Определение времени свертывания плазмы крови. Каолиновый тест

Методы исследования свертывающей системы крови включают следующие группы:

1. ориентировочные (общие), дающие представление о состоянии всего коагуляционного каскада в целом и отдельных его этапов (регистрация может производиться визуально или с помощью отдельных приборов - коагулографа, тромбоэластографа и др.);
2. дифференцирующие дефицит отдельных факторов - коррекционные коагуляционные тесты, тесты смешивания исследуемой плазмы крови с плазмой крови больных с заведомо известным дефицитом тех или иных факторов;
3. количественного определения отдельных компонентов системы по их функциональной активности (коагуляционные пробы, исследования на хромогенных и других субстратах) и (или) по иммунологическим маркерам;
4. выявления внутрисосудистой активации процесса свертывания крови и фибринолиза по функциональным признакам или молекулярным маркерам такой активации - выявлению в циркуляции активированных факторов свертывания, продуктов дегрануляции тромбоцитов, расщепления компонентов свертывающей системы крови или их метаболитов, появлению новых антигенных маркеров активированных факторов и их комплексов, ускоренной метаболизации меченых компонентов свертывающей системы крови (сокращению периода их полужизни в циркуляции).

Таким образом, при оценке состояния свертывающей системы крови используются как собственно коагуляционные методики (лабораторные и инструментальные), составляющие основу диагностического процесса, так и иммунологические, радионуклидные и другие виды исследования . При этом во многих случаях компоненты системы могут определяться как по функциональной активности, так и иммунологически - по содержанию соответствующего антигена в крови. Параллельное использование таких методик позволяет дифференцировать формы патологии, связанные с отсутствием синтеза соответствующего фактора свертывания (в этом случае одинаково снижены как его функциональная активность, так и количество антигена), и формы, при которых молекула фактора синтезируется, но она аномальна и функционально неполноценна.

Для обозначения первых форм к номеру соответствующего фактора добавляется знак «-» (например, VIII-, IX- и т. д.), а во втором - знак «+» (например, VIII+, IX+).

Ориентировочные (общие) коагуляционные тесты

Определение времени свертывания крови

Определение времени свертывания крови (предпочтительнее методике Ли-Уайта) - давно применяющийся быстровыполнимый (непосредственно у постели больного) ориентировочный тест, позволяющий выявлять значительные нарушения свертываемости крови, связанные с дефицитом факторов гемокоагуляции (кроме фактора VII) или с действием антикоагулянтов и фибринолитиков. Используется в качестве ориентировочного теста и для контроля за гепаринотерапией, устранения действия гепарина протаминсульфатом. Тест сравнительно низкочувствительный, показатели его нарушаются лишь при выраженном снижении содержания в плазме факторов свертывания (ниже 4-5 %), в связи с чем непригоден для выявления легких форм гемофилии A и B, а также нарушений свертываемости крови при ангиогемофилии, дефиците фактора XI, прекалликреина и высокомолекулярного кининогена. По этим причинам тест не может использоваться для предоперационного обследования больных: при нормальных показателях теста (5-10 мин) возможно возникновение профузных послеоперационных кровотечений.

Время рекальцификации плазмы

Время рекальцификации плазмы - нестандартизированный низкочувствительный тест, менее надежен для выявления гипокоагуляции, чем время свертывания цельной крови. Не может быть рекомендован для диагностики нарушений гемостаза.

Активированное парциальное тромбопластиновое время плазмы

Активированное парциальное тромбопластиновое время плазмы (АПТВ, каолин-кефалиновый тест) - высокочувствительный метод, выявляющий нарушения свертываемости крови при запуске процесса по внутреннему механизму. Избирательно чувствителен к дефициту плазменных факторов свертывания (поскольку дефицит тромбоцитов и фактора 3 тромбоцитов компенсирован вводимым извне кефалином или эритрофосфатидом).

Используется для контроля за гепаринотерапией, предоперационного обследования больных и т. д. Нормативные показатели зависят от используемых образцов кефалина, в большинстве случаев составляют 37-50 с (оптимально - 37-45 с).

Каолиновое время плазмы

Каолиновое время плазмы - тест, сходный с предыдущим, но без добавления в плазму кефалина (эритрофосфатида), в результате чего он чувствителен не только к дефициту плазменных факторов свертывания, но и к недостатку тромбоцитов и фактора 3 тромбоцитов. Ориентировочная оценка активности этого фактора может быть проведена путем сравнения каолинового времени плазмы исследуемого с высоким и низким содержанием тромбоцитов (норма - 57-70 с).

Не рекомендуется использование фосфолипидных компонентов, дающих в АПТВ время свертывания равное 55 с и более, так как при этом резко снижается точность и воспроизводимость тестов, в том числе при количественном определении факторов VIII и IX.

Силиконовое время плазмы

Силиконовое время плазмы - это время рекальцификации плазмы, полученной в условиях силиконирования игл, пробирок, пипеток, т. е. при минимальной контактной активации. Тест чувствителен к гиперкоагуляции-внутрисосудистой активации пусковой контактной фазы (факторов XII и XI), однако это нарушение более четко выявляется путем определения силиконового времени свертывания цельной крови (на основе метода Ли-Уайта либо тромбоэластографической регистрации процесса в силиконированной кювете).

Нормативные показатели зависят от используемого силикона и определяются исследованием крови здоровых людей для каждого его образца отдельно. При выборе силикона лучшим является тот, который в наибольшей степени удлиняет время свертывания крови (плазмы).

Протромбиновое (тромбопластиновое) время плазмы

Протромбиновое (тромбопластиновое) время плазмы (время Квика, протромбиновый индекс) характеризует скорость свертывания рекальцифицированной плазмы крови при запуске процесса по внешнему механизму, т. е. при добавлении тромбопластина мозга человека (или кролика).

Активность тромбопластина стандартизируется на смешанных образцах нормальной (контрольной) плазмы. Чаще всего используются тромбопластины активностью 12-18 с (в классической методике Квика- 12-13 с). Чем слабее тромбопластин, тем больше ошибка метода.

При нормальном протромбиновом времени плазмы тест позволяет выявить изолированный или совокупный дефицит факторов протромбинового комплекса - VII, X, V и II, из которых три фактора (VII, X и II) К-витаминозависимы и их активность снижается под влиянием антикоагулянтов непрямого действия. В связи с этим протромбиновый тест является основным при контроле за дозировкой кумаринов (неодикумарин, или пелентан, синкумар и др.) и других препаратов этой группы (фенилин).

Протромбиновое время остается нормальным при дефиците факторов внутреннего механизма активации протромбиназы - факторов XII, XI, IX, VIII (т. е. при всех видах гемофилии и дефекте Хагемана), а также при дефиците прекалликреина и высокомолекулярного кининогена (ВМ кининогена)

В литературе принято разное обозначение результатов протромбинового теста . Наиболее целесообразно указывать протромбиновое время исследуемой и контрольной плазмы крови в секундах (что дает информацию и об активности использованного тромбопластина). Иногда пользуются соотношением этих двух величин, т. е. индексом (ПВ исследуемой плазмы, с,)/(ПВ контрольной плазмы, с) , (норма 0,9-1,1).

Другой формой оценки этого показателя, которой наиболее широко пользуются в лабораториях, является вычисление протромбинового индекса в процентах путем составления обратной арифметической пропорции (норма - 90-110%), однако такой расчет является неправильным, так как между концентрацией факторов свертывания и временем свертывания имеется не арифметическая, а логарифмическая зависимость. Кроме того, протромбиновый тест чувствителен лишь к снижению факторов свертывания ниже 50 % их нормальной величины. В силу этого целесообразно использование определения протромбинового индекса в процентах по кривой разведения (1:2, 1:4, 1:8 и т. д.) смешанного образца нормальной плазмы. Такая кривая строится однократно для тромбопластинов разной исходной активности (от 12 до 18 с) и по ней определяется протромбиновый индекс у исследуемых больных. Преимущество такой методики состоит также в том, что результаты всех исследований, в том числе и выполняемых в динамике в разные дни, соотносятся не к случайным различным образцам нормальной плазмы крови, а к усредненным одним и тем же стандартным параметрам, вследствие чего существенно уменьшается ошибка метода. Индексы, полученные по пропорции и по кривой разведения нормальной плазмы, совершенно не соответствуют друг другу. Это следует учитывать и при контроле за действием непрямых антикоагулянтов, ибо снижение обычного индекса до 50 % примерно соответствует снижению индекса по кривой разведения до 25-30 % В связи с этим в анализах всегда следует указывать, как рассчитывался протромбиновый индекс, каковы его нормативные показатели для тромбопластина данной активности.

Тромбиновое время плазмы

Тромбиновое время плазмы, т. е. время свертывания цитратной плазмы при добавлении к ней тромбина стандартной активности, является основным тестом для оценки конечного этапа свертывания крови. Учет этого показателя важен для правильного толкования всех остальных коагуляционных тестов, ибо нарушение конечного этапа свертывания крови неизбежно должно привести к удлинению времени свертывания во всех перечисленных выше методиках.

В большинстве случаев при проведении тромбинового теста используется такая концентрация раствора тромбина, которая при смешивании с равным объемом плазмы крови дает свертывание за 12- 18 с, но при распознавании дисфибриногенемий используются и более слабые его концентрации (приводящие к свертыванию за 30-35 с).

Тромбиновое время - важный диагностический показатель, нарушение его наблюдается как при врожденных, так и при часто встречающихся приобретенных (вторичных) гипопротромбинемиях, при большинстве дисфибриногенемий, а также под влиянием гепарина, продуктов фибринолиза (ПДФ) и ряда других антитромбинов и ингибиторов самосборки мономеров фибрина. В силу этого тромбиновое время в первую очередь и в большей степени нарушается при острых и подострых ДВС-синдромах, что играет важную роль для экспресс-диагностики этой патологии.

Аутокоагуляционный тест

Аутокоагуляционный тест (АКТ) - высокочувствительный двухступенчатый, характеризует процесс свертывания крови при запуске его по внутреннему механизму. Как и АПТВ, тест не чувствителен к дефициту фактора VII, но вместе с тем его показания не зависят от содержания фибриногена (фактора I) в исследуемой плазме крови, чем он отличается от всех остальных ориентировочных коагуляционных проб.

Другое достоинство АКТ состоит в том, что исследуется разведенная кровь, благодаря чему существенно повышается чувствительность теста к дефициту факторов свертывания и, кроме того, выполнение АКТ не требует использования каолина и кефалина, поскольку стандартизация контактной и фосфолипидной активации в нем достигается гемолизатом собственных эритроцитов исследуемого.

Сущность АКТ состоит в том, что к 2 мл гипотонического раствора (0,222 %) хлорида кальция добавляется 0,1 мл крови исследуемого.

В этой гемолизат-кальциевой смеси происходит образование протромбиназы и тромбина, активность которых определяется последовательным добавлением 0,2 мл этой смеси к 0,2 мл плазмы исследуемого (через каждые 2 мин на протяжении первых 10 мин, а затем - через каждые 10 мин в течение 1 ч).

Плазма исследуемого является источником фибриногена, на котором тестируется активность образующегося в смеси тромбина. Как показали многочисленные исследования, она может быть заменена плазмой крови здоровых людей или раствором фибриногена. В этом случае расход крови больного сокращается до 0.1-0,2 мл (может быть взята из пальца!), что трансформирует аутокоагуляционный тест в микрокоагуляционный (МКТ) и делает его очень удобным для использования в педиатрии, в том числе при исследовании гемостаза у новорожденных.

Коагуляционная активность в АКТ и МКТ вначале нарастает и у здоровых людей обычно достигает максимума к 10-й минуте, инкубация кровь-кальциевой смеси (ККС), когда свертывание субстратной плазмы происходит за 10±1 с. Затем коагуляционная активность ККС начинает снижаться, что свидетельствует об инактивации образовавшегося в ней тромбина. При гемофилиях, действии гепарина и других нарушениях свертываемости коагулирующая активность ККС резко снижается, а максимум перемещается с 10-й минуты на более поздний срок. При гиперкоагуляции наблюдается более раннее и более значительное нарастание тромбиновой активности в ККС.

При проведении теста в одной пробирке (определение только на 10-й минуте инкубации ККС) он может быть использован для контроля за гепаринотерапией. Преимущество этой методики перед тестом активированного парциального тромбопластинового времени состоит в том, что в ней нивелируется неодинаковое влияние разных кефалинов на гепариновое время свертывания.

На основе АКТ (МКТ) разработана простая и точная методика дифференциальной диагностики гемофилий.

С помощью приводимых в справочниках переводных таблиц показания АКТ (МКТ) могут быть выражены в процентах и изображены в виде графика - аутокоагулограммы.

Для оценки ряда общих параметров свертываемости крови широко используются и инструментальные методы исследования, преимущественно с применением различных коагулографов и тромбоэластографов.

Тромбоэластография дает представление не только о временных параметрах свертывания крови или плазмы, но и о структуре и механических свойствах образующихся сгустков. В последние годы и в аппаратные методы регистрации вводится стандартизация контактной и фосфолипидной активации процесса свертывания. Создаются также коагулограммы для массового выполнения общих коагуляционных тестов - АПТВ, протромбинового, тромбинового и других с автоматической записью результатов.

Методы дифференциации дефицита различных факторов свертывания и их количественного определения

Приведенные ниже в таблице данные показывают, что ориентировочное исследование свертываемости крови с помощью трех основных тестов позволяет провести групповое разграничение дефицита различных плазменных факторов гемокоагуляции. Так, замедление свертываемости только в протромбиновом тесте (I тип нарушения) при нормальных показаниях всех остальных характерно для наследственного дефицита фактора VII либо для снижения уровня этого фактора на ранних этапах развития механической желтухи или в первые 1-2 дня лечения антикоагулянтами непрямого действия, когда подавление синтеза фактора VII опережает в своем развитии снижение уровня всех остальных К-витаминозависимых факторов свертывания.

Нарушение только внутреннего механизма свертывания, т. е. активированного парциального тромбопластинового времени и АКТ (II тип), наблюдается при дефиците факторов XII, XI, IX, VIII, Виллебранда (не при всех формах), прекалликреина и ВМ кининогена. Из них при наследственных дефектах свертываемости дефицит факторов XII, прекалликреина и ВМ кининогена наблюдается крайне редко и не сопровождается какой-либо кровоточивостью, тогда как дефицит факторов VIII (гемофилия А), IX (гемофилия В) и фактора Виллебранда встречается очень часто (составляет более 96 % всех наследственных коагулопатий) и сопровождается выраженной кровоточивостью. Между ними в первую очередь и проводится дальнейшая дифференциальная диагностика.

Дефицит фактора XI встречается сравнительно редко (около 0,5-1,0 % всех гемофилий), протекает с очень слабо выраженной кровоточивостью (в основном после травм и операций) и занимает промежуточное место между первой подгруппой бессимптомных нарушений и гемофилиями и болезнью Виллебранда.

Еще один тип нарушений характеризуется удлинением как парциального тромбопластинового времени и АКТ, так и протромбинового времени. Он характерен для дефицита факторов V, X или II либо для комплексного дефицита всех К-витаминозависимых факторов (VII, X, IX, II), что наблюдается при механической желтухе и других видах К-витаминной недостаточности, а также при приеме антикоагулянтов непрямого действия.

И наконец, как видно из той же таблицы, возможно нарушение показаний всех трех тестов (IV тип), что наблюдается при наследственных и приобретенных гипо- и дисфибриногенемиях (не всех), при приеме антикоагулянтов прямого действия (гепарина, гепариноидов, гирудина и др.), лечении активаторами фибринолиза и дефибринирующими препаратами (стрептокиназа, урокиназа и др.), появлении в крови патологических антитромбинов и веществ, препятствующих соединению (сборке) фибрин-мономеров - парапротеинов, криоглобулинов, иммунных комплексов, а также при сложных нарушениях свертываемости, обусловленных ДВС-синдромом. При этом тромбиновое время часто нарушается в большей степени и несколько раньше, чем другие тесты.

При учете давности заболевания и возможности его наследственного генеза либо вторичной связи с другими видами патологии и лекарственными или иными воздействиями, наличия или отсутствия кровоточивости и ее типа удается правильно определить генез этих глубоких нарушений свертывания крови.

Все дифференцирующие тесты основаны на принципе коррекции , т. е. на определении, в какой степени выявленное нарушение свертываемости крови устраняется или, наоборот, не устраняется образцами плазмы крови или искусственно полученными препаратами крови с заведомо известным дефицитом того или иного фактора свертывания.

С этой целью специализированные лаборатории создают для себя коллекции фактородефицитных плазм крови, получая их от больных с заведомо установленным глубоким (менее 1 %) дефицитом каждого из факторов и хранят их в мелкой расфасовке (по 0,5 мл) при температуре - 30 °С. При необходимости эти образцы размораживают и используют в диагностических тестах.

Плазма, подвергшаяся случайному размораживанию или оставшаяся неиспользованной, повторному замораживанию не подлежит. В коррекционных тестах не следует использовать плазму с иммунными ингибиторами того или иного фактора. В диагностических наборах ряда фирм содержатся лиофильно высушенные образцы плазмы крови с дефицитом определяемых факторов свертывания (субстратные плазмы). Однако многие нарушения свертываемости крайне редко наблюдаются в клинической практике, в связи с этим используются искусственно приготовленные компоненты нормальной крови с дефицитом тех или иных факторов свертывания, а также гетерогенные плазмы (цыплят, утят и др.).

В таблице приведены сведения о содержании факторов свертывания крови в компонентах крови, используемых для проведения коррекционных коагуляционных тестов в зависимости от сроков их хранения. Пользуясь этой таблицей, легко расшифровать показания любого из трех основных коагуляционных тестов. В коррекционных методиках такого рода используются тесты, стандартизированные по контакту и фосфолипидной активации, т. е. каолин-кефалиновые или с применением гемолизата (в АКТ).

Тесты смешивания плазмы крови больного с плазмой, имеющей заведомо известный дефицит того или иного фактора

Определяют активированное парциальное тромбопластиновое время в исследуемой плазме крови, нормальной плазме (контроль) и в плазме с заведомо известным дефицитом факторов VIII (от больного гемофилией А), IX (от больного гемофилией В), XI и XII. Затем готовят смесь из образцов цитратной плазмы исследуемого (7/10 объема) и последовательно с каждой из дефицитных плазм (3/10 объема), начиная с дефицита фактора VIII и IX (наиболее частые формы патологии! ).

К смеси добавляют каолин и кефалин, и через 2 мин подвергают ее рекальцификации (при температуре 37 °С). В той смеси, где активированное парциальное тромбопластиновое время не нормализуется, имеется один и тот же дефект свертывания.

Так, если у обследуемого больного активированное парциальное тромбопластиновое время не нормализуется добавлением плазмы крови больного с заведомо известным дефицитом фактора VIII, но корригируется плазмой крови больного с дефицитом фактора IX, у него имеется гемофилия А .

Аналогично, но на основе протромбинового теста дифференцируют дефицит факторов протромбинового комплекса (X, V, VII и II).

Тест генерации тромбопластина

Для дифференциации нарушений внутреннего механизма свертывания крови чаще всего используется классический тест генерации тромбопластина с заменой тромбоцитарного компонента, приготовление которого требует значительной затраты времени и крови, кефалином Недостатками теста генерации тромбопластина являются его громоздкость, необходимость приготовления большого числа реагентов, значительная затрата времени на его выполнение.

Коррекционный тест, основанный на базе аутокоагуляционного теста.

Задачам экспресс-диагностики вполне отвечает другой коррекционный тест, основанный на проведении коррекции теми же компонентами нормальной крови на базе аутокоагуляционного теста.

Этот тест отличается высокой надежностью, быстротой и легкостью выполнения и требует небольшого (не более 0,5 мл) количества крови исследуемого, что позволяет использовать его в педиатрической практике.

В нем, как и в тесте генерации тромбопластина, используют для коррекции адсорбированную плазму и старую сыворотку крови, которую повторно центрифугируют перед проведением исследования. В три пробирки разливают по 2 мл 0,222 % раствора хлорида кальция и в две из них добавляют 0,1 мл адсорбированной нормальной плазмы крови (1-я пробирка) и 0,1 мл старой нормальной сыворотки крови (2-я пробирка). В три другие пробирки вносят по 0,2 мл нормальной цитратной плазмы. Затем во все пробирки с раствором хлорида кальция добавляют по 0,1 мл цитратной крови исследуемого.

Ровно через 4 мин инкубации этой смеси ее свертывающую активность тестируют на нормальной плазме.

Резкое снижение коагулирующей активности только в первой пробирке (с нормальной BaSO 4 -плазмой) свидетельствует о наличии у больного дефицита фактора IX (гемофилия В), только во второй пробирке (со старой сывороткой) - о дефиците фактора VIII (гемофилия А); если коррекция происходит в обеих пробирках (одинаково сильная), то, очевидно, имеется дефицит фактора XI или XII (см. табл. 14).

Данный тест высокочувствителен, так как исследование проводится на разведенной в 20 раз крови при компенсации фактора 3 тромбоцитов гемолизатом. Единственный используемый реактив - гипотонический раствор хлорида кальция, что делает пробу общедоступной.

Столь же простой является методика коррекционных проб, выполняемых на основе протромбинового теста для дифференциации дефицита факторов II, V и VII+, X (в таблице).

Для того чтобы разграничить дефицит факторов VII и X, выполняется дополнительный коагуляционный тест с добавлением к исследуемой плазме крови раствора яда змеи гюрзы - препарат лебетокс (подбирается такая концентрация яда, которая в присутствии кефалина и хлорида кальция вызывает свертывание за 20-25 с; все ингредиенты берутся в количестве 0,1 мл и смешиваются) (таблица ниже).

С этой же целью используется препарат яда гадюки Расселла, обитающей в Индии (препарат стипвен ).

Дифференциальную диагностику завершают при необходимости количественным определением дефицитных факторов или их специфических иммунных ингибиторов, для чего применяются специальные высокочувствительные стандартизированные методики. В этих методиках используется построение кривых разведения смешанных образцов нормальной плазмы крови с коррекцией дефицита всех факторов, кроме исследуемого. По этим кривым определяется активность исследуемого фактора в плазме больных.

Особенно важно количественное определение концентрации факторов VIII и IX, а также наличия их ингибиторов у больных гемофилией А и В (особенно до и во время хирургических вмешательств и при проведении интенсивной заместительной терапии), а также при отсроченных профузных послеродовых кровотечениях, когда приходится дифференцировать ДВС-синдром и более редкую патологию - появление иммунного ингибитора фактора VIII (еще намного реже - фактора V).

При глубоком дефиците фактора XIII (очень редкая наследственная патология) все коагуляционные пробы нормальны, но сгустки растворяются в 5М или 7М мочевине.

Помогает дифференцировать дефицит различных факторов свертывания также и учет степени и, особенно, сроков нормализации показаний тестов после внутривенного введения больным препаратов крови, т. е. учет коррекции in vivo по методике Л. 3. Баркагана .

Особенно эффективна эта методика при большой разнице продолжительности жизни дифференцируемых факторов в циркуляции. Так, продолжительность полужизни факторов протромбинового комплекса варьирует от нескольких часов (фактор VII) до нескольких дней (фактор II). Промежуточное положение между ними занимают факторы X (2-2,5 дня) и V (12-18 ч).

Поэтому после массивной струйной трансфузии плазмы протромбиновый индекс повышается при дефиците фактора VII очень кратковременно, при дефиците фактора V - несколько более длительно (примерно в 4-6 раз), а при дефиците факторов X и, особенно, II на более продолжительный срок (свыше 1-2 суток). Показательно в этом отношении и влияние на протромбиновый индекс препарата ППСБ (концентрата факторов VII, IX, X и II). Он также кратковременно нормализует протромбиновое время при дефиците фактора VII и более длительно (во много раз!) при дефиците факторов X и II. Поскольку в этом препарате отсутствует фактор V, данный дефицит им не корригируется.

Аналогичное различие выявляется при трансфузионной и заместительной терапии факторов внутреннего механизма свертывания (XII, XI, IX и VIII), что регистрируется активированным парциальным тромбопластиновым тестом.

Особый интерес представляет динамика коррекции уровня фактора VIII и показаний АПТВ при трансфузионной терапии гемофилии А и болезни Виллебранда . При первом из этих заболеваний выявляется немедленное максимальное улучшение свертываемости после трансфузии (струйно, быстро!) антигемофильной плазмы или введения криопреципитата, а затем довольно быстрое (за 10-18 ч) неуклонное снижение ее, тогда как при болезни Виллебранда наблюдается некоторое нарастание свертывающей активности в течение нескольких часов после трансфузии, а затем ее снижение - намного более медленное, чем при. В связи с этим при лечении болезни Виллебранда более редко прибегают к заместительным трансфузиям, чем при гемофилии А.

Исследование функциональной активности факторов свертывания и компонентов калликреин-кининовой и фибринолитической систем с помощью хромогенных субстратов

Методы основаны на исследовании активности протеолитических ферментов и их ингибиторов, участвующих в свертывании крови, фибринолизе и образовании кининов, по интенсивности и скорости расщепления специфически чувствительных к этим ферментам пептидов, при деградации которых освобождается красящий агент (β-нитроанилин).

Степень окраски реагирующей смеси определяется спектрофотометрически, и по ее интенсивности судят об активности соответствующих ферментов (факторов свертывания, калликреина, плазмина и др.), а по торможению процесса - об активности ингибиторов ферментов.

Так, например, действие гепарина и антитромбина III может быть оценено по ослаблению расщепления хромогенных субстратов фактором Xa или тромбином, а активность α 2 -антиплазмина - по ослаблению действия плазмина на соответствующий хромогенный субстрат. Хромогенные субстраты либо имеют цифровое обозначение (например, s-2222), либо именуются хромозинами с сокращенной приставкой, обозначающей тот фермент, к которому чувствителен этот субстрат (например, Chromozym PL - субстрат плазмина, Chromozym TH - субстрат тромбина, Chromozym PK - субстрат прекалликреина/калликреина и т. д.).

Хромогенные субстраты расширяют возможности исследования системы гемостаза, но пока недостаточно доступны для многих лабораторий. Некоторые исследования, выполненные с их помощью, не имеют преимуществ перед обычными коагуляционными тестами и дают совпадающие с ними результаты; в других случаях их использование упрощает и ускоряет исследование, делает его более точным; в третьих - эти методики имеют самостоятельное значение и не могут быть заменены коагуляционными тестами (например, определение прекалликреина).

Иммунологическое определение компонентов системы гемостаза

Иммунологическое определение компонентов системы гемостаза выполняется методами:

• Иммунопреципитации;
• Иммуноэлектрофореза;
• Радиоиммунологическими и другими с соответствующими антисыворотками

При этом оценивается содержание в плазме крови антигена того или иного фактора свертывания (или его фрагментов), а не функциональная активность, которая может быть резко сниженной при нормальном содержании антигена в плазме. Такая ситуация характерна для всех тех случаев, когда в организме синтезируются аномальные (функционально неполноценные) факторы, сохраняющие свою антигенность, но лишенные способности участвовать в гемостазе.

Это позволяет разграничивать полное прекращение синтеза соответствующих факторов и образование их аномальных форм.

Вместе с тем ряд компонентов системы гемостаза может определяться только иммунологически.

В эту группу входят такие важные исследования, как определение следующих компонентов:

• β-тромбоглобулина;
• α2-макроглобулина;
• протеинов C и S;
• антигенов факторов VIII:C и VIII:R cof ;
• продуктов фибринолиза (ПДФ);
• неоантигенов комплексов тромбин - антитромбин III и плазмин - антиплазмин;
• ряд других тестов.

Поэтому иммунологическое исследование существенно дополняет функциональную оценку разных звеньев системы гемостаза.

Диагностические тесты, основанные на использовании в качестве реагентов препаратов из змеиных ядов

Давно установлено, что яды многих змей содержат высокоактивные протеолитические ферменты, вызывающие свертывание крови и воздействующие на разные звенья коагуляционного каскада. Вследствие этого змеиные яды и выделенные из них коагулазы широко используются для распознавания нарушений гемостаза, количественного определения факторов свертывания, выявления и количественного определения растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК) и ряда других исследований.

Пробы со змеиными ядами часто намного упрощают и делают более оперативной диагностику нарушений гемостаза.

В таблице приведены данные о механизме действия ядов на свертывающую систему крови и возможностях диагностического использования каждого из них.

Эти возможности еще более расширяются при одновременном использовании нескольких ядов и простейших общих коагуляционных тестов. Так, например, одновременное применение коагуляционных проб с ядом гюрзы и эфы позволяет легко дифференцировать дефицит факторов VII, Х-V и II (в таблице ниже), а с дополнительной коррекцией профильтрованной нормальной плазмой (источник факторов V и II) -дефицит факторов X и V.

Определение основных физиологических антикоагулянтов

Наиболее важное значение имеет определение активности основного физиологического антикоагулянта - антитромбина III, снижение которой может быть генетически обусловленным (первичная тромбофилия) либо вторичным вследствие интенсивного потребления (ДВС-синдром, массивные тромбозы) или ускоренного метаболизма (лечение гепарином, L-аспарагиназой, синтетическими контрацептивными средствами) и блокады иммунными комплексами, парапротеинами, фибронектином, белками острой фазы.

В любом случае снижение активности антитромбина III ниже 60-65 % поддерживает внутрисосудистое свертывание крови, делает менее выраженным антикоагулянтное действие гепарина. Вместе с тем очень часто между уровнем антитромбина III и снижением чувствительности к гепарину нет закономерного соответствия.

При этом обычно ослабление антикоагулянтного действия гепарина существенно преобладает над степенью снижения активности антитромбина III. Доказано, что при разных формах дефицита антитромбина III сродство его к гепарину может меняться в различной степени. Кроме того, разные фракции гепарина, соотношение которых в лекарственных средствах весьма изменчиво, также имеют различное сродство к антитромбину III. Поэтому практически важно исследовать как собственно активность антитромбина III, так и его способность превращаться под влиянием гепарина в быстродействующий антикоагулянт.

Антикоагулянтная активность антитромбина III

Антикоагулянтная активность антитромбина III определяется по способности исследуемой плазмы крови (разведенной - метод Копли-Винтерштейна или дефибринированной тепловой денатурацией при температуре 56 °С - методы Лолигера, Абильдгаарда и др.) инактивировать в течение определенного срока вводимый извне тромбин. Остаточная активность тромбина в такой плазме может определяться по ее свертывающей активности (на фибриногене, адсорбированной сульфатом бария плазме) либо по расщеплению хромогенного субстрата, чувствительного к тромбину или фактору Xa (поскольку антитромбин III инактивирует и этот фактор).

Гепарин-кофакторная активность

Гепарин-кофакторная активность содержащегося в плазме крови антитромбина III длительный период определялась с помощью теста толерантности плазмы к гепарину, который может считаться ориентировочным, поскольку дает очень большой разброс нормальных показателей и недостаточно воспроизводим.

Значительно более точны и воспро изводимы тесты, в которых исследуется влияние различных концентраций гепарина на тромбиновое время исследуемой плазмы, содержащей небольшое количество тромбоцитов. Сравнение проводится с удлинением тромбинового времени контрольной нормальной плазмы крови, к которой добавляются те же образцы гепарина.

Так, в тромбин-гепариновом тесте к исследуемой плазме крови добавляются такие количества гепарина, которые в контроле удлиняют тромбиновое время с 15 до 32-35 с (малая концентрация) и до 95-110 с (высокая концентрация гепарина). По этим данным рассчитываются индексы активности антитромбинов плазмы (ААП) и антикоагулянтного резерва плазмы (АРП).

Также широко используются сходные методики с оценкой степени инактивации тромбина как в коагуляционных тестах, так и на хромогенных субстратах.

Иммунологическое определение антигена антитромбина III

Иммунологическое определение антигена антитромбина III позволяет дифференцировать различные виды тромбофилии:

• с недостаточным синтезом антитромбина III (уровень антигенного маркера снижен адекватно снижению активности);
• с сохраненным синтезом аномальных и функционально неполноценных его форм (уровень антигенного маркера намного выше, чем активность).

Протеины C и S, тромбомодулин и α 2 -макроглобулин определяются иммуноэнзиматическими методами.

КОАГУЛЯЦИОННЫЙ ГЕМОСТАЗ

Вторичный, или коагуляционный, гемостаз обеспечивает плотную закупорку поврежденных сосудов красным тромбом , состоящим из сети волокон фибрина с захваченными ею клетками крови (тромбоцитами, эритроцитами и др.).

Упрощенная схема свертывания крови:
1)под влиянием «активатора протромбина» - тромбокиназы, образующейся при повреждении тканей, агрегации и разрушении тромбоцитов, и в результате сложных химических взаимодействий факторов свертывания крови, белок плазмы протромбин превращается в тромбин
2)тромбин в свою очередь, расщепляет растворенный в плазме фибриноген с образованием фибрина, волокна фибрина образуют основу тромба
Через несколько часов они активно сжимаются - происходит ретракция сгустка, в результате которой из него выдавливается светлая жидкость - сыворотка.

Свертывание крови в целом представляет собой многоступенчатый каскадный процесс , протекающий с участием многочисленных факторов свертывания. Все факторы присутствуют в плазме в неактивной форме. Они обозначаются римскими цифрами и соответствующими названиями, в которых отражена их функция. Для обозначения активированных факторов свертывания добавляется буква «а».

Следует помнить также , что фактор VI изъят из классификации, так как представляет собой активированный фактор V. Некоторые из факторов свертывания не имеют цифровых обозначений.

Процесс свертывания крови принято условно разделять на две основные фазы:
Фаза активации - многоступенчатый этап свертывания, завершающийся активизацией протромбина (фактор II) с превращением его в активный фермент тромбин (фактор IIа).
Фаза коагуляции - конечный этап свертывания, в результате которого под влиянием тромбина фибриноген (фактор I) превращается в фибрин.

Фаза активации

Центральным звеном сложных химических превращений этой фазы является образование так называемого «активатора протромбина», который представляет собой ферментный комплекс, состоящий из активированных факторов свертывания Ха, Va, ионов Са2+ и фосфолипопротеидов.

Источником последних могут быть:
фосфолипопротеиды , высвобождающиеся при повреждении тканей, в частности, эндотелия сосудов или соединительной ткани (тканевой тромбопластин - фактор III)
фосфолипопротеиды мембран тромбоцитов, выходящие в плазму при их разрушении (тромбоцитарный фактор 3)

Таким образом, формирование ключевого ферментного комплекса этой фазы - «активатора протромбина» - происходит двумя путями, в соответствии с которыми различают две системы свертывания:
1.Внешняя система , которая активируется при повреждении тканей в течение нескольких секунд. Фосфолипопротеиды, выходящие из тканевых клеток (тканевой тромбопластин, или фактор III), в присутствии ионов Са2+ активируют фактор VII (проконвертин). Последний в комплексе с фосфолипопротеидами поврежденной ткани и ионами Са2+, в свою очередь, активирует фактор Х, входящий затем в состав “активатора протромбина”.
2.Внутренняя система , активация которой происходит несколько медленнее (в течение минут) и без участия тканевого тромбопластина. Пусковым фактором этого механизма является фактор XII (фактор Хагемана), который активируется двумя путями:
при контакте крови с коллагеном субэндотелия поврежденного сосуда или с любой чужеродной поверхностью (стеклом, металлом, каолином и т. д.)
при ферментативном расщеплении фактора Хагемана протеолитическими ферментами (калликреином, тромбином, трипсином и др.) с участием высокомолекулярного кининогена (ВМК)

Фактор ХIIа активирует фактор XI. Последний, в свою очередь, активирует фактор IX. Наконец, фактор IХа образует ферментный комплекс с фосфолипопротеидами, высвобождающимися при разрушении тромбоцитов (т. е. с тромбоцитарным фактором 3), который в присутствии ионов Са2+ и плазменного фактора VIIIа (фактора Виллебранда) активирует фактор X. Последний также входит в состав “активатора протромбина”. Образовавшийся двумя путями ключевой ферментный комплекс - “активатор протромбина” - протеолитически расщепляет неактивный предшественник протромбин (фактор II) (молекулярная масса 72 000), в результате чего образуется активный протеолитический фермент тромбин (молекулярная масса 35 000), представляющий собой пептидазу. Действие тромбина не ограничивается только протеолизом фибриногена на следующем этапе свертывания крови. Тромбин способствует также необратимой агрегации тромбоцитов, а также активирует ряд факторов свертывания (V, VIII, XIII). Следует помнить, что внешний и внутренний механизмы свертывания взаимосвязаны между собой: между отдельными их этапами существуют своеобразные «мостики» - альтернативные пути для процессов коагуляции. Так, комплекс факторов ХIIа–калликреин–кининоген (внутренний механизм) ускоряет активацию фактора VII (внешний механизм), а фактор VIIa ускоряют активацию фактора IX (внутренний механизм).

Фаза коагуляции

В течение этой фазы происходит образование фибрина из его предшественника фибриногена.

Процесс протекает в два этап:
на первом этапе - фибриноген расщепляется тромбином на четыре растворимых мономера фибрина (по два пептида А и В), у каждого из которых имеются по 4 свободные связи
на втором этапе - мономеры соединяются друг с другом, формируя полимеры, из которых строятся волокна фибрина

Процесс необратимой полимеризации фибрина происходит с участием фибриностабилизирующего фактора XIII в присутствии ионов Са2+.

Однако на этой стадии трехмерная сеть волокон фибрина, которая содержит эритроциты, тромбоциты и другие клетки крови, все еще относительно рыхлая. Свою окончательную форму она принимает после ретракции сгустка, возникающей при активном сокращении волокон фибрина и выдавливании сыворотки. Благодаря ретракции сгусток становится более плотным и стягивает края раны.

!!! Следует упомянуть еще об одном возможном пути превращения фибриногена в фибрин на конечной стадии свертывания крови - о так называемом феномене паракоагуляции, который наблюдается, например, при синдроме диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС-синдроме).

В отличие от обычного (описанного выше) процесса полимеризации волокон фибрина из его мономеров, при этом синдроме значительно снижается чувствительность к тромбину и нарушается процесс полимеризации фибрин-мономеров. Это происходит в результате того, что часть фибрин-мономеров образуют с фибриногеном и продуктами его распада комплексные крупно- и среднемолекулярные соединения - растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК). Они плохо реагируют на действие тромбина, обладая относительной тромбинрезистентностью, но образуют гель при добавлении к плазме этанола, протаминсульфата или бета-нафтола. Это и есть феномен неферментативного свертывания, или феномен паракоагуляции. Выявление РФМК имеет важное значение для диагностики ДВС-синдрома.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ свертывающей системы крови

Для определения состояния гемокоагуляции используют несколько групп методов:
ориентировочные (базисные) методы, характеризующие процесс свертывания в целом, отдельные его фазы, а также дающие возможность оценить внешний и внутренний механизмы коагуляции
методы, позволяющие дифференцировать дефицит отдельных факторов свертывания крови
методы, позволяющие выявить внутрисосудистую активацию системы свертывания крови

К базисным методам относятся:
1.определение времени свертывания крови
2.определение времени рекальцификации стабилизированной крови (плазмы)
3.протромбиновое время (протромбиновый индекс)
4.тромбиновое время

1. Время свертывания крови

1.1 Определение времени свертывания цельной нестабилизированной крови проводится непосредственно у постели больного.

Иглой без шприца пунктируют локтевую вену. Первые капли крови выпускают на ватный тампон и набирают по 1 мл крови в 2 сухие пробирки. Включив секундомер, ставят пробирки в водяную баню при температуре 37°С. Через 2–3 мин, а затем каждые 30 с пробирки слегка наклоняют, определяя момент, когда кровь свернется. Определив время образования сгустка крови в каждой из пробирок, вычисляют средний результат.

В норме время свертывания составляет 5–10 мин.

!!! Удлинение времени свертывания свидетельствует о значительных сдвигах в системе гемокоагуляции и чаще указывает на:
выраженную недостаточность факторов, участвующих во внутреннем механизме коагуляции
дефицит протромбина
дефицит фибриногена
наличие в крови ингибиторов свертывания, в частности гепарина

1.2 Метод Моравица
В клинике до сих пор используется еще один упрощенный метод определения времени свертывания крови. Он применяется, в основном, для динамического контроля за состоянием гемокоагуляции при лечении прямыми антикоагулянтами.

На предметное стекло наносят каплю крови, взятую из пальца или мочки уха. Включив секундомер, каждые 20–30 с в каплю крови опускают тонкий стеклянный капилляр. Время свертывания определяют в момент появления первой тонкой нити фибрина при вытягивании капилляра из капли крови.

В норме свертывание крови составляет около 5 мин.

2. Активированное время рекальцификации плазмы

Метод основан на измерении времени свертывания тромбоцитарной плазмы при добавлении в нее оптимального количества кальция хлорида или каолина, что обеспечивает стандартизацию контактной активизации факторов свертывания.

В пробирку с раствором кальция хлорида или каолина, установленную в водяной бане при температуре 37°С, добавляют 0,1 мл плазмы и по секундомеру определяют время образования сгустка.

В норме время рекальцификации плазмы с кальция хлоридом составляет 60–120 с, с каолином - 50–70 с.

Изменения этого показателя неспецифичны и указывают лишь на общую тенденцию к гиперкоагуляции (укорочение времени рекальцификации) или к гипокоагуляции (увеличение показателя).

Удлинение времени рекальцификации может быть обусловлено:
Недостаточностью большинства плазменных факторов свертывания (кроме факторов VII и XIII).
Дефицитом тромбоцитарного фактора III (при выраженной тромбоцитопении или нарушении реакции высвобождения).
Избыточным содержанием в плазме ингибиторов свертывания (гепарина)
Наличием ДВС-синдрома.

3. Активированное частичное (парциальное) тромбопластиновое время (АЧТВ)

Принцип метода заключается в определении времени свертывания плазмы в условиях стандартизации не только контактной, но и фосфолипидной (тромбопластиновой) активации факторов свертывания. С этой целью к плазме добавляют смесь каолина и кефалина (тромбопластиновый активатор), а также кальция хлорид и по секундомеру определяют время свертывания плазмы.

В норме АЧТВ (кефалин-каолиновое время) составляет 35–50 с.

Уменьшение АЧТВ свидетельствует о гиперкоагуляции и склонности к тромбозам, увеличение - о гипокоагуляции крови.

!!! АЧТВ чрезвычайно чувствительно к дефициту плазменных факторов свертывания, участвующих во внутреннем механизме свертывания (факторы XII, XI, IX, VIII) и не зависит от дефицита тромбоцитов или их функциональной недостаточности (в связи с добавлением кефалина).

АЧТВ удлиняется также при наличии в крови ингибиторов свертывания (гепарина) и может быть использован как чувствительный тест для контроля за лечением гепарином.

4. Протромбиновое время (ПВ, протромбиновый индекс)

Метод представляет собой еще одну модификацию определения времени рекальцификации плазмы при добавлении в нее тканевого тромбопластина человека или кролика, что приводит к «запуску» свертывания по внешнему механизму. Тканевой тромбопластин в комплексе с фактором VII и ионом Са2+ активирует фактор X, входящий в состав «проактиватора протромбина».

В пробирку с 0,1 мл плазмы и 0,1 мл раствора тромбопластина, установленную в водяной бане при температуре 37°С, добавляют 0,1 мл раствора кальция хлорида и по секундомеру определяют время образования сгустка.

В норме протромбиновое время составляет 12–18 с и во многом зависит от активности тканевого тромбопластина, использованного при исследовании. Поэтому в большинстве случаев для определения этого показателя одновременно по той же методике исследуют плазму донора и вычисляют так называемый протромбиновый индекс (ПИ) :

ПИ=(ПBд/ ПВб)*100%

Где ПИ - протромбиновый индекс, ПBд и ПВб - протромбиновое время донора и больного, соответственно. В норме протромбиновый индекс составляет 90-100%. Чем больше протромбиновое время, свидетельствующее о гипокоагуляции крови, тем меньше значения протромбинового индекса.

Удлинение протромбинового времени (уменьшение протромбинового индекса) интегрально отражает недостаточность плазменных факторов, участвующих во внешнем механизме свертывания и в активации протромбина (VII, X, V), а также на конечных этапах коагуляции (I и II).

Наиболее частыми причинами такого изменения являются:
Прием непрямых антикоагулянтов (фенилин, синкумор, неодикумарин и др.).
Дефицит соответствующих витамин К-зависимых факторов свертывания (факторы II, VII, IХ, X) при тяжелых поражениях паренхимы печени (гепатит, цирроз, рак) и недостаточности витамина К (механическая желтуха, нарушения всасывания в кишечнике, дисбактериоз кишечника и т. п.).
Дефицит фибриногена (гипофибриногенемия), являющегося К-независимым фактором свертывания (тяжелые поражения паренхимы печени и др.).
Наличие феномена паракоагуляции, в частности, при ДВС-синдроме.

МНО (Международное нормализованное отношение, INR) - показатель системы свертывания крови.

Основные показания к применению: лечение антикоагулянтами непрямого действия – варфарином, аценокумаролом и другими аналогами.
МНО – показатель, рассчитывающийся при определении протромбинового времени.
Определение МНО гарантирует возможность сравнения результатов при определении ПВ, обеспечивая точный контроль терапии непрямыми антикоагулянтами.
Для диагностики нарушений свертывания крови используют показатель ПВ, выражающийся в секундах.
В тех случаях, когда определение ПВ применяют для оценки проведения лечения варфарином, используется показатель МНО - международное нормализованное отношение (INR - International Normalized Ratio).
Этот показатель позволяет выразить результаты ПВ с учетом использования в различных лабораториях коммерческих препаратов тромбопластина, используемого в определении ПВ.
Такой подход гарантирует возможность сравнения результатов полученных в разных лабораториях и проводить более точный контроль при лечении антикоагулянтами непрямого действия.
МНО вычисляется при делении ПВ пациента на значение нормального ПВ, далее результат возводится в степень, показатель которой равен международному индексу чувствительности (ISI или МИЧ - международный индекс чувствительности) тромбопластина:
МНО = (ПВ пациента/среднее нормальное ПВ)
Доза антикоагулянта подбирается так, что бы поддерживать МНО на необходимом уровне, в зависимости от заболевания.
Наиболее часто используемым антикоагулянтом непрямого действия в клинической практике является варфарин.
Применять анализ целесообразно с одновременным определением АЧТВ (активированное частичное тромбопластиновое время).

Референтные значения МНО:
В каждом конкретном случае необходимо поддерживать МНО на определенном уровне. Дозы назначаемого препарата выбираются лечащим врачом.
В норме: МНО = 0,8 - 1,15.
При лечение венозного тромбоза: МНО = 2,0-3,0.
Лечение артериальной тромбоэмболии, рецидивирующей системной эмболии: МНО= 3,0 -4,0.
Профилактика пристеночных тромбозов при мерцательной аритмии: МНО=1,5-2.

Факторы искажающие результат:
Недостаточное наполнение пробирки кровью, недостаточное перемешивание крови с антикоагулянтом, а также несвоевременная отправка пробы в лабораторию.
Гемолиз вследствие травматичной пункции вены или небрежного обращения с пробой крови.

Увеличение показателя МНО:
Болезни печени.
Дефицит витамина К.
Внутрисосудистое свёртывание.
Наследственный дефицит факторов II (протромбин), V, VII, X.
Афибриногенемия.
Гипофибриногенемия (уровень фибриногена менее 50 мг/100 мл).
Дисфибриногенемия.
Лечение кумарином.
Циркулирующие антикоагулянты.
____________________________________________________________________________________________________________________________

5. Тромбиновое время

Метод оценки тромбинового времени заключается в определении времени свертывания плазмы при добавлении в нее тромбина со стандартной активностью, который обладает способностью индуцировать превращение фибриногена в фибрин без участия других факторов свертывания крови.

В пробирку с 0,2 мл плазмы, установленную в водяной бане при температуре 37°С, добавляют 0,2 мл стандартного раствора тромбина и по секундомеру определяют время образования сгустка. В норме тромбиновое время составляет 15–18 с.
Определение тромбинового времени позволяет оценить конечный этап свертывания крови (превращение фибриногена в фибрин). Тромбиновое время, таким образом, зависит от концентрации фибриногена, его свойств и наличия в крови ингибиторов тромбина (гепарин, антитромбин III).

Причинами удлинения тромбинового времени являются:
Афибриногенемия и гипофибриногенемия.
ДВС-синдром и другие патологические состояния, сопровождающиеся феноменом паракоагуляции с нарушением процесса полимеризации фибрина и нарастанием концентрации в крови продуктов деградации фибрина (ПДФ).
Тяжелые поражения белковосинтетичекой функции печени, сопровождающиеся снижением синтеза фибриногена.
Острый фибринолиз.
Увеличение в крови концентрации ингибиторов тромбина (антитромбина III, гепарина).

Определение тромбинового времени используется для контроля за лечением гепарином и фибринолитиками.

6. Аутокоагуляционный тест (АКТ)

Метод заключается в исследовании динамики образования и инактивации тромбина в разведенной в 20 раз и гемолизированной крови пациента при добавлении гипотонического раствора кальция хлорида. Оценивается свертывающая активность гемолизат-кальциевой смеси с помощью гемокоагулографа.
Гемолизированные эритроциты обеспечивают контактную и фосфолипидную активацию процесса свертывания (подобно каолину и кефалину при исследовании активированного частичного тромбопластинового времени). Таким образом, аутокоагуляционный тест оказывается чувствительным к нарушениям внутреннего механизма свертывания.

Показатель
А - Свертывающая активность на 2-й мин инкубации, %
Нормальные величины = 15,5 ± 3,0
Показатель
МА - Максимальная свертывающая активность, %
Нормальные величины = 100 ± 1,1
Показатель
T1 - Время достижения 1/2 максимальной активности, мин
Нормальные величины = 3,7 ± 0,2
Показатель
Т2 - Время достижения максимальной активности, мин
Нормальные величины = 9,5
Показатель
Т - Время от начала инкубации до момен-та, когда активность снижается до 1/2 МА
Нормальные величины = 35

Увеличение значений T1 и Т2, а также уменьшение А и МА свидетельствуют о гипокоагуляции, которая может быть обусловлена:
дефицитом факторов внутреннего механизма свертывания (XII, XI, IX, VIII)
дефицитом факторов X и V (“проактиватора протромбина”)
дефицитом факторов конечного этапа коагуляции (I и II)
избытком ингибиторов тромбина (гепарин, антитромбин III и др.)

7. Тромбоэластография

Широкое распространение в клинической практике получил метод тромбоэластографии, который позволяет регистрировать свертывание крови и изменения упругости сгустка крови во времени (ретракцию и лизис).

Основной частью любого типа тромбоэластографа (гемокоагулографа) является кювета, в которую вносят исследуемую кровь. В кювету погружают стержень с диском или пластиной на конце, которая не касается ее стенок. Стержень связан с регистрирующим устройством тромбоэластографа. Специальное устройство придает кювете колебательно-вращательные движения, которые могут передаваться на стержень (и регистрирующее устройство), только когда в кювете, заполненной кровью, начнется образование нитей фибрина. По мере образования и уплотнения сгустка амплитуда колебаний стержня увеличивается и достигает максимума.

Предложено множество количественных показателей тромбоэластограммы, три из которых заслуживают внимания:
1.Время реакции (R) - время от начала исследования до начала свертывания крови (первых отклонений тромбоэластограммы от прямой линии).
2.Время коагуляции (К) - время от начала движений стержня прибора до момента, когда амплитуда тромбоэластограммы составит 20 мм.
3.Максимальная амплитуда (МА) тромбоэластограммы .

Считается, что время R характеризует в основном первую фазу коагуляции, а время К - интенсивность образования фибрина. Нормальные величины приведенных трех показателей тромбоэластограммы обычно устанавливают эмпирически для каждого прибора. В среднем у здоровых людей время реакции (R) составляет 4-10 мин, время коагуляции (К) - 5-7 мин, а максимальная амплитуда (МА) - 45-65 мин.

!!! Для гиперкоагуляции крови характерно укорочение R, К и увеличение МА, а для гипокоагуляции - удлинение R и К и уменьшение МА.

Следует отметить , что в целом чувствительность тромбоэластографии к нарушениям гемокоагуляции достаточно низкая, сопоставимая с чувствительностью времени свертывания крови, а тромбоэластографические показатели лишь весьма приблизительно отражают отдельные стадии процесса коагуляции. Тем не менее, тромбоэластография может использоваться в клинике для динамического контроля за лечением антикоагулянтами.

____________________________________________________________________________________________________________________________

Принципы оценки базисных методов диагностики нарушений коагуляционного гемостаза
Оценка свертывания крови с помощью описанных базисных тестов позволяет составить общее ориентировочное представление о процессе коагуляции крови. При этом следует иметь в виду, что такие показатели как время свертывания крови и время рекальцификации плазмы обладают весьма низкой чувствительностью и специфичностью, и, следовательно, информативностью: они изменяются, как правило, лишь при выраженных нарушениях коагуляции крови и не позволяют судить (хотя бы предположительно) о повреждениях отдельных ее механизмов и этапов.
Преимуществом в этом отношении обладают три базисных теста:
1.тромбиновый
2.протромбиновый
3.АЧТВ или АКТ (их изменения сходны)

Они позволяют судить не только о состоянии всей свертывающей системы в целом, но и о возможной недостаточности отдельных факторов свертывания.
При дефиците фактора VII (проконвертина), участвующего только во внешнем механизме свертывания, удлиняется только протромбиновое время, а тромбиновый тест и АЧТВ остаются без изменения.
При дефиците факторов XII, XI, IX, VIII и прекалликреина, участвующих только во внутреннем механизме коагуляции, изменяются АЧТВ (и АКТ), а протромбиновое и тромбиновое время свертывания остаются нормальными.
При дефиците факторов X, V, II, на которых замыкаются оба механизма свертывания, нарушения обнаруживаются как в протромбиновом тесте, так и в АЧТВ. Тромбиновое время при этом не изменяется.
Наконец, при нарушениях количества, структуры и свойств фибриногена (фактор I) изменения выявляются при выполнении всех трех базисных тестов. При этом целесообразно также оценить уровень фибриногена в сыворотке крови (см. ниже).
При дефиците фактора XIII показания всех трех базисных тестов оказываются нормальными.

Дальнейшее уточнение механизмов нарушения коагуляции крови производят с помощью дифференцирующих тестов, подробно описанных в специальных руководствах.

____________________________________________________________________________________________________________________________

8. Определение фибриногена

Наибольшее распространение в клинической практике получили два метода определения фибриногена:
1.Гравиметрический метод заключается в высушивании и взвешивании сгустка, который образуется при добавлении в плазму 0,2 мл стандартного раствора тромбина.
2.Колориметрический метод также основан на превращении фибриногена в фибрин путем добавления в плазму раствора тромбина. Фибриновый сгусток подвергают гидролизу, а в гидролизат добавляют биуретовый реактив (см. выше) и колориметрируют, определяя концентрацию белка.

Оба метода дают близкие результаты . Содержание фибриногена в плазме здорового человека составляет 2–4 г/л.

Уменьшение концентрации фибриногена наблюдается:
при врожденной недостаточности фибриногена (афибриногенемия, гипофибриногенемия, некоторые варианты дисфибриногенемии)
при тяжелых заболеваниях паренхимы печени (цирроз, рак, гепатит)
при ДВС-синдроме
при остром фибринолизе

Нередко встречается увеличение концентрации фибриногена. Наиболее частыми причинами гиперфибриногенемии являются:
острые инфекционные заболевания
острые и хронические воспалительные заболевания
злокачественные новообразования
тромбозы и тромбоэмболии, в том числе у больных острым инфарктом миокарда, ишемическим инсультом и т. п.

9. Определение высокомолекулярных производных фибриногена

Наиболее важными в практическом отношении высокомолекулярными производными фибриногена являются:
1) Растворимые фибрин-мономерные комплексы (РФМК) - представляет собой высокомолекулярные растворимые комплексы фибрин-мономера с фибриногеном и с продуктами расщепления фибриногена/фибрина. В норме РФМК не обнаруживаются. Появление РФМК в плазме свидетельствует о нарушении процесса нормальной полимеризации фибрин-мономеров. РФМК плохо коагулируют под влиянием тромбина, обладая относительной тромбинрезистентностью
2) Продукты деградации фибриногена (ПДФ) - в небольших количествах образуются и в норме в результате расщепления фибрина, присутствующего в плазме и в отложениях, под влиянием плазмина (см. ниже). Повышение содержания ПДВ - признак усиливающегося внутрисосудистого свертывания крови или массивных тромбоэмболий, сопровождающихся активацией фибринолитической системы.

Определение растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК). Для выявления РФМК в клинике чаще используются так называемые паракоагуляционные тесты. Они основаны на феномене неферментативного свертывания РФМК: при добавлении к плазме, в которой содержатся РФМК, 50% раствора этанола или 1% раствора протамина сульфата из растворимых комплексов фибрин-мономера с продуктами расщепления фибриногена/фибрина и фибриногеном высвобождаются фибрин-мономеры, которые затем полимеризуются с образованием геля. Проба с 50% раствором этанола является более чувствительной. В пробирку набирают 0,15 мл 50% этанола и 0,5 мл плазмы. Пробирку встряхивают и помещают в штатив при комнатной температуре. Проба расценивается как положительная, если через 1–10 мин в пробирке образуется гель. Помутнение или появление небольшой зернистости является признаком отрицательной пробы (нормальный показатель). Проба с протамина сульфатом позволяет выявить не только полимеризацию фибрин-мономеров, высвобождающихся из РФМК, но и обнаружить осаждение ранних продуктов расщепления фибриногена/фибрина.

Перед началом исследования предварительно готовят 5 разведений 1% раствора протамина сульфата (в 5, 10, 20, 40 и 80 раз). В каждое из приготовленных разведений добавляют 0,2 мл плазмы. Пробирки оставляют на 30 мин при комнатной температуре. Оценка результатов проводится так же, как и в пробе с этанолом. В норме отрицательный результат обнаруживают во всех разведениях протамина сульфата. Если хотя бы в одном из разведений образуется гель, результат оценивается как положительный.

Положительная проба с этанолом, а также положительный результат протаминсульфатной пробы в первых 1–2 разведениях свидетельствует о наличии в плазме РФМК. Образование геля во всех разведениях протамина сульфата больше характерно для повышения уровня ранних продуктов расщепления фибриногена/фибрина.

!!! Положительные результаты обеих проб встречаются при ДВС-синдроме или массивных тромбозах и тромбоэмболиях, сопровождающихся активацией системы фибринолиза.

Определение продуктов деградации фибрина (ПДФ). Для определения ПДФ в крови используют различные иммунологические и неиммунологические методы. Наиболее простым из них является проба с протамина сульфатом. В пробирку набирают 0,4 мл свежей сыворотки крови и добавляют 0,1 мл 1% раствора протамина сульфата. Помутнение или мелкую зернистость оценивают как отрицательный результат (норма), а образование геля, хлопьев или нитей фибрина - как положительный, свидетельствующий о повышении содержания ПДФ в сыворотке крови больше 0,015 г/л.
В основе иммунодиффузного метода определения ПДФ лежит образование дуг преципитации на агаровой пластине, на которую наносят на определенном расстоянии друг от друга исследуемую и антифибриногеновую сыворотки. Обычно используют стандартную антисыворотку, которую помещают в центральные лунки на агаровой пластинке. В периферические лунки вносят исследуемую сыворотку в различных разведениях (в 2, 4, 8, 16 и 32 раза). Результат определяют через сутки инкубации при комнатной температуре. При повышении в сыворотке ПДФ более 0,016–0,020 г/л на агаровой пластинке определяются дуги преципитации. Если известна чувствительность стандартной антифибриногеновой сыворотки, иммунодиффузный метод позволяет количественно определять содержание ПДФ в исследуемой сыворотке.

!!! Повышение концентрации ПДФ в сыворотке крови более 0,015 г/л чаще всего наблюдается:
при ДВС-синдроме
при массивных тромбозах и тромбоэмболиях, сопровождающихся активацией фибринолиза
при лечении фибринолитическими препаратами

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АНТИКОАГУЛЯНТЫ

В условиях физиологической нормы постоянно встречаются ситуации, которые «запускают» процесс плазмокоагуляции. Ограничение этого процесса осуществляется с помощью так называемых физиологических антикоагулянтов, которые, будучи естественными ингибиторами различных факторов коагуляции, тормозят начавшееся свертывание крови.

Различают две группы физиологических антикоагулянтов:
1.первичные , постоянно содержащиеся в крови - антитромбин III, гепарин, протеин С, a2-макроглобулин и др.
2.вторичные - образующиеся только в процессе свертывания крови и фибринолиза

Антитромбин III является важнейшим ингибитором свертывания, на долю которого приходится 3/4 активности всех физиологических ингибиторов коагуляции. Он инактивирует все ключевые факторы свертывания: тромбин (IIа), фактор Ха, IХа, ХIа, VIIa, XIIa. Кроме того, антитромбин III является плазменным кофактором гепарина, образуя с ним комплекс, обладающий выраженными антикоагулянтными свойствами. Антитромбин III и гепарин взаимодействуют с факторами свертывания и порознь, но в этом случае ингибирование обратимо.

!!! Дефицит антитромбина III (наследственный или приобретенный) сопровождается тяжелым тромботическим состоянием, характеризующимся рецидивирующими тромбозами магистральных вен конечностей и внутренних органов, тромбоэмболиями легочной артерии, инфарктами различных органов. При этом антикоагулянтная активность гепарина, вводимого парентерально, резко снижается из-за отсутствия кофактора - антитрипсина III.

К другим первичным антикоагулянтам относятся:
гепарин - ингибитор поливалентного действия, ограничивающий все фазы плазмокоагуляции, особено в комплексе с антитромбином III
a2-макроглобулин - белок, являющийся ингибитором тромбина, плазмина, калликреина
протеин С - витамин-К-зависимый физиологический антикоагулянт, инактивирующий факторы VIII и V при участии двух кофакторов (протеина S и тромбомодулина).
a-антитрипсин I - ингибитор тромбина, факторов IXa, XIa, XIIa, плазмина и калликреина и др

Из вторичных физиологических антикоагулянтов, образующих в процессе начавшегося свертывания и фибринолиза, наибольший практический интерес вызывают:
фибрин - обозначаемый антитромбином I
продукты деградации фибриногена/фибрина (ПДФ)

!!! Образующийся в процессе коагуляции плазмы фибрин и являющийся по сути конечным продуктом этого процесса одновременно адсорбирует и инактивирует большие количества тромбина и фактора Ха, т. е. функционирует и как физиологический антикоагулянт.

!!! Продукты деградации фибриногена/фибрина (ПДФ), образующиеся в результате действия плазмина, ингибируют как агрегацию тромбоцитов, так и процесс полимеризации фибрин-мономеров, т. е. конечный этап свертывания - образование фибрина.

В клинической практике наибольшее распространение в последние годы получило определение функциональной активности антитромбина III как важнейшего физиологического антикоагулянта. Методы основаны на оценке интенсивности инактивации стандартных доз тромбина с регистрацией по времени свертывания или на количественном определении содержания в плазме антигена антитромбина III с применением стандартных антисывороток (иммунологический метод).

Лабораторная диагностика нарушений системы гемостаза является одной из самых дорогостоящих в лабораторной практике. Выполнение всех возможных тестов для уточнения характера нарушений для всех пациентов – практически нереальная задача. Поэтому чрезвычайно важно соблюдать этапность проведения тестов, исходить из клинических данных и анамнеза пациента. На первом этапе для уточнения направленности нарушений необходимо провести тесты, отражающие состояние целых звеньев системы гемостаза. Существует набор рекомендуемых скрининговых тестов для диагностики состояния системы гемостаза:

• АЧТВ (активированное частичное тромбопластиновое время)
• Протромбиновое время (по Квику)
• Тромбиновое время
• Фибриноген

Время свертывания крови (ВСК)
ВСК является ориентировочным показателем состояния многоступечатого коагуляционного каскада, в результате которого растворимый фибриноген переходит в нерастворимый фибрин. Данный показатель оценивает процесс свертывания в целом и не дает возможности выявить механизмы, ведущие к его нарушению. Укорочение ВСК свидетельствует о необходимости профилактики гиперкоагуляции, которая нередко угрожает тромбозом или тромбоэмболией.

Используется как скрининговый тест для оценки внутреннего каскада свертывания плазмы, диагностики волчаночного антикоагулянта и мониторинга антикоагулянтного действия гепаринов. АЧТВ – более значимый тест для первичного выявления патологии, чем протромбиновое время, так как выявляет относительно часто встречающуюся гемофилию А и В (дефицит факторов VIII и IX соответственно) и наличие волчаночного антикоагулянта.
Тест АЧТВ-L + обладает особо высокой чувствительностью к волчаночному антикоагулянту. При наличии ВА в крови время свёртывания удлиняется в 3-3,5 раза.
Тест АЧТВ-L — отличаетсявысокой специфичностью к внутренним факторам свертывания и гепарину и низкой чувствительностью к волчаночному антикоагулянту, что позволяет дифференцировать нарушения во внутреннем каскаде свертывания еще на этапе их скрининга.

– широко используемый скрининговый тест для оценки состояния внешнего и общего путей когуляционного каскада свертывания плазмы. Нормальные величины ПВ для взрослых составляют 11-15 сек, для новорожденных – 13-18 сек. Увеличение ПВ говорит о наклонности к гипокоагуляции и может зависеть от отдельных причин:

• Недостаточность одного или нескольких факторов протромбинового комплекса, которая наблюдается при таких редких наследственных коагулопатиях, как гипопроконвертинемия (дефицит фактора VII) и гипопротромбинемия (дефицит фактора II);
• Дефицит фактора X при амилоидозе (который поглощается амилоидом) и дефицит факторов V и VII при нефротическом синдроме (которые выделяются с мочой);
• Снижение синтеза факторов протромбинового комплекса при заболеваниях печени;
• Энтеропатия и кишечные дисбактериозы, ведущие к недостаточности витамина К;
• При лечении антагонистами витамина К;
• При ДВС-синдроме (потребление факторов протромбинового комплекса);
• При хроническом панкреатите, раке поджелудочной железы и ж/пузыря;
• Снижении уровня фибриногена в крови (до 1 г/л и ниже);
• При острых и хронических лейкозах (вследствие развития ДВС-синдрома);
• При повышении уровня антитромбина или антитромбопластина;
• Лекарственные средства (анаболические стероиды, антибиотики, аспирин в больших дозах, слабительные, метотрексат, никотиновая кислота, хинидин, хинин, тиазидные диуретики, толбутамид).

Укорочение ПВ говорит онаклонности к гиперкоагуляции и может быть отмечено в начальных стадиях тромбоза глубоких вен нижних конечностей, при полицитемии, в последние месяцы беременности.

Контроль антикоагулянтной терапии
Определению ПВ отводится ведущая роль в контроле за терапией непрямыми антикоагулянтами. Результаты исследования традиционно выражаются в секундах. При определении ПВ используется активатор свертывания крови – тромбопластин. Если в лаборатории (лабораториях) сегодня испльзуется один тромбопластин, а завтра другой, то ПВ у пациента будет отличаться день ото дня. Для того, чтобы исключить влияние тромбопластина на результаты определения ПВ, применяют показатель – международное нормализованное отношение МНО, которое обеспечивает возможность сравнения результатов, полученных в разных лабораториях, и гарантирует более точный конторль за лечением непрямыми антикоагулянтами. МНО рассчитывают по формуле:

МНО пациента = [ ПВ пациента (сек)/ПВ контроля (сек)] международный индекс чувствительности

Основная задача мониторинга непрямыми антикоагулянтами – предупреждение кровотечения. Доза антикоагулянта должна быть подобрана таким образом, чтобы поддерживать МНО на необходимом уровне, зависящим от причины назначения лечения. У большинства больных МНО необходимо поддерживать на уровне 2-3,0. Контроль МНО необходимо проводить каждые 2-3 недели.

Для контроля уровня антикоагулянтов ВОЗ разработаны следующие рекомендации

Является третьим по значимости базисным скрининговым тестом. Тест характеризует конечный этап процесса свертывания – превращение фибриногена в фибрин под действием тромбина, на него влияет концентрация фибриногена в плазме и наличие продуктов деградации фибрина (ПДФ) .

Количественное определение по методу Клаусса является базисным тестом исследования гемостаза. Образование фибрина и его стабилизация представляют собой финальный этап формирования тромба, при котором растворимый фибриноген превращается в нерастворимый фибрин под действием тромбина и фактора XIII.
При атеросклерозе наблюдается устойчивое увеличение уровня фибриногена, трудно корригируемое лекарственными препаратами. В результате риск сердечно-сосудистых заболеваний повышается с возрастанием исходного содержания фибриногена в интервале 3,0-4,5 г/л. Обнаружено, что повышение уровня фибриногена в плазме крови больных сердечно-сосудистыми заболеваниями предшествует развитию инфаркта миокарда и инсульта. Корреляция между уровнем фибриногена и развитием этих осложнений особенно четко прослеживается у пациентов молодого и среднего возраста. Определение уровня фибриногена – наиболее чувствительный тест для выявления бессимптомных стадий заболевания периферических артериальных сосудов.

Специальные тесты для оценки плазменного звена гемостаза

Фактор VIII синтезируется в печени, селезенке, клетках эндотелия, лейкоцитах, почках и принимает участие в первой фазе (протромбиназообразование) плазменного гемостаза. Определение фактора VIII играет важнейшую роль в диагностике гемофилии А.
Развитие гемофилии А обусловлено врожденным недостатком фактора VIII. При этом в крови больных фактора VIII нет (гемофилия А») или он находится в функционально неполноценной форме, которая не может принимать участия в свертывании крови (гемофилия А+). Гемофилия А» встречается у 90-92 % больных, а гемофилия А+ – у 8-10 % . У больных гемофилией резко снижено содержание в плазме крови F VIII:C, а концентрация в ней VIII-vWF находится в пределах нормы. Поэтому время длительности кровотечения при гемофилии А находится в нормативных пределах, а при болезни Виллебранда – удлинено.
Гемофилия А — наследственное заболевание, однако у 20-30 % больных гемофилией семейный анамнез со стороны родственников матери никакой информации не дает. Поэтому определение активности фактора VIII имеет большую диагностическую ценность. В зависимости от уровня активности фактора VIII разделяют следующие клинические формы гемофилии А: крайне тяжелая форма (активность фактора VIII от 0 до 1 %); тяжелая форма (активность фактора VIII от 1 до 2 %); средней тяжести (активность фактора VIII от 2 до 5 %); легкая форма, или субгемофилия (активность фактора VIII от 6 до 24 %).
Около трети носителей гемофилии А имеют уровень активности фактора VIII между 25 и 49 %. У больных легкой формой и носителей гемофилии А клинические проявления заболевания отмечаются только после травм и хирургических вмешательств. Минимальный гемостатический уровень активности фактора VIII в крови для выполнения операций – 25 %, при более низком содержании риск развития послеоперационных кровотечений чрезвычайно велик. Минимальный гемостатический уровень активности фактора VIII в крови для остановки кровотечения – 15-20 %, при более низком содержании остановка кровотечения без введения больному фактора VIII невозможна. При болезни Виллебранда минимальный гемостатический уровень активности фактора VIII для остановки кровотечения и для выполнения операции – 25 % .
При ДВС-синдроме, начиная со II стадии, отмечается отчетливое снижение активности фактора VIII вследствие коагулопатии потребления. Тяжелые заболевания печени могут привести к снижению содержания фактора VIII в крови. Содержание фактора VIII снижается при болезни Виллебранда, а также при наличии специфических антител к фактору VIII. Активность фактора VIII значительно повышается после спленэктомии. В клинической практике очень важно дифференцировать гемофилию от болезни Виллебранда.

Показатели коагулограммы при гемофилии и болезни Виллебранда

Фактор VII (проконвертин, или конвертин) относится к α2-глобулинам. Врожденный недостаток фактора VII обуславливает развитие геморрагического диатеза (болезнь Александера).
Приобретенные формы гипопроконвертинемии встречаются у младенцев в первые дни жизни, у больных с поражением печени, а также в результате действия непрямых антикоагулянтов. Отмечается снижение активности проконвертина в плазме крови у больных вирусным гепатитом, циррозом печени, при остром алкогольном гепатите, хроническом персистирующем гепатите. У больных с циррозом печени просматривается отчетливая связь между снижением уровня проконвертина и тяжестью процесса. Из-за короткого периода полураспада снижение активности проконвертина является лучшим маркером развития печеночной недостаточности.
Минимальный гемостатический уровень активности фактора VII в крови для выполнения операций составляет 10-20 %, при более низком содержании риск развития послеоперационных кровотечений чрезвычайно велик. Минимальный гемостатический уровень активности фактора VII в крови для остановки кровотечения – 5-10 %, при более низком содержании остановка кровотечения без введения больному фактора VII невозможна .
При ДВС-синдроме, начиная со II стадии, отчетливо снижается активность фактора VII вследствие коагулопатии потребления.

(фибринстабилизирующий фактор, фибриназа, фактор Лаки-Лоранда) относится к β2-гликопротеидам. Врожденный дефицит фактора XIII наследуется по аутосомно-рецессивному типу преимущественно мужчинами. Первым клиническим признаком дефицита фибриназы у 80 % больных бывает длительное (в течение дней, иногда недель) кровотечение из пупочной раны. Кровоточивость проявляется по петехиальному типу. Случаются кровоизлияния в мозг. Отмечается медленное заживление ран, часто образуются послеоперационные грыжи, плохо срастаются переломы. Все параметры в коагулограмме, кроме снижения уровня фактора XIII в плазме, остаются в пределах нормы. Приобретенный дефицит фактора XIII выявляется у больных С-авитаминозом, лучевой болезнью, лейкозами, циррозами, гепатитами, раком с метастазами в печень, лимфомой, с ДВС-синдромами, у перенесших адреналэктомию; после приема антикоагулянтов непрямого действия ее активность снижается. Снижение фактора XIII в крови при этих заболеваниях обусловлено нарушением его синтеза либо расходованием в процессе ДВС-синдрома.
Активностьфактора XIII рекомендуется исследовать при длительно и плохо заживающих ранах и переломах, поскольку в ряде случаев такие явления могут быть связаны с дефицитом этого фактора, так как фактор XIII стимулирует развитие фибробластов.
Минимальный гемостатический уровень активности фактора XIII в крови для остановки кровотечения – 1-2 %, при более низком содержании остановка кровотечения без введения больному фактора XIII невозможна .
У больных с тромбоэмболическими осложнениями, атеросклерозом, после оперативных вмешательств, у рожениц, после введения адреналина, глюкокортикоидов, питуитрина активность фибриназы часто повышена.

Резистентность фактора V к активированному протеину С . К ряду новых, еще недавно неизвестных, но широко распространенных тромбофилий относится состояние, вызванное резистентностью фактора V к активированному протеину С. Наследственная резистентность к активированному протеину С (РАПС) является наиболее частой причиной первичных тромбофилий. Среди пациентов с тромбозами эта патология встречается у 30-60%, а среди клинически здоровой популяции – в 10-15%. РАПС в 90% случаев обусловлена точечной мутацией гена фактора V. Она вызывает замену в молекуле фактора V аргинина на глицин в 506 позиции – основном участке действия активированного протеина С (АПС). Результатом этой аномалии является низкая чувствительность, то есть резистентность фактора Va (фактор V Лейден) к инактивации его АПС. При сохраненной прокоагулянтной активности фактора Va это приводит к генерации тромбина и тромбофилическому состоянию. По клиническим проявлениям РАПС протекает более доброкачественно, чем врожденный дефицит , протеина С и протеина S . К наиболее важным клиническим факторам риска развития тромбоза при РАПС относятся хирургическое вмешательство, беременность и использование оральных контрацептивов. Установлено, что около 30% послеоперационных тромбозов обусловлено РАПС. При беременности РАПС может проявиться тромбозом плацентарных сосудов и внутриутробной гибелью плода. У женщин, имеющих мутацию Лейдена и использующих оральную контрацепцию, риск развития тромбоза повышен в 30 раз. Результаты эпидемиологических исследований свидетельствуют о нередком сочетании РАПС с наследственным или приобретенным дефицитом протеина S или протеина С. Понятно, что при таких комбинированных дефектах риск развития тромбозов возрастает. Принципиально важно, что высокая распространенность РАПС в общей популяции диктует необходимость лабораторного тестирования этой патологии не только у пациентов с тромбозами, но и у асимптоматичных лиц в условиях высокого риска тромбообразования. При резистентности фактора V к активированному протеину С величина АПС-индекса будет ниже значения нижней границы нормы. Для подтверждения результатов функциональных тестов разработано несколько методов на базе полимеразной цепной реакции для диагностики резистентности фактора Va к активированному протеину С.

Однако в связи с тем, что в суспензии каолина отсутствуют фосфолипиды, его воспроизводимость существенно ниже АПТВ-теста. Каолиновый тест нецелесообразно применять для обнаружения каких-либо коагулопатий, однако тест пригоден для выявления ВА.

Принцип метода

Определяют скорость образования сгустка фибрина после рекальцификации смеси, содержащей цитратную БТП и каолин. Последний активирует коагуляционный фактор XII, поэтому его результаты отклоняются от нормы при недостаточности многих коагуляционных факторов (I, II, V, VIII, IX, X, XI, XII), наличии ингибиторов свертывания, а также у пациентов, применяющих антикоагулянты.

Реактивы и оборудование

• Суспензия каолина в буфере (рН 7,4).
• Раствор кальция хлорида (0,025 М).
• Коагулометр (при отсутствии коагулометра - водяная баня и секундомер).

Образцы крови для исследования Для выполнения теста используют БТП. Поскольку тест фосфолипид-зависимый, весьма важны правильные режим и время проведения центрифугирования. Для эффективного удаления тромбоцитов целесообразно использовать двойное центрифугирование образцов (подробнее см. приложение 3).

Техника выполнения

В кювете коагулометра (или пробирке при мануальной технике выполнения) смешивают 0,1 мл исследуемой БТП и 0,1 мл взвеси каолина. Затем инкубируют эту смесь при температуре +37 °С в течение 3 мин. После инкубации в кювету (или пробирку при мануальной технике выполнения) добавляют 0,1 мл раствора кальция хлорида, имеющего температуру +37 °С, в тот же момент включают таймер коагулометра (или секундомер при мануальной технике выполнения) и регистрируют время коагуляции.

Оценка результатов исследования

Каолиновое время свертывания оценивают в секундах. Необходимо определить время свертывания не только исследуемой БТП, но и контрольной нормальной плазмы. Нормативы существенно зависят от техники определения и варианта коагулометра, поэтому каждой лаборатории следует уточнить локальный диапазон нормальных значений.

Сравнивают результаты каолинового теста в исследуемой плазме с аналогичным показателем у здорового донора. Отклонением от нормы следует считать удлинение времени свертывания на 25 % от значения, полученного при исследовании контрольной БТП.

Интерпретация результатов исследования Пролонгированные показания в каолиновом тесте наблюдаются при снижении любого коагуляционного фактора, кроме факторов VII и XIII. Кроме того, этот тест отклоняется от нормы при наличии в крови различных ингибиторов коагуляции, в т. ч. ВА. Значительное удлинение в каолиновом тесте, а зачастую и несвертываемость обуславливает гепарин.

Укорочение времени коагуляции в каолиновом тесте часто обусловлено дефектами преаналитического этапа исследования.

Причины ошибок

• Ошибки преаналитического этапа исследования, в т. ч. неправильная дозировка цитрата при заборе венозной крови.
• Дефекты центрифугирования при получении образцов БТП.
• Попадание в исследуемую кровь гепарина из венозного катетера.
• Гемолиз.

Другие аналитические технологии Существует вариант метода, оценивающий время коагуляции в богатой тромбоцитами плазме. Однако целесообразность его применения в повседневной диагностической практике вызывает сомнения.