Методические рекомендации. Бактериологическая диагностика брюшного тифа и паратифов А, В и С

ЦЕЛЬ:

1. Изучить методы выделения чистых культур бактерий

2. Овладеть бактериологическим методом диагностики инфекционных заболеваний.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ СПРАВКА

Бактериологический метод является основным методом диагностики инфекционных заболеваний. Его сущность – определение вида возбудителя инфекции, следовательно, на основании результатов бактериологического метода можно поставить этиологический (окончательный) диагноз. Основным недостатком метода является длительность исследования – от 3 до 5 суток, а в отдельных случаях и более.

Успех проведения бактериологического метода во многом зависит от предварительного этапа, включающего забор исследуемого материала и его транспортировку, оформление направления в бактериологическую лабораторию. При этом необходимо соблюдение ряда правил.

1. Забор исследуемого материала необходимо провести до начала антибактериальной терапии или через 8-10 часов после введения последней дозы антибиотика. Чтобы избежать загрязнения пробы микрофлорой окружающей среды необходимо соблюдать строжайшую асептику. Для этого использовать стерильный материал: а) ватные тампоны для взятия материала из раны, со слизистых оболочек (глаз, зева, носа); б) проволочную петлю для взятки материала из влагалища, анального отверстия; в) шприц для взятия крови, гноя; г) стерильную посуду для непосредственного сбора в нее мочи, мокроты, испражнений.

2. Транспортировку полученного материала следует производить в максимально короткие сроки (2-3 часа) в специальных биксах или пеналах.

3. Направление прилагают к клиническому образцу в качестве сопроводительного документа. Оно содержит основные сведения, необходимые для проведения микробиологического исследования:

Фамилия, имя, отчество, возраст пациента;

Предполагаемый диагноз заболевания;

Предшествующая антимикробная терапия;

Характер материала;

Дата и время взятия материала;

Цель исследования;

Название лечебного учреждения, номер отделения, палаты;

Подпись лечащего врача.

Бактериологический метод осуществляется в два этапа (рис.2.1.):

1. Выделение чистой культуры возбудителя (1-2 суток);

2. Идентификация чистой культуры (1-3 суток).

На первом этапе проводится посев исследуемого материала на твердую или в жидкую питательную среду, оценка культуральных свойств, отбор подозрительных колоний и их отсев на скошенный агар. Этап идентификации включает обязательное изучение морфологии, биохимических свойств и антигенной структуры выделенной чистой культуры, а также проведение дополнительных исследований по определению антибиотикочувствительности, фагочувствительности, фаготипирования, изучения патогенности и персистентных свойств.

ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ:

1. Правила забора и транспортировки исследуемого материала для бактериологического исследования.

2. Правила оформления направления на бактериологическое исследование.

3. Методы выделения чистых культур микроорганизмов.

4. Бактериологический метод диагностики. Цель. Этапы. Диагностическая ценность.

ПЛАН САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ:

1. Изучить таблицы «Методы выделения чистых культур бактерий» и «Выделение и идентификация чистой культуры».

2. Выделить из смеси бактерий чистую культуру и осуществить ее идентификацию – овладеть бактериологическим методом диагностики (Работа 1)

Лабораторные методы исследования при ряде нозологических форм играют ведущую, а в целом ряде клинических ситуаций решающую роль не только в диагностике, но и в определении конечного исхода заболевания. Роль диагностики состоит в том, что ранний, точный, исчерпывающий и максимально конкретный диагноз является основой для проведения рациональной и эффективной терапии, позволяет в большинстве случаев предсказать возможные варианты дальнейшего течения и исходов заболевания, служит начальным моментом в проведении своевременных и направленных противоэпидемических и профилактических мероприятий.
Диагностика инфекционных заболеваний почти всегда предусматривает использование комплекса лабораторных методов.

В современных условиях диагностика инфекционных болезней сохраняет все свои традиционные черты, сформировавшиеся за последние десятилетия. В то же время она характеризуется непрерывным совершенствованием уже найденных приемов и методов распознавания болезней и поисками новых, более эффективных, в том числе экспрессных.
Различают следующие методы микробиологической диагностики бактериальных инфекций: бактериоскопический (микроскопический), бактериологический (культуральный), биологический (экспериментальный), иммунологический (серологический), аллергический.
Основным методом является бактериологическое исследование. Он заключается в посеве исследуемого материала на питательные среды, выделении чистой культуры возбудителя и его идентификации. Определение вида возбудителя производят по ряду признаков: морфологии, тинкториальным свойствам (способность окрашиваться различными красителями), культуральным свойствам (характер роста на искусственных питательных средах), биохимическим свойствам (ферментация углеводов и белков). Окончательную принадлежность выделенной культуры к определенному виду микроорганизмов устанавливают после изучения антигенной структуры, используя различные иммунологические реакции (агглютинации, преципитации, нейтрализации и др.). В целом бактериологический метод исследования представляет собой многоэтапное бактериологическое исследование, которое длится от 18— 24 часов до нескольких суток.

Бактериологический метод имеет множество достоинств. Одним из первых является изучение с его помощью качественного состава микрофлоры исследуемого биологического материала. Для постановки диагноза важное значение имеет количество микроорганизмов в 1 г изучаемого вещества и 1 мл жидкости, так называемое общее микробное число, измеряемое в колиниеобразующих единицах (КОЕ/г или КОЕ/мл). Для этого проводят посев определенного количества исследуемого материла на плотные питательные среды, после инкубации в термостате подсчитывают количество выросших колоний (колония - это видимое изолированное скопление представителей одного вида микроорганизмов, образующееся при размножении одной колониеобразующей единицы на плотной питательной среде).
К наиболее впечатляющим результатам, достигнутым микробиологией, относятся создание и внедрение в практику антибиотиков. В связи с широким распространением лекарственно-устойчивых форм бактерий, для назначения рациональной химиотерапии необходимо определение антибиотикограммы - чувствительности к антибактериальным препаратам выделенной чистой культуры возбудителя. Для антибиотикограммы используют либо метод бумажных дисков, либо метод серийных разведений.
Метод бумажных дисков базируется на выявлении зоны подавления размножения бактерий вокруг дисков, которые пропитаны антибиотиками. В случае применения метода серийных разведений антибиотик разводят в пробирках с жидкой питательной средой, затем засеивают в пробирки одинаковое количество бактерий. По отсутствию или наличию роста бактерий проводят учет результатов. С помощью метода серийных разведений проводится определение минимальной подавляющей концентрации (МИК) антибиотика, которая служит для расчета терапевтической дозы препарата.

Бактериологический метод позволяют поисследовать механизмы антибиотикорезистентности выделенных культур (метициллинрезистентность, продукция b-лактамаз). Также можно оценить концентрацию антибиотика в очаге инфекционного процесса, изменение антибиотикочувствительности в динамике лечения.
Для врача-клинициста важно знать, насколько эффективно проводимое антимикробное лечение, поэтому возможно оценивать динамику изменения качественного и количественного состава в ходе заболевания и терапии. С помощью бактериологического метода диагностики можно определить, каков исход инфекционного процесса - выздоровление, носительство, хронизация.
Основными возбудителями инфекционных заболеваний в настоящее время выступает условно-патогенные микроорганизмы, роль которых в генезе заболевания сложно доказать. Поэтому немаловажно оценить патогенность выделенной условно-патогенной микрофлоры.
Организм человека заселен представителями так называемой нормальной микрофлоры, изменение качественно-количественного состава котрой может играть роль в развитии дисбиотических нарушений. Поэтому можно проводить исследование микрофлоры организма человека - в норме и при дисбиозах, межмикробные взаимоотношения при терапии эубиотиками.
Любые медицинские учреждения подвержены риску развития внутрибольничной инфекции. Диагностика ее, определение возбудителя, выявление источника инфекции, доказательства идентичности штаммов - составляющая часть работы бактериологической лаборатории (3).
Современный этап развития микробиологии характеризуется новыми открытиями, сделанным при изучении механизмов формирования патологических состояний. Основными считают установление факта существования бактерий в организме человека в составе различных сообществ, получивших общее название биопленки, и выявление опосредованного действия микробов на организм человека. Свойства бактерий в биопленках отличаются от таковых у изолированных клеток, что сказывается на всех аспектах взаимодействия микроба и окружающей среды, включая факторы иммунной защиты и антимикробные препараты (4,5).
Биопленка - хорошо организованное, взаимодействующее сообщество микроорганизмов (Quorum sensing - чувство кворума). 99% бактерий в природных экосистемах, 80% бактерий при инфекционных заболеваниях существуют в виде биофильма.

Биопленка связывает клетки, органические и неорганические субстраты, повышает адгезию бактерий к эпителию и любым поверхностям (живого и неживого происхождения), снижает эффективность антибактериальной терапии, помогает выживать бактериям в меняющейся внешней среде. Микроорганизмы в биопленке более устойчивы к действию как антибактериальных препаратов, так и факторов неспецифической противоинфекционной защиты организма человека.
Механизмы увеличения устойчивости бактерий к антибиотикам в биопленках связаны с ограничением проникновения антибиотиков через нее, уменьшением скорости деления бактерий, вследствие чего остается меньше мишеней для действия антибиотиков, генетическими изменениями у персистирующих в биопленке бактерий.
С помощью бактериологического метода можно изучать механизмы защиты микроба от иммунной системы организма, стратегию выживания его в макроорганизме - персистенцию. Микробы имеют механизмы защиты от иммунной системы человека - антилизоцимную, антикомплементарную, антилактоферриновую активность.
Таким образом, в настоящее время бактериологический метод диагностики позволяет исследовать многие аспекты жизнедеятельности болезнетворных бактерий, механизмы их развития, выживания и подавления.

Литература

1. Тец В.В. Микроорганизмы и антибиотики. Инфекции кожи, мягких тканей, костей и суставов. — СПб.: КЛЕ Т, 2006. — 128 с.
2. Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии /Под ред. Л. С. Страчунского, Ю. Б. Белоусова, С. Н. Козлова. Смоленск: МАКМАХ, 2007. - 464 с.
3. Руднов В.А.Современное клиническое значение синегнойной инфекции и возможности ее терапии у пациентов отделений реанимации Инфекция и антимикробная терапия 2002. - Т. 4, №3
4. Сидоренко С.В. Роль бактериальных биопленок в патологии человека // Инфекции в хирургии. 2004. - Т. 2,№ 3. - С. 16-20.
5. Anwar H., Strap J.L., Costerton J.W. Eradication of bio?lm cells of Staphylococcus aureus with tobramycin and cephalexin. // Can. J. Microbiol. 1992. - V. 38. - P. 618-625.

9. Бактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний

Основным методом микробиологической диагностики и «золотым стандартом» микробиологии, является бактериологический метод.

Цель бактериологического метода заключается в выделении чистой культуры возбудителя заболевания из исследуемого материала, накопление чистой культуры и идентификация данной культуры по набору свойств: морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических, антигенных, по наличию факторов патогенности, токсигенности и определение его чувствительности к антимикробным препаратам и бактериофагам.

Бактериологический метод исследования включает:

1. посев исследуемого материала в питательные среды

2. выделение чистой культуры

3. идентификацию микроорганизмов (определение принадлежности к виду).

Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий предусматривает проведение следующих исследований:

I этап (работа с нативным материалом)

Цель: получение изолированных колоний

1. Предварительная микроскопия дает ориентировочное представление о микрофлоре

2. Подготовка материала к исследованию

3. Посев на плотные питательные среды для получения изолированных колоний

4. Инкубация при оптимальной температуре, чаще всего 37°С, в течение 18-24 часов

II этап

Цель: получение чистой культуры

1. Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете (характеристика величины, формы, цвета, прозрачности, консистенции, структуры, контура, поверхности колоний).

2. Микроскопическое изучение изолированных колоний

3. Постановка пробы на аэротолерантность (для подтверждения присутствия в исследуемом материале строгих анаэробов).

4. Посев колоний, характерных для определенного вида, на среды накопления чистой культуры или элективные среды и инкубация в оптимальных условиях.

III этап

Цель: идентификация выделенной чистой культуры

1. Для идентификации выделенной культуры по комплексу биологических свойств изучается:

морфология и тинкториальные свойства

культуральные свойства (характер роста на питательных средах)

биохимические свойства (ферментативная активность микроорганизмов)

серологические свойства (антигенные)

вирулентные свойства (способность к продукции факторов патогенности: токсины, ферменты, факторы защиты и аггресии)

патогенность для животных

фаголизабельность (чувствительность к диагностическим бактериофагам)

чувствительность к антибиотикам

другие индивидуальные свойства

IV этап (Заключение)

По изученным свойствам делают заключение о выделенной культуре

Первый этап исследований. Исследование патологического материала начинается с микроскопии. Микроскопия окрашенного нативного материала позволяет установить ориентировочно состав микробного пейзажа изучаемого объекта, некоторые морфологические особенности микроорганизмов. Результаты микроскопии нативного материала, во многом определяют ход дальнейшего исследования, впоследствии их сопоставляют с данными, полученными при посевах на питательные среды.

При достаточном содержании патогенных микроорганизмов в образце проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие питательные среды обогащения. Питательные среды выбирают соответственно требовательности микроорганизмов.

Культивирование микроорганизмов возможно только при создании оптимальных условий их жизнедеятельности и соблюдении правил, исключающих контаминацию (случайное загрязнение посторонними микробами) исследуемого материала. Искусственные условия, которые исключили бы загрязнение культуры другими видами, можно создать в пробирке, колбе или чашке Петри. Вся посуда и питательные среды должны быть стерильными и после посева микробного материала защищены от загрязнения извне, что достигается с помощью пробок или металлических колпачков и крышек. Манипуляции с исследуемым материалом должны проводится в зоне пламени спиртовки для исключения контаминации материала из внешней среды, а также в целях соблюдения техники безопасности.

Посевы материала на питательные среды должны быть сделаны не позднее 2 часов с момента их забора.

Второй этап исследований. Изучение колоний и выделение чистых культур. Через сутки инкубации на чашках вырастают колонии, причем на первом штрихе рост сплошной, а на следующих – изолированными колониями. Колония – это скопление микробов одного вида, выросших из одной клетки. Таккак материал представляет собой чаще всего смесь микробов, то вырас­тает несколько видов колоний. Карандашом маркируют разные колонии,очерчивая их кружком со стороны дна, и изучают их (табл. 11). Прежде всего, изу­чают колонии невооруженным глазом: макроскопические признаки. Чашку просматривают (не открывая ее) со стороны дна в проходящем свете, отмечают прозрачность колоний (прозрачная, если не задерживает свет;полупрозрачная, если частично задерживает свет; непрозрачная, если свет через колонию не проходит), измеряют (в мм) размер колоний. Затем изучают колонии со стороны крышки, отмечают форму (правильная круглая, неправильная, плоская, выпуклая), характер поверхности (гладкая, блестящая, тусклая, шероховатая, морщинистая, влажная, сухая, слизистая), цвет (бесцветная, окрашенная).

Таблица 11. Схема изучения колоний

Примечание: 5-7 пункты изучаются при малом увеличении микроскопа.

Еще лучше можно увидеть различия колоний при рассмотрении их с увеличением. Для этого закрытую чашку дном кверху помещают на предметный столик, слегка опускают конденсор, используют неболь­шое увеличение объектива (х8), передвигая чашку, изучают у колоний микроскопические признаки: характер края (ровные, волнистые, зазубренные, фестончатые), структуру (гомогенная, зернистая, волокнистая, однородная, или различающаяся в центре и по периферии).

Далее изучают морфологию микробных клеток из колоний. Для это­го из части каждой из отмеченных колоний делают мазки, окрашивают по Граму. Во время взятия колоний обращают внимание на консистенцию (сухая, если колония крошится и берется с трудом; мягкая, если берется легко на петлю; слизистая, если колония тянется за петлей; твердая, если часть колонии не берется петлей, можно снять только всю колонию).

При просмотре мазков устанавливают, что колония представлена одним видом микроба, следовательно, могут быть выделены чистые куль­туры бактерий. Для этого из изученных колоний делают пересев на скошенный агар. При пересеве из колоний нужно тщательно следить, чтобы взять именно намеченные колонии, не задевая петлей близлежащих колоний. Пробирки подписывают и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов.

Третий этап исследований. Идентификация выделенной культуры. Идентификация микробов – определение систематического поло­жения выделенной из материала культуры до вида и варианта. Первым условием надежности идентификации является безусловная чистота культуры. Для идентификации микробов используют комплекс признаков: морфологические (форма, размеры, наличие жгутиков, капсулы, спор, взаим­ного расположения в мазке), тинкториальные (отношение к окраске по Граму или другим методам), химические (соотношение гуанина+цитозина в молекуле ДНК), культуральные (питательные потребности, условия куль­тивирования, темп и характер роста на различных питательных средах), ферментативные (расщепление различных веществ с образованием про­межуточных и конечных продуктов), серологические (антигенная структура, специфичность), биологические (вирулентность для животных, токсигенность, аллергенность, влияние антибиотиков и др.).

Для биохимической дифференциации изучают способность бактерий сбраживать углеводы с образованием промежуточных и конечных продуктов, способность разлагать белки и пептоны и изучают окислительно-восстановительные ферменты.

Для изучения сахаролитических ферментов выделенные культуры засевают в пробирки с полужидкими средами, содержащими лактозу, глюкозу и другие углеводы и многоатомные спирты. На полужидкие среды посев делают уколом в глубину среды. При посеве уколом пробирку со средой держат под наклоном, вынимают проб­ку, обжигают край пробирки. Материал забирают стерильной петлей и прокалывают ею столбик питательной среды почти до дна.

Для определения протеолитических ферментов выделенную культуру засевают на пептонную воду или МПБ. Для этого в руку берут про­бирку с посевом ближе к себе, а пробирку со средой - дальше от себя. Обе пробирки открывают одномоментно, захватив их пробки мизинцем и краем ладони, обжигают края пробирок, прокаленной охлажденной петлей захватывают немного культуры и переносят во вторую пробирку, растирают в жидкой среде на стенке пробирки и смывают ее средой.

При посевах и пересевах внимание должно быть обращено на соблюдение правил стерильности, для того, чтобы не загрязнять свои посевы посторонней микрофлорой, а также не загрязнять окружающую среду. Пробирки маркируют и помещают в термостат для инкубирования при температуре 37°Сна сутки.

Заключение

Учет результатов. Заключение по исследованию. Учитывают результаты идентификации и по совокупности полученных данных, опираясь на классификацию и характеристику типовых штаммов, описанных в руководстве (определитель Берджи, 1994-1996 гг.), определяют вид выделенных культур.

Культуральный метод исследования представляет собой выделение из питательной среды бактерий определённого вида путём культивирования, с их последующей видовой идентификацией. Вид бактерий определяется с учётом их строения, культуральных и экологических данных, а также генетических, биохимических и биологических показателей.

Выведенные из питательной среды новые виды бактерий, свойства которых ещё не определены, называются чистой культурой. После окончательной идентификации их характеристик, бактерии, выведенные из определённого места и в определённое время, получают название штамм. При этом допускается незначительное различие в свойствах, месте или времени выделения штамма одного вида.

1 этап

А) Подготовительные мероприятия . Эта стадия включает в себя забор, хранение и транспортировку материала. Также, при необходимости, может проводиться его обработка, в зависимости от свойств изучаемых бактерий. Например, при обследовании материала на туберкулёз, для выявления кислоустойчивых микробактерий используются растворы щёлочи или кислоты.

Б) Обогащение . Данная стадия не является обязательной и проводится в том случае, если количества бактерий в исследуемом материале недостаточно для проведения полноценного исследования. Например, при выделении гемокультуры, исследуемую кровь помещают в среду в соотношении 1 к 10 и хранят в течение суток при температуре 37 о.

В) Микроскопия . Мазок исследуемого материала окрашивается и изучается под микроскопом - исследуется микрофлора, её свойства и количество. В дальнейшем из первичного мазка необходимо отдельно выделить все находящиеся в нём микроорганизмы.

Г) Создание отдельных колоний . На чашку, со специальной, селективной средой, наносится материал, для этого используют петлю или шпатель. Далее, устанавливают чашку вверх дном, для защиты колоний от конденсата, и хранят в термостате около 20 часов, поддерживая температуру 37 о.

Важно! Следует помнить, что в процессе исследования, необходимо придерживаться правил изоляции. С одой стороны, для защиты исследуемого материала и выводимых бактерий, и с другой стороны, для предотвращения заражения окружающих лиц и внешней среды.

Что касается условно-патогенных микроорганизмов, то при их выведении, имеет значение их количественная характеристика. В этом случае, проводится количественный посев, при котором проводят несколько стократных разведений материала в изотоническом растворе хлорида натрия. После, осуществляют посев в чашки Петри по 50 мкл.

2 этап

А) Изучение морфологических свойств колоний в средах и их микроскопия . Исследуются чашки и отмечаются свойства микроорганизмов, показатели их количества, темпы роста, а также отмечается наиболее подходящая питательная среда. Для изучения лучше всего выбрать колонии, располагающиеся ближе к центру, и если образуется несколько типов чистых культур, то изучить каждую в отдельности. Для изучения морфотипной чистоты культуры используют мазок колонии, его окрашивают (обычно используется метод по Граму или же любой другой) и тщательно микроскопируют.

Б) Накопление чистой культуры . Для этого колонии всех морфотипов рассаживают в отдельные пробирки с питательной средой и содержат в термостате при определённой температуре (для большинства микроорганизмов подходящей является температура 37 о, но в некоторых случаях может быть иной).

Питательной средой для накопления часто служит среда Клиглера. Она имеет «скошенный» вид в пробирках, где 2/3 её части в виде столбика, а 1/3 – скошенная поверхность, окрашена в светло-красный цвет. Состав:

· 0,1% глюкозы;

· 1% лактозы;

· Специальный реактив на сероводород;

· Феноловый красный индикатор.

3 этап

А)Уровень роста и чистоты культуры . В общем порядке, выведенная чистая культура имеет однородный рост и при микроскопическом рассмотрении клетки имеют одинаковое морфологическое и тинкториальное строение. Но встречаются некоторые виды бактерий с ярковыраженным плеофоризмом, при этом, встречаются клетки, имеющие различное морфологическое строение.

Если в качестве питательной среды использовалась среда Клиглера, то по изменению цвета столбика и скошенной части определяются биохимические характеристики. Например, если происходит разложение лактозы - желтеет скошенная часть, если глюкозы - пожелтение столбика; при продукции сероводорода происходит почернение из-за перехода сульфата в сульфид железа.

Как можно заметить на рисунке, среда Клиглера имеет свойство изменять свой цвет. Это происходит из-за того, что расщепление бактериями азотистых веществ и образование продуктов щёлочи происходит неоднородно как в столбике (анаэробные условия), так и на скошенной поверхности (аэробные условия).

В аэробной среде (скошенная поверхность) наблюдается более активное образование щёлочи, чем в анаэробной среде (столбик). Поэтому, когда происходит разложение глюкозы, кислота на скошенной поверхности без труда нейтрализуется. Но, при разложении лактозы, концентрация которой намного больше, кислоту не выходит нейтрализовать.

Что касается анаэробной среды, то щелочных продуктов генерируется крайне мало, поэтому здесь можно наблюдать, как глюкоза ферментируется.

E. coli – способствует разложению глюкозы и лактозы с образованием газов, не производит водород. Вызывает пожелтение всей среды с разрывами.

S. paratyphi – способствует разложению глюкозы с образованием газов, лактозоотрицателен. Скошенная часть цвет не изменяет, столбик – желтеет.

S. paratyphi A- не продуцирует сероводород.

S. paratyphi B – сероводород продуцируется (по ходу укола проявляется чёрный цвет).

S. typhi – глюкоза разлагается без газообразования, сероводород продуцируется, лактозоотритателен. Скошенная часть не изменяет цвета, столбик – желтеет и среда чернеет по ходу укола.

Shigella spp.- лактозоотрицателен, глюкозоположителен, сероводород не продуцируется. Столбик приобретает жёлтый оттенок, а скошенная часть остаётся прежней.

Б) Финальная идентификация чистой культуры и её реакция на антибиотики . На данном этапе изучаются биохимические, биологические, серологические и генетические свойства культуры.

В исследовательской практике не возникает необходимости в изучении полного спектра свойств микроорганизмов. Достаточно использовать простейшие тестирования для определения принадлежности микроорганизмов к тому или иному виду.