + anticorpo contro le Ig umane] viene rilevato aggiungendo il substrato cromogenico D), che cambia colore sotto l'azione di un enzima.

Reazione a catena della polimerasi: basato sull'amplificazione, ad es. un aumento del numero di copie di un gene specifico (marcatore) dell'agente patogeno. Per fare ciò, il DNA a doppio filamento isolato dal materiale in studio viene denaturato (“non intrecciato” quando riscaldato) e nuovi filamenti complementari vengono aggiunti (quando raffreddati) ai filamenti di DNA non attorcigliati. Di conseguenza, due geni si formano da un gene. Questo processo di copiatura genetica viene ripetuto molte volte in determinate condizioni di temperatura. L'aggiunta di nuovi filamenti di DNA complementari avviene quando primer (primer di DNA corto a filamento singolo complementari alle estremità da 3" del DNA del gene desiderato), DNA polimerasi e nucleotidi vengono aggiunti ai geni desiderati.

Le reazioni immunitarie si basano sull'interazione specifica di un antigene con un anticorpo. Utilizzando antigeni noti è possibile determinare la presenza di anticorpi nel siero del paziente o della persona esaminata (diagnosi sierologica delle malattie infettive). E, al contrario, la presenza di sieri immunitari specifici consente di stabilire il generico, la specie e il tipo di microrganismo (identificazione sierologica del microbo mediante struttura antigenica).

L'agglutinazione è l'incollaggio di microbi o altre cellule quando esposti al siero immunitario contenente anticorpi - agglutinine. La reazione di agglutinazione si manifesta nel fatto che una sospensione uniforme di cellule, ad esempio batteri, quando si aggiunge siero immunitario, le cellule si torcono, formano granuli o scaglie, che gradualmente si depositano sul fondo, mentre il liquido sopra il sedimento diventa completamente limpido. Tuttavia, granuli o scaglie si formano solo se la reazione avviene in presenza di elettroliti. Pertanto, affinché avvenga una reazione di agglutinazione, è necessario disporre di: 1) un antigene (agglutinogeno) sotto forma di sospensione cellulare; 2) anticorpi (agglutinine) sotto forma di siero immunitario; 3) elettroliti (soluzione salina).

La manifestazione esterna di una reazione di agglutinazione batterica positiva ha un duplice carattere, a seconda delle proprietà dell'antigene: nei batteri flagellati, che hanno un solo antigene somatico o O, le cellule microbiche stesse si uniscono e le emorroidi risultanti hanno l'aspetto di grani piccoli e compatti. Questa agglutinazione è detta a grana fine; avviene lentamente - nell'arco di 18-22 ore. I batteri dotati di flagelli hanno due antigeni: uno somatico, l'antigene O, nella cellula stessa e un flagellare, l'antigene H, situato nel flagello. Le cellule si uniscono ai flagelli e formano grandi scaglie sciolte. Questo tipo di agglutinazione è chiamata agglutinazione grossolana; arriva rapidamente - entro 2-4 ore.

La reazione di agglutazione, per la sua specificità, semplicità, stadiazione e dimostratività, si è diffusa nella pratica microbiologica per la diagnosi di molte malattie infettive: febbre tifoide, tifo, febbre paratifoide, dissenteria, colera, brucellosi, ecc. Viene utilizzata per la diagnosi scopi in 2 direzioni.

1. Determinare l'isolamento di un microbo sconosciuto isolato da qualsiasi substrato. In questo caso l'agglutinazione viene eseguita con un siero agglutinante specifico, già preparato, ottenuto immunizzando conigli con un certo tipo di batteri e, quindi, contenente agglutinine contro questi batteri.

Una coltura di un microbo sconosciuto in fase di studio viene presa come antigene. Un risultato positivo della reazione indica che il microbo sconosciuto è identico a quello preso come antigene per la preparazione del siero agglutinante.

2. Per rilevare le agglutinine verso uno o un altro tipo specifico di batteri nel siero del paziente. In questo caso, per l'agglutinazione, una certa coltura di batteri in laboratorio (o più colture di batteri di specie diverse) viene presa come antigene e il siero del paziente. Un risultato di agglutinazione positivo indica che il siero del paziente contiene agglutinine di un tipo specifico e noto di microbo, ad es. questo microbo è l'agente eziologico della malattia, durante la quale gli anticorpi protettivi si accumulano nel siero del paziente.

Meccanismo: “teoria del reticolo”.

Il centro attivo dell'AT si collega con il 1° determinante antigenico, il 2° centro attivo reagisce con il determinante antigenico situato sulla 2a molecola antigenica, provocando l'incollaggio. Se un batterio flagellato viene considerato AT, la granularità è fine - agglutinazione se flagellato - agglutinazione H (granularità grossolana);

Opzioni di agglutinazione:

1. Approssimativo sul vetro: per identificare le proprietà sierologiche dei batteri, per identificare i segni, per l'identificazione.

2. Utilizzato in provette: bassa sensibilità e bassa specificità. Viene determinato il titolo AT (questa è la diluizione massima del siero in cui è stata rilevata l'agglutinazione).

3. RNGA (reazione allo stress) - una reazione di agglutinazione genetica continua - viene utilizzata l'AG assorbito sugli eritrociti di pecora, ad es. trasferimento da solubile a corpuscolare - agglutinazione dei globuli rossi.

Il siero diagnostico agglutinante viene preparato immunizzando i conigli.

Il siero di un paziente per la stadiazione di una reazione di agglutinazione viene ottenuto dal suo sangue, prelevato sterilimente dalla vena cubitale in una quantità di 5-10 ml. Allo stesso tempo, parte del sangue viene utilizzata per la coltura. Se il sangue è necessario solo per mettere in scena una reazione, 1-2 ml sono sufficienti. Quindi prelevano il sangue dal dito pungendolo con un ago di Frank.

AG per la reazione di agglutinazione sono le corrispondenti colture batteriche vive o uccise. Le colture vive vengono utilizzate quando viene eseguita l'agglutinazione per determinare il tipo di batteri isolati da qualsiasi substrato.

I diagnosticum sono preparati diagnostici contenenti antigeni e utilizzati per rilevare gli antigeni.

24 Reazione delle precipitazioni e suo significato, portata. Metodi di stadiazione. Sieri precipitanti, loro preparazione e titolazione. Utilizzo della reazione di precipitazione nella diagnosi delle infezioni.

Le reazioni di precipitazione si basano sul fenomeno della formazione di un sedimento visibile (precipitato) dopo l'interazione dell'AG solubile o colloidale disperso con l'AT. RP consente di rilevare piccole quantità di AG. Sono molto sensibili e vengono utilizzati per analisi immunochimiche fini che identificano i singoli componenti in una miscela con antigeni. Il metodo ha molte varietà.

La reazione della colcecipitazione. Sullo strato di antisiero viene stratificato un liquido contenente AG e dopo pochi secondi si osserva la formazione di un anello di precipitato.

Le reazioni di microprecipitazione vengono utilizzate per il rilevamento nefelometrico dell'AT in piccoli campioni di siero.

Precipitazione in gel - su agar, viene utilizzata per determinare la tossigenicità dei batteri isolati. Per la difterite, tossicosi da stafilococco, per determinare l'immunoglobulina cellulare nel siero del sangue.

La reazione di precipitazione è caratterizzata da elevata sensibilità e specificità. Permette di rilevare le più piccole tracce di proteina-antigene (fino ad una diluizione di 1:100.000 e oltre), per cui la precipitazione è praticamente diventata una reazione importante in chimica, biologia, ecc.

La reazione di precipitazione è estremamente importante nella pratica forense per riconoscere il tipo di sangue non solo allo stato fresco e liquido, ma anche allo stato essiccato, ad esempio nelle macchie di origine molto antica sui vestiti.

Nella pratica sanitaria, la reazione di precipitazione è un metodo per determinare la falsificazione di carne, farina e altri preparati.

Per la diagnosi sierologica, la reazione di precipitazione viene utilizzata nei casi in cui l'antigene può essere ottenuto solo allo stato liquido, ad esempio in un estratto di organi infetti, nel liquido cerebrospinale, nell'urina del paziente, ecc.

Le reazioni di precipitazione possono essere effettuate sia con sostanze di natura proteica - antigeni a pieno titolo, sia con apteni - antigeni difettosi, che da soli non possono causare la formazione di antigeni, ma possono combinarsi con essi.

Impostazione di una reazione. Per eseguire la reazione di precipitazione è necessario avere:

1. siero precipitante preparato immunizzando conigli con l'antigene appropriato;

2. l'AG test sotto forma di soluzione trasparente centrifugata o filtrata (estratto dei loro corpi microbici, substrati patologici del paziente, organi, macchie di sangue, proteine ​​sieriche, ecc.) Prima della reazione, l'AG viene diluito con soluzione fisiologica almeno 1:1000;

3. soluzione fisiologica (per diluire siero e antigene);

4. provette speciali strette (non più larghe di 0,75 cm) con fondo conico e vetro molto trasparente;

5. Pipette Pasteur;

Un prerequisito è la completa trasparenza degli ingredienti coinvolti nella reazione di agglutinazione: siero e AG. Altrimenti, i risultati della reazione non saranno chiari.

In una provetta si versano 0,2 ml di siero precipitante; quindi, utilizzando una pipetta Pasteur, stratificare con attenzione 0,2 ml di AG sul siero (il liquido viene abbassato lungo la parete della provetta in modo che non si mescoli con il siero, ma formi uno strato superiore sopra di esso). Aggiungendo AG. La provetta viene posizionata su un supporto. Se il risultato della reazione è positivo, immediatamente o entro 5-10 minuti si forma un anello torbido di AG precipitato sul confine di entrambi i liquidi. Il grado di reazione è valutato dalla dimensione dell'anello e dal tempo della sua manifestazione.

All'esperimento vengono aggiunti diversi controlli, vale a dire: 1) antigeni noti + siero precipitante specifico; 2) siero precipitante + soluzione salina; 3) siero normale + test ipertensione.

25 La reazione di lisi immunitaria è uno dei meccanismi dell'immunità. Componenti della reazione, uso pratico.

Una delle proprietà protettive del siero immunitario durante l'infezione è la sua capacità di dissolvere (lisare) m/o altri elementi cellulari che entrano nel corpo. Gli anticorpi specifici che causano la lisi cellulare (dissoluzione) sono chiamati lisine. A seconda dell'AG, sono più precisamente chiamate batteriolisine, spirochetolisine, citolisine, ecc.

Le lisine sono in grado di esercitare il loro effetto lisante sull’ipertensione solo in presenza di un fattore aggiuntivo: il complemento. Il complemento è un componente di qualsiasi siero fresco, sia normale che immune. Quando il siero viene immagazzinato o riscaldato, il complemento viene distrutto.

Quello. la reazione di lisi avviene con la partecipazione di due componenti: uno specifico, contenuto nel siero immunitario (AT), e l'altro non specifico, inerente a qualsiasi siero, sia immunitario che normale (complemento).

Il siero immunitario appena estratto dal corpo è capace di lisi, poiché contiene sia AT che complemento. Se usano siero immunitario che è rimasto fermo o riscaldato e, di conseguenza, ha perso il complemento, la lisi avverrà solo se viene aggiunto il complemento, ad es. siero di latte fresco. Per garantire la coerenza dei risultati, il siero immunitario viene inattivato preventivamente riscaldandolo a 56 gradi per 30 minuti (per distruggere il complemento in esso presente) e ad esso viene aggiunta una quantità rigorosamente definita di complemento. È consuetudine utilizzare come complemento il siero fresco di una normale cavia.

Quando si differenziano i vibrioni del colera e quelli simili al colera.

26. Reazione di fissazione del complemento nella diagnosi delle malattie infettive. Applicazione pratica, componenti di reazione.

Questa reazione viene utilizzata per la sierodiagnosi e il rilevamento di antigeni nel materiale del test, la sieroidentificazione di colture isolate. È caratterizzato da un'elevata sensibilità e sufficiente specificità, nonché dalla possibilità di utilizzare sia G corpuscolare che solubile. Quest'ultimo è dovuto al fatto che il complemento si lega al frammento Fc dell'AT, indipendentemente dalla loro specificità. Pertanto, la capacità del complemento di legarsi solo al complesso AG-AT grazie ai frammenti Fc di quest'ultimo e di non causare emolisi degli eritrociti sensibilizzati (sistema di test) è servita come base per l'uso diffuso di RSC nella pratica di laboratorio nel corso degli anni. secolo scorso.

Per stadiare la RSC è necessaria una preparazione preliminare degli ingredienti di reazione, in particolare del complemento, che viene utilizzato come siero di cavia con l'impostazione della dose di lavoro. Tuttavia, negli ultimi decenni, è stato prodotto il complemento titolato secco, che ha notevolmente facilitato la messa in scena della reazione. Il siero sanguigno e gli antigeni da testare devono essere monitorati per accertarne l'anticomplementarità.

L'esperimento principale viene eseguito in provette aggiungendo determinati volumi di siero sanguigno, antigene e una dose di lavoro di complemento. La miscela viene incubata in un termostato a 37 gradi per un'ora. La registrazione dei risultati della reazione viene effettuata mediante emolisi degli eritrociti di pecora sensibilizzati. Vengono preparati mescolando siero emolitico di coniglio con globuli rossi di pecora. Quando si aggiunge il complemento a questa miscela, si verifica una reazione di emolisi. Pertanto, nei casi in cui il complemento non si lega al sistema AG-AT in studio, ad es. rimane libero, si osserva un'emolisi completa dei globuli rossi di pecora, che indica una reazione negativa. L'assenza di emolisi indica il legame del complemento da parte del sistema AG-AT, cioè una reazione positiva, indicata dalle croci. L'intensità dell'emolisi ritardata viene valutata utilizzando un sistema quadruplo, con la completa assenza di emolisi indicata come ++++

27 Anticorpi incompleti. Reazione di Coombs (diretta e indiretta). Rilevazione di anticorpi contro il fattore Rh nelle donne in gravidanza.

Gli AT incompleti – AT che hanno un solo centro attivo – sono monovalenti.

Reazione di Coombs.

Il metodo rileva gli anticorpi incompleti (monovalenti) formati durante la brucellosi, il conflitto Rh o la collagenosi sistemica. Per mettere in scena una reazione, è necessario un siero antiglobulina contenente anticorpi completi (almeno bivalenti).

Gli anticorpi incompleti, a differenza di quelli normali, sono monovalenti perché hanno un centro attivo che può interagire con un solo epitopo, mentre gli altri epitopi rimangono non legati. Di conseguenza non si formano grandi complessi che precipitano nella soluzione elettrolitica. Questi ultimi compaiono solo nelle reazioni con anticorpi bivalenti. Per correggere questa situazione, viene introdotto il siero antiglobulina (AGS), contenente anticorpi bivalenti contro la globulina, che legheranno tra loro gli anticorpi monovalenti. Contenuto nel materiale in studio. In questo modo si verificherà un'emoagglutinazione o agglutinazione visivamente visibile, che indica la presenza di anticorpi incompleti (monovalenti) nel siero del test. Ad esempio, se una donna Rh negativa rimane incinta di un feto Rh positivo, nel suo siero appariranno anticorpi incompleti. Per identificarli, gli eritrociti Rh positivi e poi l'AGS vengono aggiunti in una provetta con il siero del sangue da testare. La comparsa di emoagglutinazione indica una reazione positiva.

Immunofluorescenza

Reazione di immunofluorescenza (RIF). Sviluppato da A. Koons e porta il suo nome (metodo Koons). Questo è uno dei metodi di ricerca che utilizza anticorpi marcati. Come etichetta viene utilizzato un colorante che si illumina ai raggi ultravioletti (isocianato di fluoresceina o semplicemente fluorocromo). La barriera corallina viene utilizzata in due modifiche: il metodo Koons diretto e il metodo Koons indiretto. Metodo diretto: il materiale da analizzare, fissato su un vetrino, viene trattato con siero diagnostico marcato con fluorocromi; fase obbligatoria della reazione -

lavaggio da anticorpi non reagiti; se il materiale in studio contiene l'antigene desiderato, gli anticorpi marcati vengono fissati sull'antigene e, dopo il lavaggio, tale complesso si rivela alla vista con la sua luminosità

farmaco al microscopio a fluorescenza. Metodo indiretto: in questo caso, la reazione avviene in due fasi: nella prima fase viene utilizzato il siero diagnostico non marcato, nella seconda fase viene utilizzato il siero antiglobulina marcato con fluorocromo; Utilizzando il metodo indiretto è possibile rilevare sia la presenza dell'antigene che

presenza e titolo di anticorpi specifici. I sieri luminescenti (fluorescenti) lo sono

sieri immunitari contenenti anticorpi specifici marcati con coloranti fluorescenti. Quando si preparano sieri luminescenti, i fluorocromi vengono aggiunti alla frazione globulina del siero immune attraverso un forte legame chimico. I sieri luminescenti vengono utilizzati durante l'esecuzione del RIF.

29. Reazione di neutralizzazione– la capacità degli anticorpi di neutralizzare tossine, virus, veleni di serpente. Utilizzato per l'indicazione e l'identificazione delle tossine, per l'identificazione dei virus, ecc. L'RN non fornisce risultati visibili in vitro,

pertanto, viene preso in considerazione utilizzando un test biologico su animali o in colture di tessuti. Il pH in vivo può essere utilizzato per determinare il grado di tensione dell'immunità antitossica nel corpo umano (test di Schick).

La tossina è un veleno di origine microbica. Le tossine microbiche si dividono in endotossine ed esotossine. Caratteristiche delle tossine, vedere l'argomento n. 6.

L'anatossina è una tossina neutralizzata. Ottenuto da esotossine trattandole con formaldeide e calore. L'anatossina non è tossica, ma conserva le proprietà antigeniche e immunogeniche della tossina. Forza

l'azione del tossoide si misura in IE. UI (unità immunogenica) è la quantità di tossoide che, miscelato con 1 UA di siero, dà la flocculazione iniziale. Il titolo tossoide è la quantità di IE in 1 ml.

I tossoidi vengono titolati in una reazione di flocculazione. L'anatossina viene utilizzata come vaccino per creare un'immunità antitossica attiva. Esempi di tali vaccini sono il tossoide difterico e il tetano

toxoid, ecc. Toxoid viene utilizzato anche per ottenere sieri antitossici.

Siero antitossico o antitossico– siero contenente anticorpi contro la tossina. I sieri antitossici sono sieri eterologhi; si ottengono iperimmunizzando i cavalli con i tossoidi appropriati, quindi prelevando il sangue dagli animali e ottenendo il siero. Il contenuto di antitossina nei sieri antitossici è espresso in unità internazionali (UI) adottate dall'OMS. Ad esempio, 1 UI di siero antitetanico corrisponde al suo

la quantità minima che neutralizza 1000 dosi minime letali (DLm) di tossina tetanica per una cavia di 350 g di peso 1 UI di antitossina antibotulinica è la quantità più piccola di siero che neutralizza 10.000 DLm di tossina botulinica per topi di peso di 20 g Le UI di siero antidifterico corrispondono alla sua quantità minima che neutralizza 100 DLm di tossina difterica per una cavia del peso di 250 g.

30. Reazione di flocculazione(RF) - utilizzato per la titolazione di sieri antitossici, tossine e tossoidi. La reazione di flocculazione coinvolge una tossina o un'anatossina come antigene. Quando vengono mescolati in proporzioni equivalenti con siero antitossico, appare torbidità e quindi appare un sedimento sciolto. Le reazioni sono possibili solo con sieri antitossici equini (non di coniglio) o con antisieri antitireoglobulina umani. Il meccanismo RF è simile a quello della reazione di precipitazione. Tossine, tossoidi, antitossine (sieri antitossici) partecipano come componenti alle reazioni di neutralizzazione e flocculazione

31. Test immunoenzimatico- un metodo immunologico di laboratorio per la determinazione qualitativa o quantitativa di vari composti, macromolecole, virus, ecc., che si basa su una specifica reazione antigene-anticorpo. L'identificazione del complesso formato viene effettuata utilizzando l'enzima come etichetta per la registrazione del segnale.

Classificazione per tipo di interazione immunochimica nella prima fase dell'analisi (in cui avviene il legame dell'analita). Se il sistema contiene solo il composto analizzato e i suoi corrispondenti centri di legame (antigene e anticorpi specifici), il metodo lo è non competitivo. Se, nella prima fase, il sistema contiene contemporaneamente l’analita e il suo analogo (un analita marcato con un enzima o un analita immobilizzato su una fase solida), in competizione per un numero limitato di siti di legame specifici, allora il metodo è competitivo.

Tra competitivo Esistono due formati principali per gli schemi ELISA in fase solida:

1. Concorrenza diretta Il formato ELISA utilizza anticorpi specifici immobilizzati su una fase solida e un antigene marcato con un enzima e uno non marcato competono per legarsi all'anticorpo immobilizzato.
IN competitivo indiretto Il formato ELISA utilizza anticorpi marcati con enzima (specifici o secondari) e un coniugato antigene-proteina-trasportatore immobilizzato sulla fase solida.
Pertanto, a causa degli indubbi vantaggi del test immunoenzimatico: facilità d'uso, velocità, obiettività grazie all'automazione della registrazione dei risultati, la capacità di studiare immunoglobuline di varie classi (che è importante per la diagnosi precoce delle malattie e la loro prognosi) è attualmente uno dei principali metodi di diagnostica di laboratorio.

Principali tipologie di sistemi di test (kit diagnostici) a seconda degli antigeni utilizzati

A seconda degli antigeni utilizzati, i sistemi di test immunoenzimatici sono suddivisi in:

1. Lisato - in cui viene utilizzata una miscela di antigeni nativi (un agente infettivo lisato o trattato con ultrasuoni ottenuto in coltura);

2. Ricombinante - che utilizza proteine ​​geneticamente modificate che sono analoghi di alcuni antigeni proteici dell'agente patogeno;

3. Peptide: utilizza frammenti proteici sintetizzati chimicamente.

Teorie dell'immunità

1) Teoria dell'immunità di Ehrlich(teoria delle catene laterali) è una delle prime teorie sulla formazione di anticorpi, secondo la quale le cellule hanno recettori antigene-specifici che vengono rilasciati come anticorpi sotto l'influenza di un antigene.

2) Teoria clonale-selettiva, La teoria di Burnet- la teoria secondo la quale nell'organismo compaiono cloni di cellule immunocompetenti per vari antigeni; l'antigene contatta selettivamente il clone corrispondente, stimolandone la produzione di anticorpi.

1. Anticorpi e linfociti con la necessaria specificità esistono già nell'organismo prima del primo contatto con l'antigene.

2. I linfociti coinvolti nella risposta immunitaria hanno recettori antigene-specifici sulla superficie delle loro membrane. Nel caso dei linfociti B, i recettori sono molecole con la stessa specificità degli anticorpi che questi linfociti successivamente producono e secernono.

3. Ogni linfocita porta sulla sua superficie recettori di una sola specificità.

Un linfocita sensibilizzato da un antigene attraversa diverse fasi di proliferazione e forma un clone di plasmacellule. Le plasmacellule sintetizzano anticorpi solo con la specificità per la quale è stato programmato il linfocita precursore. I segnali per la proliferazione sono il legame dell’antigene e le citochine rilasciate da altre cellule (principalmente le cellule T helper. Anche gli stessi linfociti B attivati ​​rilasciano citochine.

3) Teoria selettiva della formazione di anticorpi Erne ha formulato, ha suggerito che il corpo sintetizza un set completo di anticorpi, ma ciascuno di essi si forma in piccole quantità e, indipendentemente da qualsiasi stimolo, entra nel sangue sotto forma di anticorpi naturali. La loro funzione è quella di legarsi selettivamente all'antigene corrispondente e di consegnarlo in questo modo a determinate cellule del corpo, per le quali fungono da segnale per riprodurre le stesse molecole, cioè alla formazione di anticorpi. Questa fu la prima teoria che spiegò anche il fenomeno della tolleranza immunologica, partendo dal presupposto che eventuali anticorpi naturali diretti contro gli antigeni self sarebbero stati immediatamente assorbiti dai tessuti dell'organismo e quindi non avrebbero potuto innescare la formazione di autoanticorpi.

34. Tolleranza immunologica- la capacità del sistema immunitario di non rispondere specificamente ad un antigene specifico. Durante la gravidanza, ad esempio, il sistema immunitario della madre sviluppa tolleranza