Jelde immünelektroforez gerçekleştirmek için cihaz. İnsan serum proteinlerine karşı immünelektroforez için poli-IEF serumu, kuru agar jelinde immünelektroforez yöntemi.

Tanım

IEF serumu insan serum proteinlerine karşı antikorlar içerir. Normal insan kan serumu ile immünelektroforezde, ilacın karşılık gelen bölgelerde en az 15 çökelme hattını tespit etmesi gerekir: a-bölgesinde - albümin, bir 2-makroglobulin; β-bölgesinde – transferrin, seruloplazmin; γ bölgesinde - IgG, IgA, IgM vb. çizgiler.
Ampule (şişeye) 1,0 ml saf su eklendikten sonra serum 5 dakika içinde tamamen çözülmelidir. Çözündükten sonra serum şeffaf olmalı, tortu ve yabancı kalıntılar içermemeli, pembemsi sarı renkte olmalıdır. İletilen ışıkta hafif bir opalesans kabul edilebilir.

Salım formu

1 ml'lik ampullerde (10 şişe) mevcuttur.

Birleştirmek

İnsan serum proteinlerine karşı immünelektroforez için kuru serum, normal insan kan serumu ile immünize edilmiş koyunlardan elde edilen immün serumun liyofilizatıdır.
Kit, insan serum proteinlerine karşı immünelektroforez için serumdan oluşur.

İnsan serum proteinlerine karşı IEF serumu. Beyazımsı griden pembemsi sarı renge kadar gözenekli kütle 1 ml'lik 10 ampul (şişe)

Kullanım endikasyonları

Kan serumu, diğer insan biyolojik sıvıları ve kan ürünlerindeki immünoglobulinlerin ve çeşitli proteinlerin immünelektroforez (IEF) yoluyla kalitatif ve kantitatif tespiti için tasarlanmıştır.

Dozaj rejimi ve uygulama yöntemi

Analiz edilen numuneler 2 ila 8 °C sıcaklıkta 7 gün veya eksi 18 °C'yi aşmayacak sıcaklıkta 1 yıldan fazla saklanmamalıdır. Dondurulmuş numuneler test edilmeden önce çözülmeli ve çalkalanarak iyice karıştırılmalıdır. Yeniden dondurmaya izin verilmez.

EKİPMAN, REAKTİFLER VE MALZEMELER
Ekipman: elektrik akımı doğrultuculu immünelektroforez cihazı, analitik terazi, elektrikli ocak, pH ölçer, buzdolabı, seviye ayarlı sahne, cam plakalar (90 × 120) mm, ıslak oda, hacimsel cam eşyalar, değiştirilebilir uçlu pipet dağıtıcıları, dezenfeksiyon kabı .
Reaktifler ve malzemeler:
– ağar;
– amido siyahı 10B;
– veronal;
- Arıtılmış su;
- Gliserin;
- borik asit;
- asetik asit;
– medin;
– mertiolat (timerosal);
– sodyum tetraborat 10-su;
- sodyum klorit;
– pironin B;
– laboratuvar filtre kağıdı;
- tek kullanımlık eldivenler;
– dezenfektan solüsyonları.

ANALİZİN YAPILMASI
İmmünoelektroforez.
IEF yöntemi, yüklü parçacıkların bir elektrik alanının etkisi altında bir agar jeli içinde hareket etme kabiliyetine ve bu parçacıkların görünür bağışıklık komplekslerinin oluşumuyla ilgili bağışıklık serumları tarafından spesifik olarak çökeltilmesi esasına dayanır.
IEF serumu içeren ampulleri (şişeleri) açın ve her birinin içeriğini 1,0 ml saf su içinde çözün.
Tampon çözeltilerinin hazırlanması.
Veronal-medinal tampon çözeltisi 0,05 M pH 8,6±0,1 (veronal - 1,38 g, medinal - 8,76 g, 1 l'ye kadar arıtılmış su);
Borat tampon çözeltisi, 0,05 M, pH 8,6±0,1 (borik asit - 6,7 g, sodyum tetraborat 10-sulu - 13,4 g, arıtılmış su - 1 l'ye kadar).
Aşağıdaki tampon çözümlerinden herhangi birini kullanın.
Tampon çözeltiyi IEF cihazının elektrot odalarına dökmeden önce, saf su ile 2 kez seyreltilmelidir.
%0,9 sodyum klorür çözeltisinin hazırlanması.
9 g sodyum klorürü 1 litrelik ölçülü bir şişeye aktarın, işarete kadar arıtılmış su dökün ve tamamen eriyene kadar karıştırın.

Renklendirme çözeltisinin hazırlanması.
1 g amido black 10 B'yi 1 litrelik ölçülü bir şişeye aktarın, az miktarda saf su dökün, 70 ml asetik asit ekleyin, hacmi saf suyla işarete getirin ve karıştırın.
Boyamadan sonra agarı yıkamak için bir çözeltinin hazırlanması.
1 litrelik ölçülü bir şişeye 25 ml asetik asit dökün, 20 ml gliserin ekleyin, hacmi arıtılmış suyla işarete getirin ve karıştırın.
Tampon solüsyonunda %1 agar jelinin hazırlanması.
Plaka sayısına bağlı olarak agar jel miktarı önceden hesaplanmalıdır. 1 g agarı bir bardağa aktarın, 2-3 kez arıtılmış suyla durulayın ve 50 ml saf su içinde kaynar su banyosunda tamamen eriyene kadar pişirin. Kaynatılmış agarı 100 ml'lik bir ölçüm silindirine aktarın ve içerik seviyesini ısıtılmış bir tampon çözeltisiyle işarete getirin. 0,1 g mertiolat ekleyin ve karıştırın. Agar jeli homojen, şeffaf ve mekanik yabancı maddelerden arındırılmış olmalıdır.

Cam plakaların agar jeli ile doldurulması.
Cam plakaları (90±120) mm'lik bir terazi kullanarak dengelenmiş bir tablaya yerleştirin. (55±5) °C sıcaklıkta eritilmiş ve soğutulmuş agar, plaka başına 20 ml erimiş agar oranında cam plakalara dikkatlice uygulanır. Agar sertleştikten sonra plakaları IEF cihazına yerleştirin. Plakalardaki agar jelini, 5-6 kat katlanmış filtre kağıdını kullanarak cihazın elektrot odalarındaki tampon çözeltisiyle birleştirin.
Agarın tampon çözeltiyle plakalara bağlanması agar köprüleri kullanılarak da mümkündür.

IEF'i yürütmek.
Özel bir damga kullanarak agar katmanında delikler açın ve elektroforezden sonra enine oluklar kesin.
Agar'ı kuyucuklardan çıkardıktan sonra, bir pipet dağıtıcısı kullanarak çözünmüş kontrol insan kanı serumu ve analiz edilen numuneleri kullanarak doldurun. Kuyulardan birine pyronin B boyası ekleyin (kesirlerin ilerlemesini kontrol etmek için).
IEF cihazını platin elektrotlu bir kapakla kapatın ve onu bir elektrik akımı doğrultucuya bağlayın. Elektroforez 70-150 V voltajda ve 10-50 mA akımda 2-3 saat süreyle gerçekleştirilir. Albümin göçüne karşılık gelen pironin noktası 20-25 mm uzaklıkta olduğunda elektroforez işlemini durdurun. kuyu.
Elektroforezden sonra plakaları cihazdan çıkarın. IEF için çözünmüş serumu oluklara ekleyin. Plakaları nemli bir odaya yerleştirin ve buzdolabında (5±3) °C sıcaklıkta 48 saat saklayın.

Agar jelinde inkübasyonun ardından çökelme çizgileri oluşur.

Agar boyama.
Plakaların fotoğrafı temas yöntemi kullanılarak veya iletilen ışık altında çekilebilir veya kurutulup amido siyahı 10 B çözeltisiyle boyanabilir. Bunu yapmak için plakaları küvetlere yerleştirin, %0,9'luk sodyum klorür çözeltisiyle doldurun ve 16-18 dakika bekletin. çökelmemiş proteinlerin yıkanması için saatler. Daha sonra plakaları %0,9 sodyum klorür çözeltisine batırılmış filtre kağıdına sahip agar jeli ile kaplayın ve agar jeli ince bir film haline gelinceye kadar havayla kurutun.
Filtre kağıdını kurutulmuş plakalardan çıkarın ve 30-40 dakika boyunca boya çözeltisi içeren küvetlere yerleştirin. Daha sonra 5-10 dakika boyamanın ardından agar yıkama solüsyonunda yıkayın ve tekrar kurulayın.

Sonuçların muhasebeleştirilmesi.
Sonuçları görsel olarak kaydedin.

Çalışma prensibi ve tasarım
Cihazın çalışma prensibi, bir elektrik alanındaki antijenlerin ve antikorların farklı elektroforetik hareketliliğe sahip olmasıdır.
β-globülinlerin elektroforetik hareketliliğine sahip olan antijenler, pozitif elektrot - anot yönünde hareket ederken, β-globülinlerle ilgili antikorlar, negatif elektrot - katot yönünde hareket eder.
Eşdeğer oranlarda etkileşime giren antijenler ve antikorlar, jel tutucuda, ortamdaki akış yönüne dik olan renksiz bir çökelme çizgisi oluşturur; bu, test serumunda antijenin varlığının veya yokluğunun değerlendirilmesine olanak tanır.
Yapısal olarak cihaz, 30 V ve 60 V çıkış voltajına sahip bir güç kaynağı, 26 numune için bir elektroforetik oda, bir tepsi, jeli doldurmak ve kuyucukları uygulamak için bir cihazdan oluşur.

Çalıştırma prosedürü
Çalışmaya başlamadan önce cihazın açıklamasında verilen tavsiyelere uygun olarak tampon çözeltiler ve agar jeller hazırlanır, jel tutucusu yatay pozisyonda sabitlenir, ardından tutucunun girintileri sıvı jel ile doldurulup, jel sertleşir.
Test serumları jel kuyucuklarına eklenir (bir seferde en fazla 25 numune artı standart test sisteminin kontrol serumunun bulunduğu bir kuyucuk),
Antijenlerin tespiti, cihazın açıklamasında verilen yöntemlere göre ve seçilen elektroforez moduna uygun olarak gerçekleştirilir.
Eğik aydınlatma altında görülebilen bir çökelme çizgisinin varlığı veya yokluğu, test serumunda antijenlerin varlığının veya yokluğunun değerlendirilmesine olanak tanır.
Cihazın açıklaması, antijenleri ve antikorları belirlemek ve ayrıca standart bir antijenin tükenme reaksiyonunda antikorları tanımlamak için 4 yöntem içerir.

ÖZELLİKLER
Cihaz, biri kontrol olmak üzere 26 numunenin eş zamanlı incelenmesini sağlar.
Reaksiyon süresi - hepatit B antijenini belirlerken en fazla 25 dakika
Ana blokların genel boyutları, mm
Güç kaynağı 282*115*95
kamera 87*69*223
palet 264*120*37
Ana blokların ağırlığı, kg
Güç kaynağı / hazne / tepsi 2.2 / 04 / 03
Nominal gerilim ve frekans, V/Hz 220/50
Güç tüketimi, VA, en fazla 25
Cihazın ortalama servis ömrü, yıl 5

Daha detaylı bilgi için üretici firmayla iletişime geçebilirsiniz" İmmünoelektroforez cihazı PIEF-01- 7200 ruble için ELISA analizörü."

İmmünoelektroforetik analiz, agar jel elektroforezi ile immünodifüzyonun bir kombinasyonudur. İmmünoelektroforez için çeşitli seçenekler vardır. İmmünoelektroforez (IEF) ilk olarak 1953'te Grabar ve Williams tarafından tanımlandı. 1955'te Scheidegger, sıradan cam slaytlar kullanılarak bu yöntemin mikro modifikasyonunu önerdi.

IEF prensibi aşağıdaki gibidir. İlk olarak proteinlerin (antijenlerin) elektroforetik ayrımı tamponlu bir agar jelinde gerçekleştirilir; Proteinlerin elektrik alanındaki hareket yönü boyunca voltajın kaldırılmasından sonra, jelde çökeltici bağışıklık serumunun yerleştirildiği bir oluk kesilir. Antijen ve antiserum jel içinde birbirlerine doğru yayılır ve etkileşimlerinin olduğu yerde, sayısı, konumu ve şekli, antijenlerin ilk karışımının bileşimi hakkında fikir veren kavisli çökelme çizgileri belirir.

Klinik immünolojide bu yöntem kullanılarak çeşitli sınıflardaki immünoglobulinlerin konsantrasyonu yarı kantitatif olarak belirlenir ve miyelom proteinleri tanımlanır. IEF ayrıca immün yetmezlik durumlarının tanısında da kullanılır. Yöntem, protein preparatlarının saflaştırma sürecinin tutarlı bir şekilde izlenmesi için vazgeçilmezdir. Ayrıca sıklıkla bu ilaçların orijinalliğini ve saflığını kontrol etmek için de kullanılır.

İki boyutlu (çapraz) elektroforez, karmaşık bir antijen karışımını ayırmak için kullanılır. Yöntem iki aşamayı içermektedir. İlk aşamada proteinler, antikor içeren agaroz jel içerisinde elektrik alanının etkisi altında yayılır. İkinci aşamada, plaka 90° döndürülür ve birinciye dik bir yönde tekrarlı ivmeye tabi tutulur. Bu sayede karışımdaki antijenlerin her birinin kantitatif olarak karakterize edilmesi mümkün olur. Bu yöntem özellikle, SLE'li hastaların serumunda veya romatoid artritli hastaların sinovyal sıvısında kompleman proteini C3'ün, C3c'nin etkisizleştirilmiş formuna dönüşüm derecesinin değerlendirilmesi için kullanılır.

Elektroimmün analiz

Yöntem ilk olarak 1966 yılında Laurell tarafından önerilmiştir. Antiserum içeren agaroz jeli düz bir yüzeye eşit şekilde yayılır. Antijeni içeren ilaç, jeldeki bir dizi ardışık kuyucuğa çeşitli seyreltilerde eklenir. Sabit bir elektrik akımının etkisi altında kuyucuklardan antijenler, immünoglobulinlerle etkileşime girdikleri agaroz katmanına göç eder. Bu etkileşimin bir sonucu olarak, roketi andıran uzun, sivri bir şekil elde eden AG-AT çökeltileri oluşur. Dolayısıyla yöntemin başka bir adı da roket immünelektroforezidir. Çöktürme bölgesinin uzunluğu, diğer şeylerin eşit olması (jel konsantrasyonu, jeldeki antiserum konsantrasyonu, jel tabakasının kalınlığı, elektroforez modu) doğrudan antijen konsantrasyonuna bağlıdır. EIA, vücut sıvılarındaki proteinlerin kantitatif tespiti için kullanılır.

Sayaç elektroforezi

Karşı elektroforez prensibi 1969 yılında Bedarida tarafından AG-AT çökeltilerini tespit etmek için kullanıldı. İmmünopresipitasyon taşıyıcı katmanda meydana gelir ve Uchterlony yönteminin aksine, antijenin antikorla teması serbest difüzyon nedeniyle değil, sabit bir elektrik alanının etkisi altında gerçekleşir. Proteinler amfolitlerdir; Amino asit kompozisyonlarındaki farklılıklar nedeniyle alkali ortamda farklı hızlarda ve farklı yönlerde (anodik, katodik) göç edebilirler. Antijen ve karşılık gelen çökeltici antiserum farklı yönlere göç ederse, jel tabakasında veya selüloz asetat filmi üzerinde birbirlerine doğru hareket etmeleri mümkün hale gelir. Uygulanan gerilime bağlı olarak 30-180 dakika boyunca her iki bileşenin başlangıç kuyuları arasında yağış gözlenir. Karşı immünelektroforez (CIEF), antijenin immünoglobulinlerden farklı bir elektroforetik hareketliliğe sahip olması koşuluyla, çökelten antijen-antijen sistemlerinin tespiti ve tanımlanması için tasarlanmıştır. VIEF, hepatit B viral antijenlerini, bronkopulmoner aspergillozda Aspergillus'a karşı antikorları, N.meningitidis'e karşı antikorları, SLE'de DNA'ya karşı antikorları tanımlamak için kullanılır.

İmmünoelektroforez- antijenlerin niteliksel analizi için yaygın olarak kullanılan yöntemlerden biri. Uygun çökeltici AS'ye sahip olduğundan herhangi bir antijenik karışımı incelemek için kullanılabilir. Özellikle kan serumu, beyin omurilik sıvısı, idrar, süt, organ ekstraktlarından elde edilen proteinlerin yanı sıra bitki ve bakteri kökenli proteinler başarıyla analiz edilir. Klinikte bu yöntem en sık paraproteinemi ve immün yetmezlik durumlarının tanısında kullanılır. Adli tıpta haptoglobin ve gruba özgü Gc bileşeninin sistemlerini analiz etmek için kullanılır.

Araştırma çalışmalarında immünoelektroforez, karmaşık karışımlarda bulunan proteinlerin tanımlanmasında ana yöntem olarak hizmet eder. Protein preparatlarının saflaştırma sürecinin tutarlı bir şekilde izlenmesi için bir yöntem olarak vazgeçilmezdir. Ayrıca sıklıkla bu ilaçların orijinalliğini ve saflığını kontrol etmek için de kullanılır. Doğal olarak bu kadar geniş uygulama alanına sahip bir yöntemin çeşitli yönlerde değiştirilmesi ve geliştirilmesi gerekiyordu. Yeni taşıyıcılar önerildi: agaroz jel, PAGE, selüloz asetat filmler.

Aynı zamanda IEF, enzimleri, karbonhidratları, lipoproteinleri ve nükleoproteinleri tespit etmek için çeşitli spesifik boyama ve florokromlama yöntemleriyle birleştirilmeye başlandı. Diğer analitik yöntemlerle kombinasyonun bir sonucu olarak, disk immünelektroforezi, immünelektrofokalizasyon, radyoimmünoelektroforez vb. ortaya çıktı. Yakın zamanda polispesifik AS kullanılarak kantitatif belirleme için iki boyutlu IEF önerildi. İki boyutlu IEF'nin özel bir modifikasyonu, RIA düzeyine olan duyarlılığını artırabilir. Bu, antijenin 0.1-10 ml'lik küçük cam rezervuarlardan elektroforetik elüsyonu ile elde edilir. Soğutmalı IEF için Wime, ayırma işlemi sırasında otomatik olarak sabit sıcaklık ve akımı koruyan bir cihaz tasarladı.

Bu cihaz, çeşitli maddelerin elektroforetik hareketliliğini belirlemek için çok uygundur. Bu cihazda termoelektrik soğutmanın (Peltier pili) kullanılması özellikle enzimler ve diğer ısıya dayanıklı maddelerle çalışırken tavsiye edilmelidir. Son zamanlarda, iki boyutlu elektroforez kullanarak proteinleri ayırmak için basit bir yöntem önerilmiştir. Çökelmeyen antijen-antikor sistemlerinin belirlenmesi için, elektroforezden sonra antijenlerin sabitlenmesi, antikorların antijenlere bağlanması, bağlı antikorların uzaklaştırılması ve bunların niceliksel olarak belirlenmesi dahil olmak üzere, kademeli IEF adı verilen mAb'lerin kullanımına dayanan bilinen hassas bir yöntem vardır. değerlendirme.

İmmünfiksasyon elektroforezi durumunda antijen değil AT ayrılır. Bu hızlı ve ekonomik bir yöntemdir, özellikle paraproteinemiyi saptamak amacıyla toplu tarama ve protein preparatları elde etmek için uygundur. İEF ile sürecin normal seyrinde aksaklıklar sıklıkla gözlenir ve bunların sebebini anında tespit etmek her zaman mümkün olmaz. Örneğin, yeterince saflaştırılmamış agar kullanılırsa, bu çoğunlukla üç ihlale yol açar: zayıf jel oluşumu, güçlü elektrosmoz, preparatların zayıf renk değişikliği. Yeterince saf olmayan agar her zaman temizlenmelidir. Yeni bir agar kısmı ile çalışmaya başladığınızda öncelikle uygunluğunu test etmelisiniz. Aynı antijenlerin farklı elektroforetik hareketliliklere sahip olduğu ve farklı agar partileri tüketildiğinde farklı şekilde boyandığı sıklıkla bulunur. IEF'deki bozuklukların nedeni, tekrarlanan veya çok uzun ısıtma nedeniyle agarın hidrolizi olabilir.

Hidroliz, jel oluşturma özelliklerinin zayıflaması ve jel yüzeyinde düzensizliklerin ortaya çıkmasıyla kendini gösterir. Yanlış tampon çözeltisi kullanılırsa elektroforetik ayırma etkilenebilir. Tamponların çoğu bakteri ve küfler için iyi bir üreme alanı sağlar. Bu nedenle tampon stoku buzdolabında saklanmalı veya içine koruyucu madde eklenmelidir. Elektroforetik odayı dolduran tampon en az haftada bir kez değiştirilmelidir. Elektrot tamponunu birden çok kez kullanırken, her ayırmadan sonra elektrot kutuplarını değiştirmek gerekir. Oda terminallerindeki voltajın büyüklüğü genellikle jelden geçen akımın fiziksel gücünü değerlendirmeye izin vermez, bu nedenle devreye seri olarak bir miliampermetre bağlanmalıdır. Ayırma işlemi sırasında akım neredeyse her zaman artar. Bu olaya, elektroforez süresi arttıkça artan jelin ısınması neden olur.

Ancak ilk yükselişin ardından devredeki akım düşebilir. Bu genellikle jeli tampona bağlayan filtre kağıdı şeritlerinin kuruması nedeniyle veya hatta jelin kendisinin kuruması nedeniyle oluşur. Bu durumda tamponun iyonik gücünü veya hazne terminallerindeki voltajı azaltmalısınız. Ayrıca elektroforez öncesinde jel plaka ve kağıt şeritlerin polimer film ile sarılmasıyla kuruma önlenebilir. Sabit bir akım gücü (akım stabilizasyonu) sağlayan bir kaynakla çalışmak en uygunudur. IEF sonuçlarının antijenlerin ve antiserumların kalitesine bağlı olduğunu söylemeye gerek yok.

GENEL FARMAKOPE MAKALE

FS 42-3874-99'da belirtilen yöntemin yerine geçmek üzere tanıtıldı

Bu genel farmakope monografisi, biyolojik materyallerin antijenik bileşimini incelemenin yanı sıra, bir agar jelinde immünoelektroforez (IEF) yöntemini kullanarak immünbiyolojik tıbbi ürünlerin (IMP'ler) saflığını, niteliksel ve niceliksel bileşimini belirlemeyi ve bu yöntemleri birleştirmeyi amaçlamaktadır. bölgesel elektroforez ve immünodifüzyon.

Basit veya çift immünodifüzyon yöntemleri kullanılarak jellerde veya selüloz asetat filmlerinde immünoelektroforez sürecinde, çözünür proteinler ve bunlara özgü çökeltici antikorlar arasında bir reaksiyon meydana gelir. Proteinlerin kantitatif tespiti, antikor içeren bir ortamda elektroforez (elektroimmünoassay, elektroimmünodifüzyon, roket immünoelektroforezi) kullanılarak gerçekleştirilebilir. Protein bileşenlerinin antijenik doğası, bilinen belirteçlerle karşılaştırılarak araştırılabilir.

İmmünokimyasal testlerin etkinliği, kullanılan antiserumun özgüllüğüne, titresine ve antijenlere olan afinitesine bağlıdır.

Tipik olarak immünelektroforez, agar (veya agaroz) jel elektroforezinin ardından aynı ortamda çift immünodifüzyonun bir kombinasyonudur. İki boyutlu çift immün difüzyonda, jel içerisinde yuvarlak veya dikdörtgen girintilere yerleştirilen antijen ve antikorlar birbirlerine doğru göç ederek karşılaştıklarında çökelme çizgileri (yaylar) oluşur. Çökelme bantlarının konumu, antijenin difüzyon katsayısına ve antikorlara göre konsantrasyonuna bağlıdır (antikorun difüzyon hızı sabit kabul edilebilir). Bir çökeltinin oluşumu için optimal olan belirli bir antijen ve antikor konsantrasyonu oranına eşdeğerlik bölgesi denir. Bu, net yağış çizgileri oluşturur.

Bağışıklık serumundaki antikorların konsantrasyonu (titre) de önemli ölçüde değişebilir. Karışımın farklı bileşenleri için eşdeğerlik bölgelerinin örtüşmeyeceği bir durum mümkündür. Eşdeğer bir antijen-antikor oranı seçmek için, çok bileşenli karışımların immünoelektroforezinin birkaç göreceli antijen-antikor konsantrasyonunda gerçekleştirilmesi önerilir, çünkü bu tür bir konsantrasyonun kullanılması belirli bileşenleri tespit edemeyebilir.

Agar jel immünoelektroforez yöntemi

Alkolle işlenmiş 90x120 mm ölçülerinde bir cam plaka, nesne sahnesine kesinlikle yatay olarak yerleştirilir. (45±5) 0 C sıcaklığa soğutulan agar jeli bir cam plakaya 18.0-20.0 ml miktarında uygulanır. Oda sıcaklığında sertleştikten sonra 20-30 dakika sonra plaka üzerinde 2,0 - 2,5 mm kalınlığında bir agar tabakası oluşur.

Jel sertleştikten sonra özel bir şablon kullanılarak 1-2 mm çapında 6-7 delik açılır. Kuyucuklar, kuyucuğun hacmini aşmayacak bir hacimde test numunesi ile doldurulur (her test numunesi için 2 kuyucuk). Bu durumda, cam plakanın üst ve alt kuyucuklarına jel - normal insan kan serumu ile bir kontrol numunesi eklenir (“İnsan kan serumundan preparatların fraksiyonel (antijenik) bileşimini belirlemek için test sisteminin standart numunesi) pyronin B (veya farmakope monografında veya düzenleyici belgelerde belirtilen başka bir boya) ile renklendirilmiş, immünoelektroforez" veya farmakope monografındaki veya düzenleyici belgelerdeki talimatlara uygun başka bir kontrol numunesi.

1000 ml kapasiteli ölçüm silindirine 500 ml veronal-medinal veya borat tampon çözeltisi ekleyin, çözeltinin hacmini saf su ile işarete kadar ayarlayın ve karıştırın. Ortaya çıkan çözelti (veya farmakope monografında veya düzenleyici belgelerde belirtilen başka bir tampon çözeltisi), elektroforez cihazının bölmesinin elektrot bölümlerine dökülür.

Hazırlanan jelin bulunduğu plaka, bir elektroforez cihazına yerleştirilir ve birkaç kat filtre kağıdı kullanılarak cihazın elektrot odalarındaki bir tampon çözeltisine bağlanır. Agar kolonları kullanılarak bir plaka üzerindeki agarın elektrot tamponu ile bağlanmasını sağlayan bir elektroforez cihazı tasarımı durumunda, plaka dengeli bir cihaza yerleştirilir ve agar kolonları ve bir jel tabakası ile birleşene kadar erimiş agar ile dökülür. 1 – 2 mm kalınlığında oluşur.

Elektroforez cihazı bir kapakla kapatılır ve güç kaynağı açılır (voltaj 70-200 V, akım 10-40 mA). Elektroforez, albüminin göçüne karşılık gelen pironin B noktası kuyudan 20-25 mm uzakta olana kadar 1.5-3 saat süreyle gerçekleştirilir.

Elektroforezden sonra özel bir şablon kullanılarak agar jelindeki kuyucuklar arasında uzunlamasına “oluklar” (göç yönüne paralel) kesilir. "Oluklara" 0,25 ml çökeltici antiserum eklenir: insan kanının serum proteinlerine karşı (fraksiyonel bileşimi test ederken) veya insan, sığır, at ve domuz kanının serum proteinlerine karşı (gerçekliği doğrulamak için) çok değerlikli serum.

Agar jeli içeren plaka nemli bir odaya yerleştirilir ve 24 - 48 saat boyunca (5 ± 3) 0 C sıcaklıkta tutulur.

Çökeltme reaksiyonuna girmeyen proteinleri yıkamak için agar plakası küvetlere yerleştirilir, %0,9 sodyum klorür çözeltisi ile doldurulur ve 16-18 saat inkübe edilir. Çözelti 3-4 kez değiştirilir. Plaka daha sonra %0,9 sodyum klorür çözeltisinden çıkarılır, %0,9 sodyum klorür çözeltisine batırılmış filtre kağıdıyla kaplanır ve agar jeli ince bir film haline gelinceye kadar havayla kurutulur. Bundan sonra, kurutulmuş jelin bulunduğu plaka, hava kabarcığı bırakmayacak şekilde %0,9 sodyum klorür çözeltisine batırılmış filtre kağıdıyla kaplanır ve oda sıcaklığında veya 40°C'yi aşmayan sıcaklıktaki bir fırında kurutulur. Plaka kuruduktan sonra filtre kağıdı suyla nemlendirilir ve dikkatlice çıkarılır.

Proteinleri boyamak için amido siyah boya 10B veya başka bir uygun boya kullanın (farmakope monografisindeki veya düzenleyici belgelerdeki talimatlara uygun olarak), plakayı 30-40 dakika boyunca boya çözeltisi içeren bir küvete yerleştirin. Daha sonra plaka, renkli arka plan tamamen yok olana kadar 15-40 dakika boyunca agarın yıkanması için bir çözelti (% 2 asetik asit çözeltisi veya başka bir çözelti, düzenleyici belgelerdeki talimatlara uygun olarak) yıkanır ve oda sıcaklığında tekrar kurutulur. veya 40°C'yi aşmayan bir sıcaklıkta kurutma kabininde.

Lipoproteinler Sudan siyahı B ile boyanır. Boyama için, tamamen kurutulmuş plakalar 3 saat boyunca bir boya çözeltisine yerleştirilir, ardından arka plan tamamen temizlenene kadar %50 etanol ile rengi giderilir. Lipoproteinler koyu mavi renkte boyanır. Sudan siyahı B suda çözünmediği ve ıslak jeli lekelediği için boyama tamamen kurumuş bir preparat üzerinde yapılmalıdır.

İnsan immünoglobulin preparatlarının fraksiyonel bileşimini incelerken sonuçların muhasebeleştirilmesi, test numunesinin elektroferogramını kontrol numunesinin elektroferogramı - normal insan kan serumu ile karşılaştırarak görsel olarak gerçekleştirilir (“Fraksiyonelin belirlenmesi için test sisteminin standart numunesi () antijenik) immünoelektroforez yoluyla insan kan serumundan preparatların bileşimi" veya düzenleyici belgelerdeki talimatlara uygun başka bir kontrol numunesi), insan serum proteinlerine karşı serumla düzenlenmiş sayıda çökeltme çizgisi sergilemesi gerekir (kullanıldığında en az 15 çökeltme çizgisi) "İnsan kanı serumu immünelektroforez yönteminden ilaçların fraksiyonel (antijenik) bileşimini belirlemek için standart numune test sistemi"). İnsan immünoglobulin preparatının ana bileşeni, normal insan kan serumunun immünoglobulin G'sine (Ig G) karşılık gelmelidir.

İnsan kanı ürünlerinin orijinalliğini doğrulamak için çalışmalar yaparken sonuçların hesaba katılması, insan, sığır, at ve domuz kanındaki serum proteinlerine karşı serum ile çökelme hatlarının belirlenmesiyle görsel olarak gerçekleştirilir. Yağış çizgileri yalnızca insan serum proteinlerine karşı serumla tespit edilmelidir.

Notlar

0,05 M veronal-medinal tampon çözeltisinin hazırlanması(pH 8,6±0,1). 1000 ml'lik balon jojeye 1,38 g veronal ve 8,76 g medinal ekleyin, işarete kadar saf su ekleyin ve tamamen eriyene kadar karıştırın.

0,05M borat tampon çözeltisinin hazırlanması(pH 8,6±0,1). 1000 ml'lik balon jojeye 6,7 g borik asit, 13,4 g sodyum tetraborat 10-sulu eklenir, işarete kadar saf su eklenir ve karıştırılır.
%1,25 agar jelinin hazırlanması. Agar jeli aşağıdaki yöntemlerden biri kullanılarak hazırlanır:
%1,25'lik bir agar jeli hazırlamak için, iki kat tuz konsantrasyonuyla (sırasıyla 2,76 g veronal ve 1000 ml saf su başına 17,52 g medinal) 0,05 M veronal-medinal tampon (pH 8,6 ± 0,1) kullanın.
%1,25 agar jeli hazırlamak için, iki kat tuz konsantrasyonuna sahip bir borat tampon çözeltisi (pH 8,6±0,1) kullanın (sırasıyla: 1000 ml saf su başına 13,4 g borik asit ve 26,8 g sodyum tetraborat 10-sulu).

1000 ml kapasiteli bir behere 12,5 g agar eklenir, 500 ml saf su ilave edilir ve jel (20±1) 0 C sıcaklıkta bir saat şişmeye bırakılır. Beher içindekiler kaynar su banyosuna konur ve agar tamamen eriyene kadar bekletilir. Jel solüsyonunun hacmi su ile 500 ml'ye ayarlanır, ardından eşit hacimde veronal-medinal veya borat tampon solüsyonu (veya farmakope monografında veya düzenleyici belgelerde belirtilen diğer tampon solüsyonu) eklenir. Agar çözeltisi 2-3 kat gazlı bezden süzülür, 100 μg/ml konsantrasyona kadar tiyomersal eklenir ve 40-50 ml'lik şişelere (iki plaka için gereken miktar) dökülür. Eritilmiş agar berrak olmalıdır.

Amido siyahı 10B boya çözeltisinin hazırlanması. Boya çözeltisi aşağıdaki yollardan biriyle hazırlanır:
1000 ml'lik ölçülü bir şişeye 1,0 g amid siyahı 10B, 450 ml 0,1 M asetik asit çözeltisi, 550 ml 0,1 M sodyum asetat çözeltisi ekleyin ve karıştırın.
1000 ml'lik balon jojeye 1,0 g amid siyahı 10B ve 100 ml buzlu asetik asit ekleyin, hacmi arıtılmış su ile işarete kadar ayarlayın ve karıştırın. 12 saat sonra kağıt filtreden süzün.
Renklendirme çözeltisinin hazırlanması Sudan siyahı V. 1000 ml'lik ölçülü bir şişeye 1.2 g siyah Sudan B, 20 ml 1M sodyum hidroksit çözeltisi, 380 ml saf su ekleyin ve çözeltinin hacmini mutlak etanol ile işarete kadar ayarlayın ve karıştırın. Karışım kısa bir süre kaynatılır, oda sıcaklığına kadar soğutulur ve soğuduktan sonra boya, kapaklı koyu renkli bir şişeye dökülür. Reaktif 3 ay boyunca oda sıcaklığında saklanır.
Agar yıkamak için% 2'lik asetik asit çözeltisinin hazırlanması. 1000 ml'lik balon jojeye 20,0 ml buzlu asetik asit eklenir, çözeltinin hacmi saf su ile işarete kadar ayarlanır ve karıştırılır. Reaktif 3 ay boyunca oda sıcaklığında saklanır.