Цитологическое исследование и его значение в онкологии. Цитологическое исследование — щадящий метод ранней диагностики Методы цитологических исследований кратко
От наследственных (генетических) болезней тяжело страдают не только жертвы этих болезней, но и их семьи. Родителей иногда мучает чувство вины, что толкает их к алкоголю, наркотикам и доводит до развода. Уход за больным ребенком поглощает время, энергию и средства, порой лишая других детей нормальной домашней обстановки.
Вместе с тем с помощью генетических методов можно определить, насколько велик риск рождения больного ребенка. Известно несколько методов изучения наследственности человека.
Генетический метод
Основой данного метода является изучение родословной той или иной семьи. Этот метод помогает установить закономерности наследования разнообразных признаков человека как нормальных, так и тех, что связаны с наследственными болезнями.
Близнецовый метод
Известно, что различия между разнояйцовыми близнецами обусловлены генотипом, а между однояйцовыми - факторами среды. Поэтому благодаря исследованиям близнецов можно установить влияние среды и наследственности на развитие различных признаков, в том числе и болезней. Например, корью болеют как однояйцовые, так и разнояйцовые близнецы, что подтверждает зависимость болезни от факторов среды, от попадания в организм возбудителя болезни.
Заболевание дифтерией или туберкулезом вызывается их возбудителями, но в риске заболевания этими болезнями играет роль генотип. И, если заболел этой болезнью один из однояйцовых близнецов, вполне вероятно, что заболеет и другой.
Цитологический метод
Цитологический метод - основан на микроскопическом исследовании структуры хромосом у здоровых и больных людей. Аномальное число половых хромосом (больше или меньше 46) возникает в тех случаях, когда нарушается расхождение хромосом в мейозе и в гаметы попадает на одну хромосому больше или меньше (синдром Дауна, синдром Шерешевского-Тернера и др.).
Биохимический метод
Биохимический метод основан на исследовании биохимических процессов, протекающих в организме, называемых метаболизмом (обмен веществ). Известно много наследственных болезней, связанных с нарушением метаболизма (врожденных нарушений), среди которых - альбинизм.
Использование описанных методов в генетике и медицине позволяет вовремя определить те или иные нарушения, происходящие в организме на клеточном уровне. Так, анализ крови позволяет определить такие генетические аномалии, как болезнь Тея-Сакса, серповидноклеточная анемия, гемофилия, кистозный фиброз, вызываемые теми или иными генными нарушениями (мутациями).
Другие генетические аномалии обусловливаются не наличием мутационных генов, а нарушением поведения хромосом во время мейоза (синдром Дауна), а именно: нерасхождение 21-й или 22-й пары хромосом при мейозе. Индивидуумов с такой болезнью отличает ряд характерных признаков: умственная отсталость, наличие кожной складки у угла глаз, коренастое телосложение и жизнерадостность.
В настоящее время генетика и медицина располагают методикой, позволяющей обнаруживать аномальное число хромосом у плода на 16-й неделе беременности. Для этого берут пробу околоплодной жидкости путем пункции плодного пузыря, исследуют ее клетки и определяют, нет ли в них хромосомных аномалий.
Недавно ряду исследователей удалось добиться снижения частоты некоторых наследственных заболеваний у лабораторных животных. Это позволяет надеяться, что со временем можно будет обнаруживать и лечить некоторые генетические болезни человека еще на стадии плода.
Ануфриев Игорь Иванович пульмонолог — Доцент кафедры фтизиатрии и пульмонологии Ростовского государственного медицинского университета, заведующий отделением пульмонологии Ростовского государственного медицинского университета.
Боханова Елена Григорьевна — Заведующая терапевтическим отделением, кандидат медицинских наук, врач высшей категории, ассистент кафедры пропедевтики внутренних болезней РостГМУ, врач-пульмонолог.
Киртанасова Людмила Николаевна — врач — пульмонолог высшей квалификационной категории.
Редактор страницы: Цитологический метод исследования: Турбеева Е.А.
***********************
Книга «Болезни органов дыхания Том 1.» (Автор Н.Р. Палеева).
В диагностике заболеваний легких значительное место занимает цитологический метод. Многочисленные способы получения материала для цитологического исследования условно можно разделить на две группы:
- 1) позволяющие изучить материал из первичного очага - бронхов, легких: исследование мокроты, материала, полученного при бронхоскопии (в том числе при БАЛ), катетеризации бронхов, трансторакальной пункции, открытой биопсии легкого (отпечатки кусочка ткани);
- 2) позволяющие установить распространение патологического процесса за пределы легкого: изучение плевральной, перикардиальной, асцитической жидкости, пунктатов регионарных (субкаринальная пункция) и периферических лимфатических узлов, материала из метастатических очагов в других органах.
Научно обоснованная система организации цитологических исследований предполагает рациональную их тактику (алгоритм). Алгоритм цитологического исследования является.неотъемлемой составной частью всего диагностического алгоритма (см. главу 30). Наиболее важные его принципы: первоочередное применение эффективных и безопасных способов, предпочтительность одномоментных комплексных исследований для получения точного цитологического диагноза в максимально короткие сроки при минимальном числе проб материала, преемственность информации. Кроме того, учитываются особенности течения патологического процесса и уровень рентгеноэндоскопического оснащения учреждения.
Разнородность клеточных элементов бронхов и легких, высокая пластичность эпителия дыхательных путей, многообразие заболеваний легких, частое метастазирование в легкое злокачественных опухолей других органов, наконец, применение перечисленных выше способов получения материала - все это создает широкие вариации цитологической картины, правильная оценка которой требует от клинициста-цитолога специального опыта и знаний.
С учетом своеобразия цитологических картин и уровня получаемой информации ниже раздельно рассмотрены цитологическое исследование мокроты, ЖБАЛ, а также материала, полученного при биопсии.
ЦИТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МОКРОТЫ
Цитологический анализ мокроты весьма перспективен, так как клеточный ее состав обычно отражает особенности патологического процесса в бронхах и легких и во многих случаях дает возможность уточнить морфологический диагноз, от которого зависят выбор и результаты лечения [Казанцева В. М., 1980; Клюкина Л. Б., Тульчинский Б. Р., 1983].
Цитологическое исследование мокроты не требует дополнительных инструментальных вмешательств для взятия материала; он может быть многократно получен без затруднений в динамике заболевания как в стационаре, так и амбулаторно.
Успех цитологического исследования зависит в первую очередь от соблюдения правил сбора, транспортировки, хранения, подготовки и обработки мокроты.
Мокроту рекомендуется собирать натощак путем отхаркивания после предварительного трехкратного полоскания рта водой, а затем 1 % раствором алюминиевых квасцов. Утренняя порция мокроты наиболее полно отражает клеточный ее состав, поскольку полученный секрет скапливается в течение всей ночи.
Мокрота представляет собой негомогенную вязкую жидкость, в которой неравномерно распределены клеточные элементы. Это затрудняет проведение количественных цитологических исследований, требующих равномерного распределения клеток в полях зрения и их подсчета в стабильных условиях. В связи с этим перед исследованием необходимо гомогенизировать мокроту.
Один из распространенных способов гомогенизации заключается в добавлении к мокроте 0,5% раствора щелочи в соотношении 1:1 с последующим встряхиванием в течение 10-15 мин; затем смесь выдерживают на водяной бане в течение 30 мин при температуре 55-56 °С. Однако под влиянием щелочи и температуры происходит разрушение части клеток, что влияет на результат исследования. Целесообразнее гомогенизировать мокроту добавлением 1-2,5 % водного раствора димексида в соотношении 1:1.
Димексид легко проникает в ткани и обеспечивает хорошую сохранность клеточных структур исследуемого материала. Гомогенизацию можно производить также струей воздуха, который подается от компрессора через канюлю в плевательницу с крышкой. Надосадочную жидкость сливают, а клеточный осадок используют для подготовки к последующим цитологическим исследованиям.
Для приготовления нативного препарата мокроты существенным моментом оказывается распределение клеточного осадка на предметном стекле. Материала нужно брать столько, чтобы при накладывании покровного стекла клеточный осадок был распределен равномерным тонким слоем и не выступал за края покровного стекла. Если препараты исследуют не сразу, то во избежание высыхания их помещают во влажную камеру.
Целью цитологического исследования нативного препарата мокроты является предварительная оценка материала. В нативных препаратах легко обнаруживаются спирали Куршмана, которые иногда видны и простым глазом. Они представляют собой извитую блестящую центральную нить, которая покрыта мантией из лейкоцитов, клеток цилиндрического эпителия, кристаллов Шарко - Лейдена, которые ввиду их светлой окраски следует искать в темных комочках мокроты.
Для, формирования кристаллов в мокроте необходимо сохранение ее под покровным стеклом, т. е. без доступа воздуха, в течение 24- 48 ч. Присутствие кристаллов обычно коррелирует с повышенным содержанием эозинофилов в мокроте.
Некротизированные кусочки легкого представляют собой обрывки ткани темного цвета, в которых под микроскопом обнаруживаются альвеолярное строение и инертные включения типа пыли. Некротизированная легочная ткань характерна для инфекционных деструкций легких (абсцесс, гангрена).
В нативных препаратах мокроты могут быть обнаружены и атипические клетки, имеющие значение при диагностике опухолей.
Плоский эпителий из глотки и голосовых складок представляет собой многоугольные клетки, которые в 10-15 раз больше лейкоцитов.
Клетки мерцательного эпителия, преобладающие в воздухоносных путях, в нативных препаратах имеют вид клеток цилиндрической или кубической формы с каймой из ресничек; ядро, обычно овальной формы, лежит в противоположной (базальной) части клетки. Лейкоциты (нейтрофилы, лимфоциты) дифференцировать в нативном препарате практически невозможно.
Исключение составляют эозинофилы, которые темнее остальных клеток в связи с наличием в них крупной зернистости. Эритроциты представляют собой округлой формы образования, располагающиеся в тяжах слизи. Практически в мокроте всегда встречаются единичные эритроциты. Легочные макрофаги в нативном препарате по сравнению с другими клетками более крупные и содержат различные включения.
Эластические волокна встречаются в мокроте больных с деструктивным туберкулезом, абсцессом легкого, злокачественными новообразованиями. Для их обнаружения необходимо тщательное исследование нативного препарата сначала под малым, затем под большим увеличением. На светлом фоне эластические волокна выявляются более темным цветом. Они представляют собой тонкие, извитые нити, хорошо преломляющие свет.
Дополнительную информацию получают при цитологическом исследовании фиксированных окрашенных препаратов мокроты.
В центрифужную мерную пробирку отбирают 0,1 мл мокроты и из этого количества готовят мазки на двух предметных стеклах, причем на одно стекло наносят 0,5 мл осадка, который распределяют равномерно путем смещения стекол относительно друг друга (толщина клеточного осадка на одном стекле составляет около 50 мкм).
Полученный мазок высушивают, фиксируют метанолом и окрашивают по Романовскому-Гимзе. Подсчёт клеток производят под микроскопом при увеличении 200 (окуляр 10, объектив 20) и 280 (окуляр 7, объектив 40).
Кроме того, можно использовать окраску по методу Паппенгейма, метиленовым синим, а также азурэозиновой смесью. В окрашенных препаратах исследуемой мокроты обнаруживаются клеточные элементы крови (эритроциты, нейтрофильные лейкоциты, эозинофильные лейкоциты, лимфоциты), макрофаги, клетки многослойного плоского и цилиндрического эпителия.
Клетки многослойного плоского эпителия полости рта, глотки имеют полигональную форму, относительно мелкие, центрально расположенные ядра и оксифильную цитоплазму. Клетки более глубоких слоев отличаются овальной или округлой формой; они легко распознаются.
Определенные трудности при дифференцировке клеточных элементов возникают в период клинического выздоровления, например, у больных пневмонией. У них отмечается увеличение клеток бронхиального эпителия, утративших реснички и характерную цилиндрическую форму. Это явление объясняют слущиванием регенерирующего эпителия бронхов, гиперплазированного в результате воспалительного процесса.
Многоядерные эпителиальные клетки появляются в мокроте при хронических воспалительных процессах в легких вследствие раздражения бронхиального эпителия.
Особого внимания при цитологическом исследовании мокроты заслуживает обнаружение атипических клеток. Это дает возможность не только предположить злокачественное новообразование, но иногда судить о его гистологическом типе (подробнее см. раздел 28.3).
Атипические клетки могут встречаться и при хронических формах туберкулеза с выраженной пролиферативной реакцией ткани, но при этом отмечается общее незначительное число клеточных элементов, характерное для мокроты при туберкулезе. Однако диагноз необходимо уточнить на основании дополнительных исследований.
На фиксированных препаратах эритроциты представляют собой желтоватые диски с двойным контуром. Число их невелико, и диагностического значения они не имеют. В большом количестве эритроциты встречаются при кровохарканье.
Основную часть лейкоцитов клеточных форм составляют нейтрофилы, которые имеют округлую, реже неправильную, форму с зернистой протоплазмой и ядром, состоящим из нескольких частей.
Увеличенное число дегенеративных форм лейкоцитов, высокое содержание альвеолярных макрофагов наблюдается при острой пневмонии, обострении хронического бронхита. При деструктивных процессах в легких в мокроте преобладают дегенеративные формы нейтрофилов с фрагментацией ядер и разрушением цитоплазмы. Признаком благоприятного течения процесса является увеличение числа сохранившихся неизмененными нейтрофилов.
Выявление эозинофилов требует специальной окраски мокроты азурэозином или эозин-метиленовым синим, при которой равномерная зернистость этих клеток окрашивается в красный цвет. Эозинофилы распределяются в мокроте крайне неравномерно, поэтому для их выявления иногда необходимо исследовать весь препарат. Выявляются эозинофильные гранулоциты чаще в мокроте больных бронхиальной астмой, хроническим бронхитом с астматическим компонентом.
Лаброциты окрашивают 1 % спиртовым раствором толуидинового синего. Их присутствие характерно для мокроты больных бронхиальной астмой. При обострении заболевания обращает на себя внимание дегрануляция тучных клеток с незначительной интенсивностью окраски гранул.
Лимфоциты по Романовскому - Гимзе окрашиваются интенсивно вследствие наличия в них густой сети хроматина. Клетки имеют округлую форму, небольшой ободок протоплазмы синеватого цвета. Повышенное содержание лимфоцитов наблюдается у больных туберкулезом, хроническим бронхитом со значительными изменениями эпителия [Шлопов В. Г. и др., 1986].
Альвеолярные макрофаги представляют собой крупные клетки с эксцентрично расположенным ядром и вакуолизированной цитоплазмой..Азур-эозином они окрашиваются в светло-голубой цвет, содержат различные включения. Их число в мокроте варьирует в зависимости от фазы процесса.
С клинической точки зрения важно определить число фагоцитирующих клеток, их функциональную активность. Характеристика фагоцитарной активности легочных макрофагов может быть выражена индексом отношения макрофагов, фагоцитировавших поврежденные лейкоциты, к общему числу макрофагов, а также путем определения жизнеспособности макрофагов методом прижизненного окрашивания трипановым синим.
Метод основан на выявлении погибших клеток трипановым или метиленовым синим. Мокроту смешивают с 2,5 % раствором димексида в соотношении 1:1, а затем центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин. В микропипетку набирают 0,01 мл клеточной взвеси, подсчитывают общее количество макрофагов в камере Фукса - Розенталя и по отношению к ним определяют процент погибших клеток.
Определение общего количества клеток в 1 мл мокроты производят в камерах Горяева или Фукса - Розенталя, с помощью гемоцитометра [Журавлев А. В., 1980].
Более детальный (ультраструктурный) анализ клеток мокроты требует применения трансмиссионной и растровой электронной микроскопии.
Диагностический БАЛ обеспечивает получение бронхоальвеолярного смыва или жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ), содержащей клеточные элементы, белковые и другие компоненты. Соотношение суммарных поверхностей альвеол и бронхов, подвергаемых лаважированию, приблизительно 20:1, поэтому преобладающей составной частью бронхоальвеолярного смыва является вымываемое альвеолярное содержимое. Во время одной процедуры происходит вымывание содержимого приблизительно 106 альвеол .
В зависимости от поставленных задач изучение ЖБАЛ может ограничиваться определением количества и видов клеточных элементов или дополниться уточнением их ультраструктуры, функциональной активности, применением методик, направленных на выявление патогенных микроорганизмов. Исследование ЖБАЛ, полученной после удаления клеточных элементов путем центрифугирования, позволяет установить содержание Ig, ферментов, БАВ и других ингредиентов.
Для определения общего количества клеток забирают 1-2 мл ЖБАЛ после фильтрации через марлю для освобождения от примеси слизи. Подсчет числа клеток в 1 мл ЖБАЛ осуществляют в гемоцитометре. Для других цитологических исследований используют осадок из клеточных элементов, получаемый путем центрифугирования при температуре +4 °С.
Из осажденных клеток приготавливают мазки, которые окрашивают по Романовскому - Гимзе, гематоксилин-эозином или другими красителями и подвергают микроскопическому исследованию. Соотношение клеточных элементов (альвеолярные макрофаги, лимфоциты и нейтрофилы) устанавливают на основании подсчета 200-500 клеток.
Для более точного различия малых форм альвеолярных макрофагов и крупных лимфоцитов могут быть применены специальные методики: окраска нейтральным красным, определение фагоцитарной способности клеток. Электронно-микроскопическое исследование ультраструктуры альвеолярных макрофагов и других клеток производят после фиксации клеточных элементов в 1,25 % глутаровый альдегид и приготовления препаратов.
В связи с тем, что объем аспирируемой ЖБАЛ варьирует от 30 до 80 % по отношению к вводимому объему жидкости и невозможно установить степень разведения альвеолярного содержимого, определение абсолютного содержания белковых и других компонентов в 1 мл ЖБАЛ имеет сравнительно небольшое значение.
Для стандартизации получаемых показателей используют отношение белковых веществ к альбумину, который всегда обнаруживается в ЖБАЛ. Альбумин не синтезируется и не разрушается в легком, обладает молекулярной массой, находящейся в диапазоне белков сыворотки крови, которые проникают через гематоальвеолярный барьер.
Соотношение с альбумином позволяет судить, увеличено или уменьшено содержание исследуемого компонента в ЖБАЛ по сравнению с концентрацией в сыворотке крови.
Данные БАЛ оценивают с учетом особенностей методики забора материала и других факторов, которые могут влияние на клеточный состав и другие компоненты, примесь клеточных элементов бронхов обычно более значительно в первой порции ЖБАЛ и уменьшается во второй и третьи!
В то же время содержание альвеолярных клеточных элементов приблизительно идентично во всех порциях. Принято считать, что более точное представление об альвеолярном клеточном составе обеспечивает исследование не первой, а последующих порций ЖБАЛ . Увеличение примеси нейтрофилов бронхиального происхождения отмечается при наличии воспалительного процесса в бронхиальном дереве, особенно при гнойном бронхите, являющемся противопоказанием к диагностическому БАЛ.
Цитологические показатели, принятые за норму, отличаются- некоторой вариабельностью в связи с различиями в методике исследования. Общее число клеток в 1 мл ЖБАЛ составляет приблизительно 0,5-10- 106. Более высокое содержание клеточных элементов отмечается у курящих. Среди клеток преобладают альвеолярные макрофаги (93 ± 5 %).
Значительно реже обнаруживаются лимфоциты (7 ± 1 %). Нейтрофилы представлены лишь единичными клетками (менее 1 %). Другие клеточные элементы (эозинофилы, лаброциты и др.) встречаются еще более редко (0,1 %).
Соотношение различных видов лимфоцитов приблизительно аналогично таковому в периферической крови: Т-лимфоциты составляют 73%, В-лимфоциты - 7%, а лимфоциты, не взаимодействующие с реагентами, применяемыми для идентификации Т- и В-лимфоцитов (нулевые клетки), - 19 %.
Диагностические возможности БАЛ при заболеваниях легких в значительной мере связаны с изучением клеточного состава ЖБАЛ.
Цитологическое исследование позволяет диагностировать некоторые заболевания легких на основании обнаружения характерных клеточных элементов. К таким заболеваниям прежде всего относится гистиоцитоз X, при котором в альвеолярных макрофагах формируются своеобразные включения - тельца X.
Обнаружение этих включений возможно при электронно-микроскопическом изучении ультраструктуры альвеолярных макрофагов и с помощью метода иммунофлюоресценции с моноклональными антителами к антигену Те. Менее четко включения определяются При окраске препаратов гематоксилин-эозином. Неопластическое поражение легких может быть диагностировано при выявлении в ЖБАЛ опухолевых клеток, часто располагающихся группами в виде комплексов.
Определенную роль в уточнении вида патологии играет обнаружение альвеолярных макрофагов со скоплениями гемосидерина, т. е. сидерофагов, характерных для гемосидероза легких, или альвеолярных макрофагов с протеиновыми включениями, наблюдающихся при протеинозе.
Однако, учитывая, что аналогичные клетки, в частности сидерофаги, могут выявляться при других заболеваниях (синдром Гудпасчера и др.), следует признать, что такая цитологическая картина не может служить основанием для уточнения диагноза, а имеет лишь ориентировочное значение.
Сравнительно часто БАЛ применяется как способ, позволяющий получить сведения о характере и степени активности патологического процесса в легких при различных формах альвеолитов. На основании сопоставления данных изучения клеточного состава ЖБАЛ и результатов гистологического исследования установлено, что соотношение клеточных элементов в ЖБАЛ и в интерстициальной ткани легкого практически идентично .
Цитологическое исследование ЖБАЛ производится с учетом представления о двух основных типах альвеолитов, лежащих в основе диссеминированных процессов, - нейтрофильном и лимфоцитарном. Цитологическими признаками альвеолита нейтрофильного типа, наблюдающегося при идиопатическом фиброзирующем альвеолите, асбестозе и других заболеваниях, является увеличение числа альвеолярных макрофагов и нейтрофилов.
Лимфоцитарный альвеолит, сопровождающийся формированием гранулем и развивающийся при таких заболеваниях, как саркоидоз, экзогенный аллергический альвеолит и др., проявляется возрастанием количества альвеолярных макрофагов и лимфоцитов. При некоторых заболеваниях лёгких диагностическую ценность представляет определение подвидов лимфоцитов, принимающих наиболее активное участие в развитии лимфоцитарного альвеолита.
Такими подвидами при саркоидозе являются Т4-лимфоциты (хелперы), а при экзогенном аллергическом альвеолите - Tg-лимфоциты (супрессоры).
Кроме уточнения формы альвеолита, цитологическое исследование ЖБАЛ позволяет судить о степени активности процесса и может быть использовано для прогнозирования течения заболевания. Активность альвеолита обычно пропорциональна возрастанию количества нейтрофилов или лимфоцитов.
К неблагоприятным прогностическим симптомам относится стойкая цитологическая картина ЖБАЛ с высоким содержанием соответствующих клеток, свидетельствующая о высокой активности диссеминированного процесса. При этом однократного исследования, как правило, недостаточно для заключения относительно прогноза заболевания.
Лишь сравнительная оценка цитологических признаков активности при повторных БАЛ на фоне проводимой терапии позволяет судить о тенденции к прогрессированию или стабилизации процесса.
Приблизительно у трети больных с диссеминированными процессами отсутствуют характерные изменения клеточного состава ЖБАЛ.
Диагностический БАЛ может быть применен для выявления возбудителя инфекционного воспалительного процесса в легких, преимущественно с целью обнаружения микроорганизмов, вызывающих развитие так называемой оппортунистической инфекции у больных с иммунодефицитом . Микробиологические методы исследования изложены в главе 24.
ЦИТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МАТЕРИАЛА,ПОЛУЧЕННОГО ПРИ БИОПСИИ.
Правильная оценка данных цитологического исследования материала, полученного при биопсии, требует учета некоторых деталей применяемых способов его взятия (см. главу 22).
Во время бронхоскопии материал получают в виде мазков, соскоба щеточкой на участке поражения, аспиратов бронхиального содержимого, ЖБАЛ, трансбронхиальных пунктатов, отпечатков биопсированного кусочка ткани. Взятие аспиратов и мазков - наименее инвазивный способ, дающий возможность изучить поверхностные участки слизистой оболочки бронха, патологического образования.
При исследовании мазков отрицательный результат иногда обусловлен тем, что удается получить лишь некротизированные массы с поверхности патологического очага. Для анализа более глубоких участков области предполагаемого поражения бронха производят соскоб щеточкой, а при перибронхиальной локализации патологического процесса (например, опухоли) - трансбронхиальную пункцию.
Изучение отпечатков биопсированного во время бронхоскопии кусочка ткани повышает результативность морфологической диагностики ряда заболеваний. Доказана более высокая информативность цитологического исследования, в том случае, если бронхоскопию проводят под общим наркозом.
Катетеризация бронхов может осуществляться во время бронхоскопии и без нее (интраназально под местной анестезией; при последней для наилучшей сохранности клеток не следует применять водные растворы анестетиков). По характеру получаемого материала обе методики сходны. Травматизация участка поражения металлической струной, тросиком, нейлоновой щеточкой предпочтительнее простой аспирации содержимого.
В течение одного исследования рациональным является получение не менее трех проб материала. В момент извлечения катетера аспирацию не производят, так как материал из патологического очага в легком разбавляется бронхиальным секретом, что затрудняет микроскопирование.
Основным условием успешного проведения катетеризации является соответствие диаметра катетера и бронха; катетеризация становится невозможной при патологических очагах, ограничивающихся поражением бронхов 5-6-го порядка.
Достоинством инструментальных способов является то, что они позволяют целенаправленно изучить материал практически из любого участка легкого, т. е. дают информацию о локализации патологического процесса. В отличие от мокроты и ЖБАЛ биопсийный материал характеризуется лучшей сохранностью, большей концентрацией клеток на единицу площади предметного стекла и отсутствием примесей клеток из полости рта. В связи с этим микроскопирование требует меньше времени, что важно при обследовании больных в условиях диспансеризации.
Приготовленные мазки высушивают на воздухе, окрашивают азурэозиновыми смесями (по Лейшману, Паппенгейму, Романовскому - Гимзё) или гематоксилин-эозином. При необходимости применяют специальные окраски на слизь, жир, железо, микобактерии туберкулеза (по Цилю - Нильсену), различные бактерии, грибы (метенамином серебра, по Граму) и т.д.
Для того чтобы правильно оценить изменения цитологической картины при различных заболеваниях легких, необходимо четко представлять себе исходные данные - цитологические особенности эпителиальных и неэпителиальных клеток в биопсийном материале (морфологическая характеристика клеток дыхательной системы в главе 1).
Эпителиальные клетки представлены в нем клетками многорядного цилиндрического (призматического) эпителия бронхов, однорядного кубического эпителия бронхиол (клетки Клара), альвеолярного (респираторного) эпителия.
Гораздо реже в биопсийном материале обнаруживают цилиндрический эпителий слизистой оболочки носа, глотки, трахеи, а также многослойный плоский неороговевающий эпителий слизистой оболочки полости рта, миндалин, носоглотки, гортани, надгортанника, голосовых связок (см. раздел. 28.1).
В бронхиальном эпителии различают клетки трех типов: цилиндрические реснитчатые, бокаловидные и базальные. В зависимости от расположения на стекле форма реснитчатых клеток может быть треугольной, округлой, неправильной. При расположении цилиндрических клеток в скоплениях перпендикулярно стеклу выявляются сетчатые структуры, напоминающие пчелиные соты, в ячейках которых видны округлые ядра.
Клетки герминативного слоя эпителия (так называемые базальные) в инструментальном материале обнаруживают при механическом повреждении глубоких слоев слизистой оболочки бронхов во время соскоба щеточкой. Эти мелкие (примерно равные по величине лейкоциту) однотипные, округлые и полигональные клетки, с относительно большим центрально расположенным гиперхромным ядром и узким, едва заметным ободком цитоплазмы иногда видны в одном скоплении с реснитчатыми клетками.
Клетки кубического эпителия бронхиол идентифицируют по характерному расположению в виде палисадообразного ряда; типичны пузырчатое ядро с небольшим ядрышком и светлая гомогенная цитоплазма.
Клетки альвеолярного эпителия (пневмоциты I и II типа) в норме не идентифицируются как таковые. В мазках они «теряются» в группе эпителиальных кубических клеток различного происхождения (изолированные клетки эпителия бронхиол, клетки потерявшего реснички и часть цитоплазмы цилиндрического эпителия) .
Неэпителиальные клетки (гистиоциты, альвеолярные, макрофаги, лейкоциты, плазмоциты, моноциты, тучные клетки, эритроциты, мегакариоциты), а также неэпителиальные структуры (слизь, спирали Куршмана, кристаллы Шарко - Лейдена, игольчатые кристаллы холестерина, аморфные массы извести, асбестовые тельца) описаны в разделе 28.1.
Оценка изменений, выявляемых при цитологическом исследовании инструментального материала, проводится с учетом Международной гистологической классификации опухолей легких (ВОЗ, 2-е изд., 1981), цитологической классификации поражений легких (СЭВ, 1983), классификации заболеваний и патологических состояний бронхолегочной системы («Справочник по пульмонологии» под ред. Н. В. Путова, Г. Б. Федосеева, А. Г. Хоменко, 1987).
При различных заболеваниях легких, связанных с биологическими патогенными возбудителями, воздействием химических, физических факторов, опухолями и т. п., возникает комплекс стереотипных реактивных изменений, включающий гиперплазию, плоскоклеточную метаплазию и дистрофию эпителиальных клеток (см. также главу 2).
Хотя эти изменения не могут служить основой для верификации определенного заболевания легких, их правильная оценка помогает исключить ошибки диагностики, а в ряде случаев может стать маркером интерпретации клинических данных и позволяет выбрать рациональную тактику обследования и наблюдения за больными.
Гиперплазия цилиндрических и бокаловидных клеток. Проявляется увеличением числа и объема соответствующих элементов. Часто наблюдается при хроническом бронхите, бронхоэктазах, бронхиальной астме, реже - при вирусных и других заболеваниях легких. О гиперплазии реснитчатых клеток свидетельствует увеличение в мазках размеров клеток, ядер, ядрышек, появление двух-, трех- и многоядерных клеток и сосочковых скоплений.
Последние сформированы из однотипных округлых клеток с гиперхромными ядрами и частично или на всем протяжении покрыты кубическим (цилиндрическим) эпителием; в отдельных клетках отмечаются кутикулярная каемка и реснички. Признаком гиперплазии является также увеличение числа митозов.
Появление большого числа многоядерных клеток бронхиального эпителия с многочисленными однотипными ядрами (до 20), крупными ядрышками и базофильной цитоплазмой рассматривается как указание на «раздражение» слизистой оболочки бронхов, например, после повторных бронхоскопий.
О гиперплазии бокаловидных клеток свидетельствуют увеличение их числа, появление скоплений и признаков, аналогичных признакам гиперплазии реснитчатых клеток.
Различают гиперплазию реснитчатых и бокаловидных клеток с атипией легкой, умеренной или тяжелой степени. При гиперплазии с атипией легкой степени в укрупненных клетках сохранено нормальное ядерно-цитоплазматическое соотношение, хроматин равномерно мелкозернистый.
При гиперплазии с умеренной атипией ядерно-цитоплазматическое соотношение в отдельных клетках увеличено, появляются клетки с гиперхромными ядрами, увеличенными ядрышками, хроматин равномерно мелкозернистый, контуры ядерной оболочки ровные.
Для гиперплазии эпителия с атипией тяжелой степени (в настоящее время такие изменения чаще называют тяжелой дисплазией эпителия) характерна вариабельность величины клеток и ядер, ядерно-цитоплазматического соотношения с отчетливой наклонностью последнего к повышению, а также появление крупных гиперхромных ядер, иногда с утолщенной ядерной мембраной, неравномерным распределением грубозернистого хроматина, увеличением ядрышек.
В ряде случаев оценка изолированных цилиндрических клеток с признаками атипии трудна. Расположение их среди неизмененных клеток реснитчатого эпителия должно настораживать в отношении рака. Неопухолевая природа клеток становится очевидной, если прослеживается их связь с реснитчатым эпителием или в них самих обнаруживают реснички и (или) кутикулярную каемку.
Иногда в многоядерной клетке наслаивание ядер одного на другое приводит к образованию гиперхромного конгломерата, сходного с уродливым ядром раковой клетки. Равномерное окрашивание ядер, обусловленное неразличимой структурой хроматина, их однотипность, отсутствие групп, скоплений, изолированность клеток свидетельствуют против диагностики опухоли.
Особые трудности возникают при дифференциальной диагностике сосочковых скоплений эпителия (с признаками тяжелой атипии) и сосочковых комплексов высокодифференцированной аденокарциномы. В пользу гиперплазии эпителия свидетельствуют отчетливая сохранность клеток, преобладание темных ядер с ровными контурами, сочетание в одном скоплении цилиндрических и бокаловидных клеток, наличие по периферии скопления рядочков цилиндрических клеток, иногда с кутикулярной каемкой и ресничками, отсутствие вокруг скоплений клеток-спутников, некротических масс, напластования клеток, резкого полиморфизма ядер.
Гиперплазия базальных клеток. Чаще возникает при хронических заболеваниях легких (бактериальные и грибковые поражения, бронхоэктазы, туберкулез). В мазках скопления базальных клеток видны при изъязвлении слизистой оболочки бронха или при применении инвазивных инструментальных методов получения материала (соскоб щеточкой, отпечатки биопсированных кусочков).
Скопления компактно расположенных мелких клеток с относительно большими гиперхромными, часто темными (с неразличимой структурой хроматина) ядрами и «фасетками» на смежных поверхностях цитоплазмы, напоминают комплексы при мелкоклеточном раке.
О гиперплазии базальных клеток свидетельствуют однотипность размеров и формы клеток и ядер, ровный контур ядерной оболочки, интенсивно темная окраска ядер и базофилия цитоплазмы, наличие на периферии скопления единичных клеток цилиндрического эпителия, иногда с сохраненными ресничками, более выраженная компактность клеток в скоплениях и отсутствие клеток-спутников (при раке клетки чаще расположены рыхло и обнаруживается тенденция к отрыву наружных слоев от комплекса) .
Гиперплазия клеток эпителия бронхиол и альвеол.
Наблюдается при хронических заболеваниях легких, особенно в очагах сочетающегося с воспалением фиброателектаза, в участках, окружающих рубец. Уплощенные альвеолярные клетки замещаются кубическими (альвеолярная метаплазия), эпителий бронхиол становится многорядным, иногда образуются небольшие сосочки из кубических клеток.
В мазках, чаще в материале, полученном путем катетеризации периферического бронха, к гиперплазированным бронхиолярным и альвеолярным клеткам с известной долей вероятности относят кубические клетки, расположенные в один палисадообразный ряд, иногда небольшие группы округлых клеток с эксцентрически расположенным ядром и обильной светлой четко контурированной цитоплазмой.
При гиперплазии эпителия с атипией тяжелой степени (полиморфизм кубических клеток, гиперхроматоз ядер) группы и скопления трудно отличить от комплексов клеток бронхиолярно-альвеолярного рака. Для гиперплазии характерны редкие скопления, значительно варьирующие по числу входящих в них клеток, небольшие колебания величины и формы ядер, многочисленные округлые темные ядра, ровные контуры ядерной оболочки; отсутствие многоядерных клеток и клеток-спутников по периферии скоплений.
При раке иная картина: многочисленные однотипные комплексы, включающие небольшое число клеток; отрыв краевых клеток; больший полиморфизм ядер, неровный контур ядерной оболочки, двух- и многоядерные клетки, крупные ядрышки.
В основе плоскоклеточной метаплазии бронхиального эпителия лежит замена многорядного цилиндрического реснитчатого эпителия многослойным плоским через стадию переходных изменений (переходная метаплазия), когда утолщенный эпителиальный пласт состоит из нескольких слоев кубических, полигональных клеток, лишенных ресничек и кутикулярной каемки.
Частота плоскоклеточной метаплазии особенно высока среди злоупотребляющих курением мужчин старше 50 лет. Развитию плоскоклеточной метаплазии способствуют хронические заболевания легких.
Основным цитологическим признаком метаплазии реснитчатой клетки является потеря свойственной ей цилиндрической формы (клетки становятся округлыми, овальными, полигональными). Обычно они крупнее базальных, но мельче клеток плоского эпителия слизистой оболочки полости рта.
Ядра сравнительно большие, округлые, с ровными контурами и равномерно мелкозернистым хроматином, содержат одиночные ядрышки. Цитоплазма с четкими контурами, полупрозрачная, базофильная, иногда оксифильная, более выраженная, чем в базальных клетках.
Метаплазированные клетки располагаются поодиночке или в виде скоплений. Иногда в одном скоплении видны цилиндрические и метаплазированные клетки. На метаплазию указывает уплощенный край в скоплении цилиндрических клеток. При небольших размерах так называемые малые метаплазированные клетки имеют эллипсоидную или овальную форму, четко контурированную ацидофильную цитоплазму, темные ядра.
Ядерно- цитоплазматическое соотношение выше, чем в цилиндрических клетках. Располагаются клетки рядом друг с другом небольшими группами, каждое ядро «аккуратно» локализовано в центре цитоплазмы.
От клеток плоскоклеточного рака их отличают минимальная вариабельность величины, формы ядер и цитоплазмы, особенно в пределах одного скопления, отсутствие напластования ядер, ровные контуры ядер и цитоплазмы, более выраженная цитоплазма (отличие от мелкоклеточного рака), отсутствие крупных уродливых клеток (отличие от плоскоклеточного рака).
При цитологическом исследовании важно оценить степень атипии метаплазированных клеток. При атипии легкой степени наблюдают небольшое увеличение ядерно-цитоплазматического соотношения в отдельных клетках; однотипность большинства метаплазированных клеток и ядер сохранена.
При умеренной атипии нарастают полиморфизм, гиперхроматоз ядер, однако контуры ядер преимущественно ровные, показатель ядерно-цитоплазматического соотношения ниже, чем при раке. При атипии тяжелой степени (такие изменения в настоящее время обозначают как тяжелую дисплазию эпителия) во многих клетках резко повышено ядерно-цитоплазматическое соотношение, нарастают полиморфизм (рис. 28.1, а), число ядер с грубозернистым хроматином, видны скопления с напластованием ядер, особенно трудно отличимые от комплексов плоскоклеточного рака.
В отличие от рака в скоплениях метаплазированных клеток ядра, ядрышки, гранулы хроматина имеют ровные контуры, характерны темные ядра с неразличимой структурой хроматина, отсутствие многоядерных и гигантских причудливых клеток, менее часты признаки ороговения. При раке наряду с комплексами видны изолированные опухолевые клетки; из-за более прочных межклеточных связей изолированные метаплазированные клетки с признаками атипии встречаются редко.
При анализе инструментального материала правильная оценка цитограммы бывает затруднена (хотя реже, чем при исследовании мокроты) в связи с дистрофическими и аутолитическими изменениями клеток. В цилиндрических клетках частыми признаками дистрофии являются потеря ресничек и разрушение кутикулярной каемки, вакуолизация, снижение интенсивности окраски
нечеткость контуров или полное разрушение цитоплазмы, появление «голых» ядер. Иногда, наоборот, цитоплазма выглядит непрозрачной, окрашена оксифильно. В ядрах часто нарушена структура хроматина - видна крупнопетлистая сеть из полиморфных грубых глыбок, пикноз, реже - вакуолизация, рексис, лизис).
Своеобразной формой дистрофии клеток бронхиального эпителия является цилиоцитофтория (термин, предложенный Papanicolau G. N., 1963). При этом дистальная часть цитоплазмы реснитчатой клетки отрывается и образует безъядерный реснитчатый «хохолок».
Оставшийся округлый участок цитоплазмы содержит ядро, которое нередко подвергается изменениям, напоминающим рексис. Цилиоцитофорию чаще наблюдают при вирусных заболеваниях, но иногда при раке и других поражениях легких.
Разрушение цитоплазмы в гиперплазированных эпителиальных клетках приводит к появлению крупных «голых» ядер и ядер с небольшим ободком цитоплазмы. При выраженной атипии ядер обнаруживают клеточные скопления, сходные с комплексами дистрофически измененных раковых клеток.
Для исключения ошибок, связанных с дистрофическими и аутолитическими изменениями бронхиального эпителия, необходимо придерживаться правила: предположение об определенном заболевании легкого нельзя основывать на обнаружении «голых» ядер или скоплений эпителиальных клеток с расплывчатыми контурами ядер и цитоплазмы; в этих случаях целесообразно повторить исследование.
При острых воспалительных заболеваниях (бронхит, пневмония, абсцесс) в материале, полученном с применением инструментов, часто обнаруживают гнойный экссудат, состоящий из смеси нитевидных или аморфных некротических масс, сохранившихся или разрушенных полиморфно-ядерных лейкоцитов; в эпителии развиваются реактивные изменения, симулирующие при наличии тяжелой степени атипии опухоль и в ряде случаев являющиеся причиной ошибочного цйтологического диагноза рака легкого (см. ниже). Иногда воспалительный процесс маскирует опухоль.
При хронических воспалительных заболеваниях (хронические бронхит, пневмония, абсцесс) в мазках обнаруживают в различных сочетаниях клетки воспалительного инфильтрата (полиморфно-ядерные лейкоциты, лимфоциты, моноциты, плазмоциты, макрофаги, гистиоциты) и слущенные клетки бронхиального эпителия, часто с выраженными реактивными изменениями.
Гиперплазия бокаловидных клеток, как правило, является косвенным признаком хронического бронхита, особенно бронхоэктазов. При обострении воспалительного процесса в мазках увеличивается число полиморфно-ядерных лейкоцитов, слущенных эпителиальных клеток, уменьшается число макрофагов; при выздоровлении и ремиссии отмечается обратная тенденция.
Основой цитологического диагноза туберкулеза является обнаружение в инструментально полученном материале микобактерий туберкулеза, с меньшей долей достоверности - наличие эпителиоидных клеток и гигантских многоядерных клеток Пирогова - Лангханса, некротических (казеозных) масс.
Для саркоидоза характерно образование в ткани саркоидных гранулем. В цитологических препаратах эпителиоидные и гигантские многоядерные клетки не имеют патогномоничных для саркоидоза признаков, поэтому различить туберкулез и саркоидоз с помощью только цитологического исследования обычно невозможно.
Вместе с тем в ряде случаев при учете клиникорентгенологических и лабораторных данных результаты цитологического исследования могут быть интерпретированы как данные, свидетельствующие о туберкулезе или саркоидозе.
Для саркоидоза характерны:
- 1) более значительное разнообразие ядер и цитоплазмы эпителиоидных клеток по форме и величине с наличием «типических» эпителиоидных клеток и элементов, напоминающих гистиоциты и моноциты;
- 2) обильная светлая цитоплазма с четкими контурами и более высокая концентрация ШИК-позитивных веществ в эпителиоидных клетках;
- 3) более выраженная вариабельность формы и величины ядер многоядерных клеток и их расположение не только по периферии, но и в центральных участках цитоплазмы (это проявляется наличием двух типов гигантских клеток, напоминающих по форме и расположению ядер «типические» клетки Пирогова - Лангханса и клетки инородных тел);
- 4) изредка наличие в цитоплазме гигантских клеток пластинчатых кристаллических включений (тельца Шаумана);
- 5) отсутствие в мазках казеозного детрита («чистый» фон мазка).
Иногда в материале из бронхов наряду с элементами туберкулезной или саркоидной гранулемы обнаруживают скопления эпителиальных клеток, напоминающих опухолевые. При саркоидозе такие скопления чаще являются фрагментами реактивно измененного эпителия. Оценивая подобные скопления у больных туберкулезом, следует помнить о нередком сочетании туберкулеза и рака легкого.
Изредка цитологическое исследование материала, полученного из области бифуркации трахеи, помогает диагностировать склерому, основой цитологической диагностики которой является обнаружение в мазках клеток Микулича, крупных (диаметром 50-60 мкм, отдельные до 100-200 мкм) округлых, овальной или неправильной формы, со светлой вакуолизированной цитоплазмой.
Многочисленные мелкие вакуоли (диаметр 1-5 мкм) в большинстве клеток придают цитоплазме пенистый вид (сотовидная цитоплазма), но она может содержать и одну крупную (диаметр до 20 мкм) вакуоль.
Ядра сравнительно мелкие, округлые, структура хроматина мелкоглыбчатая. Нередко ядра пикнотичны, располагаются эксцентрически; видны 1-2 ядрышка.
Для установления диагноза склеромы важно выявить фуксинофильные гиалиновые шары (русселевские тельца). В цитоплазме клеток Микулича иногда видны бактерии Фриша - Волковича. В материале из бронхов обычно обнаруживается тяжелая дисплазия цилиндрического и метаплазированного плоского эпителия.
При вирусных заболеваниях легких особенности цитологической картины обусловлены прямым цитопатогенным эффектом вируса и ответной реакцией пораженной ткани (преимущественно эпителия слизистой оболочки). Цитопатогенный эффект проявляется дистрофией клеток, ослаблением межклеточных связей, диссоциацией и слущиванием эпителиальных клеток слизистой оболочки бронхов, скоплением альвеолярных макрофагов в просвете альвеол.
Дистрофические изменения выражаются в цилиоцитофтории. Появление в цитоплазме окруженных светлым ободком базофильных включений (микроколонии вируса и РНК пораженной клетки) или крупных оксифильных (эозинофильных, фуксинофильных) включений отражает частичную (локальную) зону дистрофии. Базофильные и оксифильные включения наблюдаются также в ядре. Ответная реакция эпителия на цитопатогенный эффект вируса проявляется усилением процессов внутриклеточной регенерации, пролиферации эпителиальных клеток.
Обнаружение в мазках перечисленных изменений клеток помогает предположить вирусную природу заболевания. Особенности цитологической картины в сочетании с клиническими данными могут ориентировочно указывать на подтип вызвавшего его вируса (грипп, парагрипп, респираторно-синтициальная, цитомегаловирусная, аденовирусная инфекция и др.).
В частности, при трахеобронхите и пневмонии, вызванных вирусом простого герпеса, в мазках появляются многоядерные гигантские клетки (рис. 28.1, б) с увеличенными ядрами, имеющими вид часового стекла (гипохромная центральная часть с размытыми гранулами хроматина и более темный четкий контур); смежные поверхности ядер за счет взаимного давления нередко конгруэнтны. Иногда в ядре видны большие оксифильные включения. Такие ядра могут симулировать ядра раковых клеток.
При подозрении на рак легкого придерживаются следующих принципов микроскопирования. Вначале ведут поиск эпителиальных клеток с признаками злокачественности, которыми следует считать любой полиморфный признак атипии (полиморфизм клеток, ядрышек, глыбок хроматина по форме и размерам, а также степени окрашивания ядра, контуру его, ядерно-цитоплазматическому соотношению и т. д.).
Наличие комплекса признаков злокачественности в эпителиальных клетках позволяет установить цитологический диагноз рака.
На основании оценки частоты и степени выраженности клеточных, структурных, функциональных признаков дифференцировки определяют форму и степень дифференцировки опухоли.
Высокодифференцированные варианты плоскоклеточного и железистого рака (плоскоклеточный рак с ороховением, высокодифференцированная аденокарцинома), мелкоклеточный рак имеют высокоинформативные цитологические’признаки, что обеспечивает достоверную верификацию диагноза.
Менее дифференцированные варианты плоскоклеточного рака и аденокарциномы (плоскоклеточный рак без ороговения и с дифференцировкой низкой степени, аденокарцинома с дифференцировкой умеренной и низкой степени) и недифференцированный крупноклеточный рак цитологически верифицируются лишь в биопсийном материале и только в предположительной форме.
Плоскоклеточный рак с ороговением (высокодифференцированный вариант) имеет характерную картину: отчетливо выражено большинство признаков плоскоклеточной дифференцировки. Кроме того, высокоинформативны резкий полиморфизм клеток (округлые, полигональные, причудливой формы в виде ракетки, ленты, эллипса, головастика; мелкие, крупные, гигантские), полиморфизм гиперхромных ядер с неравномерным распределением крупноглыбчатого хроматина; многоядерность, сравнительно низкое ядерно-цитоплазматическое соотношение, отсутствие ядрышек в большинстве ядер.
При плоскоклеточном раке без ороговения (рис. 28.1, д) (умеренно дифференцированный вариант) преобладают крупные округлые и полигональные раковые клетки с большими центрально расположенными ядрами, содержащими неправильной формы увеличенные ядрышки, и узким ободком цитоплазмы. Видны комплексы таких клеток, иногда с различными межклеточными мостиками. Признаки ороговения отсутствуют.
Диагноз плоскоклеточного рака с дифференцировкой низкой степени основан на преобладании мелких округлых нерезко полиморфных опухолевых клеток с относительно крупными центрально расположенными ядрами и небольшим ободком цитоплазмы. Характерны большие комплексы таких клеток с единичными вытянутыми элементами по периферии.
Высокодифференцированная (ацинозная, сосочковая) аденокарцинома. Характерны отчетливо выраженные признаки железистой дифференцировки. Кроме того, информативны равномерное распределение мелкозернистого хроматина, крупные ядрышки.
Разновидностью высокодифференцированной аденокарциномы является бронхиолярно-альвеолярный рак. В мазках характерно наличие мономорфных увеличенных кубических и цилиндрических раковых клеток с эксцентрически расположенными ядрами, часто 1-2 крупными ядрышками (рис. 28.1, е), многочисленных мелких железистоподобных (преимущественно сосочковых) комплексов одинаковой величины, выраженного слизеобразования, изредка псаммозных известковых телец.
При умеренно дифференцированной (железисто-солидной) аденокарциноме отмечается относительное увеличение числа округлых раковых клеток, изолированных и образующих комплексы. Аденокарцинома с низкой степенью дифференцировки верифицируется при обнаружении слизи в цитоплазме округлых раковых клеток с центрально расположенными ядрами.
Критериями цитологического диагноза мелкоклеточного рака служат преобладание сравнительно мелких, нерезко вариабельных по величине, округлых, полигональных опухолевых клеток с относительно крупными ядрами, неравномерное распределение крупноглыбчатого хроматина, неразличимые ядрышки, наличие компактных комплексов, в клетках которых цитоплазма не видна, а на смежных поверхностях «голых» ядер’образуются «фасетки» (конгруэнтные контуры в виде вдавлений, выпячиваний, ровных площадок).
При недифференцированном крупноклеточном раке отмечается преобладание крупных раковых клеток с большими, центрально расположенными гиперхромными или «пузырчатыми» ядрами, многочисленными крупными ядрышками, а также примесь гигантских клеток (более 12 %).
Доброкачественные и злокачественные неэпителиальные опухоли легких встречаются довольно редко. Чаще других диагностируют фиброму, фибросаркому, ангиогенную и лейомиосаркому, злокачественные лимфомы (ходжкинские и неходжкинские варианты).
Критерии их цитологической диагностики аналогичны таковым при локализации опухолей в любых органах. Определение первичной или метастатической природы опухоли легкого в большинстве случаев возможно только при комплексном учете цитологических, анамнестических и клиникорентгенологических данных.
Характерные цитоморфологические признаки имеет такое своеобразное образование, как гамартома, при которой в одних и тех же полях зрения наблюдается сочетание однотипных кубических и цилиндрических клеток эпителия с элементами хрящевой и слизистой ткани.
В данном разделе описаны лишь некоторые из многообразных картин, встречающихся цитологу при изучении биоптатов, полученных от больных с бронхолегочной патологией.
С целью проиллюстрировать значение цитологического метода в дифференциальной диагностике заболеваний легких из большого числа нозологических форм рассмотрены лишь основные и приведены опорные положения их цитологической верификации.
В то же время важно подчеркнуть, что цитологический метод, как и всякий другой, отдельно взятый, играет хотя и значимую, но не самодовлеющую роль в установлении диагноза. Во избежание диагностических ошибок результаты цитологического исследования должны расцениваться в комплексе с данными клинико-ренгенологического, лабораторного и инструментального обследования больных.
(греч. kytos - ячейка, клетка) - наука о клетке. Предметом цитологии является клетка как структурная и функциональная единица жизни. В задачи цитологии входит изучение строения и функционирования клеток, их химического состава, функций отдельных клеточных компонентов, познание процессов воспроизведения клеток, приспособления к условиям окружающей среды, исследование особенностей строения специализированных клеток, этапов становления их особых функций, развитие специфических клеточных структур и др. Для решения этих задач в цитологии используются различные методы.
Основным методом исследования клеток является световая микроскопия. Для изучения мелких структур применяют оптические приборы - микроскопы. Разрешающая способность микроскопов составляет 0,13-0,20 мкм, т.е. примерно в тысячу раз выше разрешающей способности человеческого глаза. С помощью световых микроскопов, в которых используется солнечный или искусственный свет, удается выявить многие детали внутреннего строения клетки: отдельные органеллы, клеточную оболочку и т.п.
Ультратонкое строение клеточных структур изучают с помощью метода электронной микроскопии. В отличие от световых в электронных микроскопах вместо световых лучей используется пучок электронов. Разрешающая способность современных электронных микроскопов составляет 0,1 нм, поэтому с их помощью выявляют очень мелкие детали. В электронном микроскопе видны биологические мембраны (толщина 6-10 нм), рибосомы (диаметр около 20 нм), микротрубочки (толщина около 25 нм) и другие структуры.
Для изучения химического состава, выяснения локализации отдельных химических веществ в клетке широко используются методы цито- и гистохимии , основанные на избирательном действии реактивов и красителей на определенные химические вещества цитоплазмы. Метод дифференциального центрифугирования позволяет детально исследовать химический состав органелл клетки после их разделения с помощью центрифуги.Метод рентгеноструктурного анализа дает возможность определять пространственное расположение и физические свойства молекул (например, ДНК, белков), входящих в состав клеточных структур.
Для выявления локализации мест синтеза биополимеров, определения путей переноса веществ в клетке, наблюдения за миграцией или свойствами отдельных клеток широко используется метод авторадиографии - регистрации веществ, меченных радиоактивными изотопами. Многие процессы жизнедеятельности клеток, в частности деление клетки, фиксируют с помощью кино- и фотосъемки .
Для изучения клеток органов и тканей растений и животных, процессов деления клетки, их дифференциации и специализации используют метод клеточных культур - выращивание клеток (и целых организмов из отдельных клеток) на питательных средах в стерильных условиях.
При исследовании живых клеток, выяснении функций отдельных органелл используют метод микрохирургии - оперативное воздействие на клетку, связанное с удалением или имплантированием отдельных органелл, их пересаживанием из клетки в клетку, введением в клетку крупных макромолекул.
В настоящее время в медицине широко используют цитологические методы исследования и цитологическую диагностику для распознавания многих заболеваний.
Цитологическая диагностика базируется на исследовании микроскопической картины препарата, содержащего как отдельные клетки, так и клетки в составе ткани, а также клеточного окружения в норме и при различных патологических процессах.
Врачи-цитологи проводят профилактические исследования, ставят предварительные диагнозы и дают оценки результатов лечения.
Применяются цитологические исследования в онкологии для распознавания опухолей; в гематологии — для диагностики заболеваний и оценки эффективности их лечения; в гинекологии — с целью диагностики онкологических заболеваний и гормональных нарушений; для распознавания многих заболеваний органов дыхания, пищеварения, мочевыделения, нервной системы и т.д.
Валерий Иванович Ключников работает в должности врача-цитолога в Национальном медико-хирургическом Центре им. Н.И.Пирогова.
"В основном я провожу исследования при помощи микроскопии цитологических мазков, отпечатков, соскобов, материала полученного при биопсии и пункции", - сообщает Валерий Иванович, предоставляя часть результатов своей повседневной работы. «Микрофотографии я получаю, используя тринокулярный Микромед-1, камеру Altami USB 3150 R6 1/2 CMOS (3 Mpix) и программу 2.0.0, с помощью которой удобно проводить измерения элементов».
Рис.1. Железистый эпителий
На рисунке 1 представлена микрофотография железистого эпителия из церквикального канала. Клетки железистого эпителия обведены эллиптическими фигурами.
«Цитологические исследования цервикального канала, то есть шеечного канала матки, проводятся для профилактики предрака и рака шейки матки. На данной микрофотографии виден нормальный железистый эпителий из цервикального канала, но я считаю, что это пример плохо окрашенного мазка. По нему нельзя сделать какие-либо выводы из-за наличия артефактов. Артефакты здесь — рыхлые скопления краски (дефекты окраски мазка). Это мешающие объекты, и иногда они искажают общую картину анализа», - объясняет Валерий Иванович.
Исследование нормального пролиферативного типа мазка показано на рисунке 2 . Мазок был взят с наружной поверхности шейки матки и из цервикального канала (ЦК). «Здесь мы видим поверхностные клетки многослойного сквамозного (чешуйчатого) эпителия (МСЭ) с мелкими ядрами и скопление клеток железистого эпителия из ЦК в виде железистой структуры (полоски) с крупными гиперхромными (плотными) ядрами. В программе Altami Studio было произведено : измерен диаметр такого ядра, и величина его оказалась равной 11.46 мкм», - комментирует Ключников В.И.
Рис. 2. Измерение диаметра ядра железистого эпителия
Микрофотография на рисунке 3 с изображением мазка пролиферативного типа с наружной поверхности шейки матки. «Это нормальный мазок женщины репродуктивного (детородного) возраста. В первой фазе цикла он характеризуется обилием зрелых поверхностных клеток МСЭ. В других случаях данный тип мазка может быть признаком патологии. На микрофотографии видны клетки МСЭ с мелкими ядрами, а также присутствует мелкая палочковая микрофлора», - рассказывает врач-цитолог Валерий Иванович.
Рис. 3. Мазок пролиферативного типа
Микроскопическое исследование мазка пролиферативного типа иногда позволяет диагностировать вирусную природу патологии шейки матки (Рис. 4 ). «На этой микрофотографии я наблюдаю нормальную вагинальную палочковую микрофлору, но увеличение ядер отдельных клеток с образованием околоядерной зоны просветления (койлоцитоз). Это говорит о поражении эпителиальных клеток папиломавирусной инфекцией», - замечает Ключников В. И.
Рис. 4. Папилломавирусная инфекция (ПВИ)
На рисунке 5 представлена микрофотография мазка с наружной поверхности шейки матки женщины в состоянии менопаузы. «Здесь я могу подтвердить диагноз острого воспаления, а именно, атрофического кольпита (вагинита). На это указывает обильное скопление лейкоцитов и увеличение ядра клеток. В Altami Studio был измерен диаметр произвольно выбранного на микрофотографии ядра. Диаметр был равен 14.71 мкм», - отвечает наш респондент.
Атрофический кольпит — симптомокомплекс, имеющий причиной значительное снижение содержания эстрогенов, который приводит к истончению многослойного плоского эпителия.
«Цитологическое исследование является одним из основных методов объективной диагностики атрофического кольпита», - утверждает Валерий Иванович.
Рис. 5. Атрофический кольпит
Помимо гинекологических исследований, Валерий Иванович проводит диагностику узлов щитовидной железы (Рис. 6 ). «На данной микрофотографии мы можем наблюдать нормальные клетки эпителия щитовидной железы (ЩЖ) в массе растворимого, продуцируемого ими, коллоида (уплотненного слизеподобного вещества). Во взятом мазке выражена вакуолизация, то есть разновидность клеточной дистрофии, характеризующаяся образованием в цитоплазме вакуолей. Это говорит о различных нарушениях в обмене веществ клеток, в их функции и строении», - сообщает Валерий Иванович.
Коллоидный зоб ЩЖ - заболевание, развивающееся в результате йододефицита. В качестве профилактики для предотвращения узловых образований достаточно потреблять йод и витамины.
Рис. 6. Преимущественно коллоидный зоб
«Также я исследую мазки, приготовленные из пунктата. Пунктат - это небольшое количество ткани или жидкости, извлеченное путем пункции тонкой иглой. На следующей микрофотографии зафиксировано исследование пунктата из узлового образования ЩЖ (Рис. 7 ).
В данном случае он представляет собой мономорфные (сохраняющие одну форму в течение всего периода развития) мелкие клетки ЩЖ типа А в небольших скоплениях. Наблюдается склонность к образованию микрофолликулярных структур (полоски, розетки), то есть имеется подозрение на аденому.
Мономорфная аденома — это, проще говоря, одиночный, плотный узел, который расположен в глубине железы.
Но не нужно пугаться данного диагноза, аденома щитовидной железы - доброкачественная опухоль и она редко переходит в злокачественную»
Рис. 7. Аденома щитовидной железы
Цитология применяется в том числе и для обследования желудка — по материалам, полученным при эндоскопии (Рис. 8 ). В программе Altami Studio был измерен диаметр ядра клеток эпителия желудка. «Это нормальные клетки эпителия, диаметр одного из самых больших ядер равен 54.7449 мкм», - замечает Ключников В. И.
Рис. 8. Эндоскопический материал из желудка
«Для подсчета элементов крови, их концентрации и определения подвижности я использую камеру Горяева (Рис. 9). Она откалибрована в программе Altami Studio. При помощи камеры Горяева мне удобно определять увеличение микроскопа. Я ее использую исключительно как калибратор».
Рис. 9. Камера Горяева
«Цитология - наука достаточно сложная и, к тому же, субъективная. По этой причине у врача-цитолога должна быть не только соответствующая квалификация, но и большой опыт работы в области цитологии», - делится Валерий Иванович. «Цитологические исследования нужны для д иагностики различных состояний шейки матки, для исследования новообразований щитовидной железы и для других профилактических осмотров. В настоящее время цитологическими исследованиями, получившими признание и широкое распространение, достигаются большие успехи в обеспечении здоровья населения», - считает врач-цитолог Ключников Валерий Иванович.
Цитологический метод
заключается в определении структуры клеток и особенностей химических процессов в них. Подобные исследования наиболее широко используют для выявления злокачественного перерождения клеток, в том числе на предраковой стадии, для диагностики заболеваний крови, обнаружения заболеваний мочеполовых органов.
Материал для цитологического исследования получают разным путем. Так, эксфолиативный способ заключается в отстаивании биологических жидкостей от пациента (крови, мокроты), которые в результате расслаиваются: плазма отделяется от форменных элементов крови, а в мокроте выпадает в осадок слизь, эпителий и бактерии. Можно получить материал для исследования с помощью соскоба или смывов, мазков отделяемого из свища, сосков молочных желез и др. Чаще таким образом получают материал для диагностики кожных (в том числе онкологических заболеваний.
Для цитологического исследования щитовидной железы, костного мозга, ликвора, кист, опухолей и внутренних органов материал берут у больного пункцией. Для этого делают прокол иглой (инъекционной или специальной) и забирают жидкое содержимое полостных образований с помощью обычного шприца. Забор тканей внутренних органов для исследования называется биопсией, которую выполняют специальными инструментами. Можно подвергнуть анализу и частицы твердых тканей, оставшихся в полости иглы или инструмента для биопсии после прокола.
Образцы тканей внутренних органов для исследования можно взять с помощью эндоскопической биопсии: в желудочно-кишечный тракт, бронхи или брюшную полость вводят гибкий прибор с волоконной оптической системой и режущим инструментом. Затем выбирают наиболее подозрительное на патологию место и выполняют несколько срезов тканей. При этом соблюдают следующее правило: первый срез делают на наиболее измененном участке органа, а затем берут еще несколько проб из прилегающих зон и других очагов поражения. В этом случае кровотечение из травмированных тканей не приведет к ошибочному забору материала.
Пункция и биопсия - сложные способы забора материала для исследования, часто они достаточно болезненны, а потому их проводят с обезболиванием, зато именно они позволяют свести ошибку в диагнозе к минимуму.
Исследуют как окрашенные и фиксированные образцы тканей, так и живые. Анализ проводят с помощью микроскопии и химических реакций. Цитологические исследования полученного материала достаточно быстры в исполнении и относятся к прижизненной диагностике. Наиболее широко их используют для выявления раковых и предраковых заболеваний при массовых профилактических осмотрах. В ходе исследования определяют тип эпителиальных клеток, стадию их развития и патологические изменения в них. Выявление и наблюдение динамики предраковых заболеваний или рака на ранних стадиях возможно только этим методом.
В зависимости от способа получения материала от больного для исследования можно определить размеры злокачественной опухоли, распространенность процесса (частичное, полное поражение органа, переход на окружающие орган ткани и соседние органы). С помощью цитологического исследования можно отличить первичную опухоль от вторичной, вызванной распространением раковых клеток по организму.
Большое значение для цитологического исследования имеют точные данные о происхождении материала, особенно если он взят из нескольких мест. Поэтому все мазки и соскобы после забора необходимо правильно маркировать (пометки делают и на предметном стекле и в сопроводительной документации). Для получения достоверных результатов цитологического исследования важны сведения о проводимом лечении, так как многие лекарственные препараты (гормоны, цитостатики) оказывают непосредственное воздействие на клетки и изменяют их состояние. Кроме того, при неправильном выборе места для забора материала от больного заболевание может быть не выявлено. Если результат анализа вызывает сомнение, то назначают повторное цитологическое исследование.
Признаки озлокачествления клеток, выявляемые при исследовании:
1) изменение расположения клеток относительно друг друга в определенных тканях (наслоение, группировки);
2) нечеткие границы;
3) одновременное присутствие живых измененных и мертвых клеток;
4) изменение размеров клеток (уменьшение, увеличение);
5) изменение формы клеток;
6) разнообразие клеток по структуре (в исследуемом материале присутствуют клетки различных стадий развития, много незрелых клеток);
7) окрашивание цитоплазмы в синий цвет химическими красителями;
8) наличие в цитоплазме множества вакуолей, твердых включений;
9) разнообразие ядер по структуре;
10) увеличение размеров ядер;
11) изменение объемного соотношения между ядром и цитоплазмой;
12) неравномерное распределение хроматина;
13) изменение структуры хроматина;
14) усиленное окрашивание ядер;
15) наличие ядер с разной степенью окрашивания;
16) увеличение размеров ядрышек и их числа;
17) увеличение числа клеток находящихся в состоянии митоза (деления);
18) наличие клеток с неправильным делением.
