Компоненты и механизм иммунологических реакций. Серологические реакции

В XVIII в. многие люди, будучи уверены, что когда-нибудь в жизни они все равно зара-зятся оспой, намеренно подвергали себя возможности заражения, для того чтобы переболеть этой болезнью в более благоприятных условиях и в дальнейшем не опасаться ее. Даже и теперь некоторые родители из тех же соображений не предохраняют своих детей от заражения детскими болезнями, зная, что некоторыми болезнями люди болеют лишь один раз в жизни. Этот тип устойчивости называется приобретенным иммунитетом. Но человек, невосприимчивый к оспе в результате перенесения этой болезни, обладает такой же восприимчивостью к кори или к любой другой болезни, как и тот, кто никогда не болел оспой; поэтому мы говорим, что иммунитет специфичен.

Активно приобретенный иммунитет обусловлен образованием в организме специфических белков, так называемых антител, которые выделяются в кровь и в тканевые жидкости после проникновения в организм какого-либо чужеродного белка, называемого антигеном. Антиген и антитело реагируют друг с другом, и это предохраняет организм от повреждения. Если, например, впрыснуть кролику яичный альбумин (белковое вещество), то клетки животного отвечают выработкой антител, специфичных по отношению к этому альбумину. Кроме того, организм способен вырабатывать особый род антител, называемый антитоксином, в ответ на присутствие токсина (обычно белка), выделяемого бактерией. После того как образовалось достаточное количество антитоксина, данный токсин уже не может причинить вреда организму.

Уже несколько десятков лет назад было известно, что антитела, образующиеся в ответ на введение данного антигена, не всегда однородны - они могут различаться по своей специфичности, по степени активности в отношении реакции с антигеном и по физико-химическим свойствам, (величине и форме молекулы, ее суммарному заряду и последовательности аминокислот).

Антитела, циркулирующие в крови, связаны с определенной фракцией плазмы - гамма-глобулинами. Гамма-глобулины - белки, очень сходные по своим физическим и химическим свойствам, но различающиеся по специфичности в отношении антигенов. Различия между разными антителами совершенно неуловимы; они даже еще более тонкие, чем различия между разными ферментами. По-видимому, лишь небольшая часть белковой молекулы (имеющая молекулярный вес порядка 160 000) иммуноло-гически активна. Различия между разными

антителами, по-видимому, сводятся к незначительным различиям в форме молекулы бедка, в расположении составляющих ее атомов, обеспечивающем комплементарность геометрических конфигураций антигена и антитела, которые должны подходить друг к другу, как ключ и замок.

Лимфатические ткани обычно синтезируют антитела только к «чужеродным» белкам, т. е. к белкам, которые при нормальных условиях не содержатся в организме. Но иногда некоторые нормальные компоненты тела могут обладать антигенным действием и вызывать обра-

зование антител; в результате возникающей при этом реакции антиген-антитело человек может заболеть.

После инъекции антигена наступает латентный период, продолжающийся примерно неделю, а затем в крови появляются антитела. Титр антител медленно повышается, достигает невысокого пика (первичная реакция) и вновь снижается. Вторичная инъекция антигена через несколько дней, недель или даже месяцев вызывает быстрое образование антител после более короткого латентного периода (вторичная реакция). Титр антител достигает более высокого уровня и снижается медленнее. Последующие инъекции антигена вызывают дополнительные вторичные реакции, до тех пор пока не будет достигнут максимальный титр. Со временем этот титр обычно снижается, и периодическая peiиммунизация помогает поддерживать иммунитет на удовлетворительном уровне. У предварительно иммунизированного человека вторичную реакцию можно также вызвать, заразив его естественным инфекционным агентом; антитела при этом обычно образуются достаточно быстро и предотвращают появление симптомов заболевания.

Механизм образования специфических антител под действием антигена неизвестен. Известно только, что антитела синтезируются заново из аминокислот, а не просто образуются путем изменения пространственной конформа-ции предсуществующей полипептидной цепи. Синтез этих специфических белков происходит, вероятно, так же, как и обычный синтез белков в рибосомах клетки, т. е. под контролем рибонуклеиновокислотных матриц (см. разд. 342). Антиген, по-видимому, входит в плаз-моциты и другие «иммунологически компетент-ные» клетки и вызывает образование специфической нуклеиновой кислоты-матрицы, которая в свою очередь определяет образование специфического антитела. Возможно, что информацию, необходимую для синтеза специфических антител, доставляет сам антиген или же она постоянно присутствует в клетке, будучи заключена в генах, но может быть использована только в присутствии специфического антигена. Высказывалось также мнение, что проникновение в клетку антигена ведет к проявлению генетически обусловленной способности к синтезу специфического антитела, находившейся до того в скрытом состоянии. Эта последняя теория дает наилучшее объяснение экспериментальным фактам, известным в настоящее время, и больше соответствует общей теории регуляции синтеза белков. Когда плаз-моциты, образующие специфическое антитело, делятся, обе дочерние клетки сохраняют способность вырабатывать такие же антитела, и эта информация передается на протяжении многих поколений клеток.

Антитела реагируют с антигеном одним или несколькими различными способами. Они могут соединяться с токсином, нейтрализуя его ядовитые свойства; они могут растворять клетки бактерий; наконец, они могут сенсибилизировать бактерии - делать их более уязвимыми для лейкоцитов. Некоторые антитела агглютинируют микробы тем самым препятствуя их распространению и еще вернее обеспечивая их задержку в лимфатических узлах.

Антитела метят, присоединяя к ним флуоресцирующий краситель, после чего их можно выявлять в специфических участках тканей с помощью микроскопа. Этот метод, разработанный в 1941 г. Кунсом, позволил проводить разнообразные исследования с определением локализации в клетке специфических реакций между антигеном и антителом; он используется также в диагностике инфекционных болезней.

Другой способ приобретения иммунитета состоит в прививке при помощи вакцины. Вакцина - это специально производимый в больших количествах антиген, характерный для определенной болезни, достаточно сильный, чтобы стимулировать образование антител в организме, но не настолько сильный, чтобы вызвать самую болезнь. Токсичность антигена понижают различными способами. Некоторые вакцины содержат лишь небольшое количество токсина. Другие представляют собой комбинацию токсина с антитоксином: в то время как

антиген заставляет организм вырабатывать больше антител, антитела самой вакцины защищают клетки от повреждения. Некоторые токсины подвергают тепловой или химической обработке, уничтожающей их вредные свойства, но сохраняющей их способность стимулировать образование антител; такого рода вакцина называется анатоксином. Еще один метод состоит в ослаблении культур бактерий путем длительного выращивания их в пробирках, где они в конце концов утрачивают часть своей токсичности. Антирабическую вакцину (вакцина против бешенства) ослабляют высушиванием, другие вакцины - последовательной прививкой их ряду лабораторных животных. Брюшнотифозную вакцину можно приготовить из убитых бактерий брюшного тифа.

Метод вакцинации был открыт в конце XVIII в. английским врачом Э. Дженнером, который заметил, что работники, имевшие дело с коровами, больными коровьей оспой, никогда не заболевали настоящей оспой. Когда он попробовал втереть немного жидкости, взятой из оспенных пузырьков на коровьем вымени, в царапину на коже человека, то возникло легкое заболевание с появлением одной локализованной оспины в месте втирания. Вакцинированные таким способом люди никогда не заболевали оспой. Коровью оспу и настоящую оспу вызывают два различных, но близкородственных вируса; прививка вируса коровьей оспы вызывает образование антител, способных реагировать также и с близкородственным ему вирусом оспы человека. Теоретически представляется возможным создавать путем прививок иммунитет против всех болезней, но для многих важных заболеваний, в том числе для туберкулеза, гриппа и сифилиса, способы вакцинации еще не разработаны.

Часто случается, что организм не способен достаточно быстро вырабатывать антитела для борьбы с антигенами микроба. В таких случаях производят инъекции антител какого-нибудь животного (обычно лошади), чтобы снабдить ими организм до того времени, когда он сам сможет вырабатывать их в достаточном для защиты количестве. Впрыскивание препарата антител (называемого сывороткой)- это единственный способ получения пассивного иммунитета; хотя такой иммунитет оказывает немедленное действие, он полностью исчезает спустя несколько недель.

Для приготовления сыворотки бактерий выращивают в пробирках до тех пор, пока не образуется большое количество токсина. Затем

этот токсин впрыскивают в возрастающих дозах лошади, и организм животного постепенно вырабатывает огромное количество антитоксина, который накапливается в крови. После этого у лошади время от времени берут кровь, удаляют из нее эритроциты и концентрируют антитоксин.

Естественный иммунитет. У всех животных и растений невосприимчивость к определенным болезням является наследственным свойством, и ее не приходится приобретать. Есть данные, указывающие на то, что различные расы человека наследственно различаются между собой по устойчивости к таким болезням, как туберкулез, дифтерия и грипп. Наследственная невосприимчивость к болезням, называемая естественным иммунитетом, передается из поколения в поколение.

Один из типов естественного иммунитета - это невосприимчивость, выработавшаяся в популяции, которая соприкасалась с возбудителем определенной болезни на протяжении многих поколений. Многие болезни (например, корь), в наши дни сравнительно легко протекающие

у европейцев, чрезвычайно тяжело протекали у американских индейцев и у жителей островов южной части Тихого океана, когда они впервые распространились среди этих народов. Сифилис тоже в настоящее время представляет собой гораздо более легкое заболевание, чем во времена первого появления его в Европе, когда он нередко в первый же месяц приводил к смерти. Многие тропические болезни, например малярия и сонная болезнь, у иностранцев протекают тяжелее, чем у местного населения. Другие болезни, первоначально весьма распространенные, со временем стали редкими: например, проказа чрезвычайно часто встречалась в библейские времена.

Эти изменения к лучшему обычно истолковывают как результат постепенного «естественного отбора»: люди, перенесшие в далекие времена данную болезнь, передавали свою «стойкость» своим потомкам и так далее. Возможно также, что в некоторых случаях адаптировались и сами микроорганизмы, что сопровождалось понижением их вирулентности.

Нормальный вирус или вирус, убитый слабым нагреванием или действием ультрафиолетового света, может препятствовать росту других вирусов в организме хозяина. Этим можно было бы объяснить малое распространение таких заболеваний, как полиомиелит, в областях, где эндемичны другие кишечные вирусы. Присутствие этих вирусов препятствует росту вируса полиомиелита; однако их действие состоит не в том, что они вызывают образование антител, а в том, что они побуждают клетки хозяина вырабатывать вещество, называемое интерфероном. Это вещество удалось выделить; оно представляет собой белок с молекулярным весом около 63 000.

Это недавно открытое явление служит, возможно, другим важным фактором защиты организма от болезней. Антитела имеют особенно важное значение в создании иммунитета к повторному заражению данным возбудителем; интерферон же, вероятно, играет важную роль в защите при первом заражении вирусом.

Исследователи доказали, что интерферон образуется в ответ на вирусную инфекцию; концентрация его достигает максимума на 3- 5-й день после заражения, тогда как антитела к инфекционному агенту появляются гораздо позднее - не ранее 8-го дня.

Интерферон действует не прямо на вирус, а на клетку-хозяина. Вирус проникает в клетки, обработанные интерфероном, но не способен размножаться в них. Интерферон, по-видимому, уменьшает количество АТФ, которое может быть использовано для размножения вируса, возможно путем разобщения процессов фосфо-рилирования и окисления (см. разд. 57). Имеющиеся данные позволяют предполагать, что существует интерферон только одного типа и что он эффективен против самых различных вирусов. Ссылки по теме

46. Практическое использование серологических реакций.

Иммунные реакции используют при диа­гностических и иммунологических исследо­ваниях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы, т. е. методы изучения антител и антигенов с помо­щью реакций антиген-антитело, определяе­мых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма.

Обнаружение в сыворотке крови боль­ного антител против антигенов возбудите­ля позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микро­бов, различных биологически активных ве­ществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепто­ров клеток и др.

При выделении микроба от больного про­водят идентификацию возбудителя путем изучения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т. е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих специфические ан­титела. Это так называемая серологическая идентификация микроорганизмов.

В микробиологии и иммунологии широко применяются реакции агглютинации, преци­питации, нейтрализации, реакции с участи­ем комплемента, с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологичес­кий, иммуноферментный, иммунофлюоресцентный методы).

Перечисленные реакции различаются по регистрируемому эффекту и технике постановки, однако, все они осно­ваны на реакции взаимодействия антигена с антителом и применяются для выявления как антител, так и антигенов. Реакции иммуните­та характеризуются высокой чувствительнос­тью и специфичностью.

Особенности взаимодействия антитела с ан­тигеном являются основой диагностических реакций в лабораториях. Реакция in vitro меж­ду антигеном и антителом состоит из специ­фической и неспецифической фазы. В специ­фическую фазу происходит быстрое специфи­ческое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена. Затем наступает неспецифическая фаза - более медленная, ко­торая проявляется видимыми физическими явлениями, например образованием хлопьев (феномен агглютинации) или преципитата в виде помутнения. Эта фаза требует наличия определенных условий (электролитов, опти­мального рН среды).

Связывание детерминанты антигена (эпитопа) с активным центром Fab-фрагмента анти­тел обусловлено ван-дер-ваальсовыми силами, водородными связями и гидрофобным взаимо­действием. Прочность и количество связавше­гося антигена антителами зависят от аффин­ности, авидности антител и их валентности.

47. Иммунологические реакции в диагностике инфекционных и неинфекционных заболеваний.

Иммунологические реакции (ИР) широко используются в лабораторной диагностике инфекций. Их применяют:

1) для выявления антител в сыворотке крови, т.е. в серологической диагностике инфекционного заболевания;

2) для определения вида или серовара микроорганизма, т.е. антигенной идентификации его.

ИР выявляют образование комплекса АГ-АТ. При этом неизвестный компонент определяют по известному. ИР отличаются высокой чувствительностью (связывание АТ с АГ при ничтожно малых количествах) и специфичностью (определяется особенностью строения активного центра АТ и детерминант АГ). Они характеризуются стадийностью развития. Первая стадия специфическая, невидимая для глаз, характеризуется соединением детерминантной группы АГ с активным центром АТ. В результате образуется комплекс АГАТ, утративший растворимость а изотонических растворах. Вторая стадия - неспецифическая, видимая на глаз, причем характер проявления зависит от состояния АГ, АТ и условия среды, в которой происходит взаимодействие АГ и АТ.

При взаимодействии АТ с корпускулярными антигенами (бактерии, животные клетки, др. клетки) наступают видимые невооруженным глазом изменения (например, хлопья агглюти-ната, лизис клеток). Если с АТ соединяются растворимые (мелкодисперсные) АГ, образование комплексов выявляют в результате предварительной адсорбции АГ (АТ) на корпускулярных веществах (эритроцитах, частичках угля и др.)

Скорость реакции зависит от:

Оптимального соотношения АГ и АТ;

Степени специфичности АГ и АТ; -рН среды (7,2-7,4);

Концентрации электролитов (0.85 % натрия хлорида).

В зависимости от состояния АГ, АТ и особенностей среды, в которой взаимодействуют АГ и АТ, различают реакции агглютинации, преципитации, лизиса, комплемента, нейтрализации и др.

ИР подразделяются на простые (двухкомпонентные, участвуют только АГ, АТ) и сложные (трехкомлонентные и многокомпонентные, участвуют АГ, АТ и реагирующая система - сенсибилизированные эритроциты, культура клеток, кожа восприимчивого животного и др.).

В настоящее время широкое применение получили ИР, в которых участвуют меченые АГ и АТ (р. иммунофлюорес-ценции, радиоиммунный и иммуноферментный методы).

48. Реакция агглютинации. Компоненты, механизм, способы постановки. Применение .

Реакция агглютинации - простая по постановке реакция, при которой происходит связыва­ние антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекулярных агрегатов). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изо­тонического раствора натрия хлорида.

Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировоч­ная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осад­ка (клетки, «склеенные» антителами, имеющими два или более антигенсвязывающих центра - рис. 13.1). РА используют для:

1) определения антител в сыворотке крови боль­ных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реак­ция Видаля) и других инфекционных болезнях;

2) определения возбудителя, выделенного от больного;

3) определения групп крови с использова­нием моноклональных антител против аллоантигенов эритроцитов.

Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации: к разве­дениям сыворотки крови больного добавля­ют диагностикум (взвесь убитых микробов,) и через несколько часов инкубации при 37 ˚С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.

Характер и скорость агглютинации зави­сят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диагностикумов (О- и H-антигенов) со специ­фическими антителами. Реакция агглютина­ции с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернис­той агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые фор­малином, сохранившие термолабильный жгу­тиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентиро­вочную реакцию агглютинации, применяя диа­гностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диа­гностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больно­го. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микроба­ми хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увели­чивающимися разведениями агглютинирую­щей сыворотки, к которым добавляют по 2-3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмеча­ется в разведении, близком к титру диагнос­тической сыворотки. Одновременно учитыва­ют контроли: сыворотка, разведенная изото­ническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе - равномерно мутной, без осадка.

Разные родственные бактерии могут агглю­тинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудня­ет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыво­ротками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыво­ротках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии.

49. Реакция Кумбса - антиглобулиновый тест для определения неполных антиэритроцитарных антител. Тест Кумбса используется для выявления антител к резус-фактору у беременных женщин и определения гемолитической анемии у новорождённых детей с резус-несовместимостью, влекущей разрушение эритроцитов.

Суть данного метода заключается в том, что антиглобулиновая сыворотка, содержащая антитела к иммуноглобулинам человека, при реакции с эритроцитами, сенсибилизированными неполными антителами, приводит к их агглютинации.

В зависимости от того, фиксированы ли антитела на поверхности эритроцитов или находятся в свободном состоянии в плазме крови, применяется прямая или непрямая проба Кумбса.

Прямая проба Кумбса ставится в тех случаях, когда есть основания предполагать, что исследуемые красные кровяные клетки уже in vivo подверглись сенсибилизации соответствующими антителами, т.е. первая фаза реакции - фиксация антител на поверхности эритроцитов - произошла в организме и последующее добавление антиглобулиновой сыворотки вызывает агглютинацию сенсибилизированных клеток.

С помощью непрямой пробы Кумбса выявляют неполные антитела, присутствующие в исследуемой сыворотке. В данном случае реакция протекает в два этапа. Первый этап - инкубация тест-эритроцитов с исследуемой сывороткой, во время которой происходит фиксация на эритроцитарной поверхности антител, содержащихся в исследуемом образце сыворотки. Второй этап - добавление антиглобулиновой сыворотки.

Реакция Кумбса прямая (прямой антиглобулиновый тест)

Материал для исследования: кровь из локтевой вены.

Взрослым – 3 мл крови;

Детям – 1-2 мл крови.

В норме реакция Кумбса отрицательна

Метод исследования: гельфильтрации

Прямая проба Кумбса применяется для выявления антител или компонентов комплемента, фиксированных на поверхности эритроцитов. Если на поверхности эритроцитов фиксированы антитела или компоненты комплемента, добавление антиглобулиновой или антикомплементарной сыворотки вызывает агглютинацию эритроцитов.

Положительная прямая реакция Кумбса подразумевает, что in vivo эритроциты покрыты иммуноглобулинами или комплементом. Полиспецифические и анти-IgG реагенты позволяют выявить примерно 500 молекул IgG на эритроците, но имеются сведения, что при аутоиммунной гемолитической анемии эритроциты покрыты меньшим количеством иммуноглобулинов.

Положительно при :

аутоиммунном гемолизе;

гемолитической болезни новорожденных;

лекарственной иммунной гемолитической анемии;

гемолитических трансфузионных реакциях.

Реакция Кумбса непрямая

Материал для исследования - кровь из локтевой вены. сывовротка должна быть быстро отделена от крови.

Взрослым – 3 мл крови;

Детям – 1-2 мл крови.

В норме: отрицательно.

Метод: гельфильтрации

Непрямая реакция Кумбса позволяет обнаружить антитела к эритроцитам в сыворотке. Демонстрирует присутствие в плазме пациента неожидаемых антител к АВО- и резуссовместимым эритроцитам. Агглютинация показывает, что сыворотка содержит антитела к антигенам, имеющимся на поверхности реагентных эритроцитов.

Непрямую реакцию применяют в следующих случаях:

для определения индивидуальной совместимости крови донора и реципиента;

для выявления аллоантител, включая антитела, вызывающие гемолитические трансфузионные реакции;

для определения поверхностных эритроцитарных антигенов в медицинской генетике и судебной медицине;

для подтверждения однояйцовости близнецов при трансплантации костного мозга.

Положительно при:

присутствии аллоантител;

присутствии аутоантител.

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ , основаны на взаимодействии антигена и находящегося в иммунной сыворотке антитела (согласно представлениям Эрлиха) или антигена и специфически измененной под влиянием иммунизаторного раздражения сыворотки (согласно новейшим воззрениям). Важнейшие И. реакции-аглютинация, преципитация, бактериолиз, реакция отклонения комплемента, реакция, основанная на действии опсонинов. Аглютинация и преципитация происходят при встрече антигена и соответствующего антитела; для осуществления бактериолиза, реакции отклонения комплемента и др. требуется помимо антигена и антитела также участие комплемента. Значение И. реакций двоякое. С их помощью можно ставить диагноз той или иной заразной болезни, приводя в соприкосновение сыворотку больного с микробом, возбудителем предполагаемой инфекции (реакция Видаля при брюшном тифе и парати-фах, реакция отклонения комплемента при различных инфекциях). С другой стороны, имея сыворотку, иммунную к определенной инфекции, возможно идентифицировать микроб, природа к-рого неизвестна. Преципитация имеет значение также в сан.-гиг. и суд.-мед. практике, позволяя определять видовую принадлежность животного, к которому относится исследуемый материал.

Иммунологические реакции (ИР) широко используются в лабораторной диагностике инфекций. Их применяют:
1) для выявления антител в сыворотке крови, т.е. в серологической диагностике инфекционного заболевания;
2) для определения вида или серовара микроорганизма, т.е. антигенной идентификации его.

ИР выявляют образование комплекса АГ-АТ. При этом неизвестный компонент определяют по известному. ИР отличаются высокой чувствительностью (связывание АТ с АГ при ничтожно малых количествах) и специфичностью (определяется особенностью строения активного центра АТ и детерминант АГ). Они характеризуются стадийностью развития. Первая стадия специфическая, невидимая для глаз, характеризуется соединением детерминантной группы АГ с активным центром АТ. В результате образуется комплекс АГАТ, утративший растворимость а изотонических растворах. Вторая стадия - неспецифическая, видимая на глаз, причем характер проявления зависит от состояния АГ, АТ и условия среды, в которой происходит взаимодействие АГ и АТ.

При взаимодействии АТ с корпускулярными антигенами (бактерии, животные клетки, др. клетки) наступают видимые невооруженным глазом изменения (например, хлопья агглюти-ната, лизис клеток). Если с АТ соединяются растворимые (мелкодисперсные) АГ, образование комплексов выявляют в результате предварительной адсорбции АГ (АТ) на корпускулярных веществах (эритроцитах, частичках угля и др.)

Скорость реакции зависит от:
- оптимального соотношения АГ и АТ;
- степени специфичности АГ и АТ; -рН среды (7,2-7,4);
- концентрации электролитов (0.85 % натрия хлорида).

В зависимости от состояния АГ, АТ и особенностей среды, в которой взаимодействуют АГ и АТ, различают реакции агглютинации, преципитации, лизиса, комплемента, нейтрализации и др.

ИР подразделяются на простые (двухкомпонентные, участвуют только АГ, АТ) и сложные (трехкомлонентные и многокомпонентные, участвуют АГ, АТ и реагирующая система - сенсибилизированные эритроциты, культура клеток, кожа восприимчивого животного и др.).

Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследованиях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы (от лат. serum —сыворотка и logos — учение),т.е. методы изучения антител и антигенов с помощью реакций антиген—антитело, определяемых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма. Обнаружение в сыворотке крови больного антител против антигенов возбудителя позволяет поставить диагноз болезни.

Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микробов, различных биологически активных веществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепторов клеток и др,

При выделении микроба от больного проводят идентификацию возбудителя путем изучения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т,е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих антимикробные антитела. Это так называемая серологическая идентификация микроорганизмов.

Реакция агглютинации: Реакция агглютинации (от лат. oggiutinatio — склеивание) — склеивание корпускул (бактерий, эритроцитов и др.) антителами в присутствии электролитов. Реакция агглютинации проявляется в виде хлопьев или осадка, состоящих из корпускул (например, бактерий), «склеенных» антителами (рис. 7.37).

Реакцию агглютинации используют для: определения возбудителя, выделенного от больного; определения антител в сыворотке крови больного; определения групп крови.

1. Определение возбудителя, выделенного от больного

Ориентировочная реакция агглютинации нз стекле. К капле агглютинирующей сыворотки (разведение 1:20) добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного. Образуется хлопьевидный осадок.

Развернутая реакция агглютинации с возбудителем, выделенным от больного.

К разведениям агглютинирующей сыворотки добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного

2.Определение антител в сыворотке крови больного:

Развернутая реакция агглютинации с сывороткой крови больного. К разведениям сыворотки больного добавляют диагностикум.

— Агглютинация с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие Q-антиген) происходит в виде мелкозернистой агглютинации.

— Агглютинация с Н-диогностикумом (бактерии, убитые формалином, сохранившие жгутиковый Н-антиген) — крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации выявляют антитела сыворотки крови больного с помощью антигенного зритроциторного диагностиками, который представляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами

Эритроциты (или частицы латекса) с адсорбированными на них антигенами взаимодействуют с соответствующими антителами сыворотки крови,что вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки ввиде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде «пуговки». РПГА ставят в пластиковых планшетках или в пробирках с разведениями сыворотки крови больного, к которым добавляют эритроцитарный диагностикум.

Иногда применяют антительный эритроцитарный диагностикам — эритроциты, на которых адсорбированы антитела, Например, можно обнаружить ботупиничес- кий токсин, добавляя к нему эритроцитарный антительный ботулинический диагностикум (такую реакцию называют реакцией обратной непрямой гемагглютинации — РОНГА).

Реакция Кумбса Реакция агглютинации для определения антирезусных антител (непрямая реакция Кумбса). У некоторых больных обнаруживают антирезусные антитела, которые являются неполными, одновалентными. Они специфически взаимодействуют с резус-положительными эритроцитами (Rh+), но не вызывают их агглютинации. Наличие таких неполных антител определяют в непрямой реакции Кумбса. Для этого в систему антирезусные антитела + резус-положительные эритроциты добавляют анти глобул и новую сыворотку (антитела против иммуноглобулинов человека), что вызывает агглютинацию эритроцитов

С помощью реакции Кумбса диагностируют патологические состояния, связанные с внутрисосудистым лизисом эритроцитов, например, гемолитическую болезнь новорожденных: эритроциты резус-положительного плода соединяются с циркулирующими в крови неполными антителами к резус-фактору, которые перешли через плаценту от резус-отрицательной матери.

Можно также выявлять неполные антитела против антигенных микробов.

Реакция торможения гемагглютинации Гемагглютинины вирусов склеивают эритроциты. Это свойство используют в реакции гемагглютинации для индикации и титрования вирусов, что необходимо для последующей постановки РТГА. Реакция торможения гемагглютинации основана на блокаде, подавлении антигенов (гемагглютининов) вирусов антитепами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты. РТГА применяют для диагностики многих вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещевого энцефалита и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных.

Реакция преципитации Реакция преципитации (от лат. praecipito — осаждать) — это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса. Реакцию преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, питательных средах и др.

Реакция кольцепреципитации , Реакцию проводят в узких преципитационных пробирках: на иммунную сыворотку наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов об- эазуется непрозрачное кольцо преципитата. Если в качестве антигенов в реакции используют прокипяченные и профильтрованные экстракты тканей, то такая реакция называется реакцией термопреципитации (реакция Асколи, при которой выявляют сибиреязвенный гаптен).

Иммуноэлектрофорез — сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации: смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяется в геле с помощью электрофореза, затем в канавку геля параллельно зонам электрофорезавносят иммунную сыворотку. Антитела иммунной сыворотки диффундируют в гель и образуют в месте «встречи» с антигеном линии преципитации.

Реакция флоккуляции (по Рамону) {от лат, floccus — хлопья шерсти} — появление опалесценции или хлопьевидной массы (иммунопреципитации) в пробирке при реакции токсин—антитоксин или анатоксин—антитоксин, Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.

Штаммы возбудителя дифтерии — С, cliphtheriae могут быть токсигенными (продуцирующими экзотоксин) и нетоксигенны- МИ, Образование экзотоксина зависит от наличия в бактерияхпрофага, несущего tox-ген, кодирующий образование экзотоксина. При заболевании все изоляты тестируются на токсигенность — продукцию дифтерийного экзотоксина с помощью реакции преципитации в агаре.

Реакция нейтрализации Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или их токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами, т. е. их нейтрализацией. Реакцию нейтрализации (РН) проводят путем введения смеси антиген—антитело животным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микроорганизмов или их антигенов, токсинов говорято нейтрализующем действии иммунной сыворотки и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген—антитело.

Реакция связывания комплемента Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигенов и антител они образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т.е. происходит связывание комплемента комплексом антиген—антитело. Если же комплекс антиген—антитело не образуется, то комплемент остается свободным

РСК проводят в две фазы: 1-я фаза — инкубация смеси, содержащей антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (индикаторная) — выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген—антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет (реакция положительная). Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит — антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз (реакция отрицательная). РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифилиса (реакция Вассермана).

Реакция иммунофлюоресценции Реакция иммунофлюоресценции (РИФ, или метод Кунса). Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Реакция Кунса является методом экспресс- диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител.

Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лу- чах люминесцентного микроскопа (рис. 7.61). Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген—антитело с помощью а нти глобул и новой (против антител) сыворотки, меченной флюорохромом. Для зтого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок а нти глобул и новой {антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

IT. При определении антигена в лунки с сорбированными антителами вносят антиген (напр., сыворотку крови с искомым антигеном), добавляют диагностическую сыворотку против него и вторичные антитела (против диагностической сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хромоген для фермента.

Конкурентный ИФА для определения антигенов (рис. 7.65).

Конкурентный ИФА для определения антител: искомые антитела и меченные ферментом антитела конкурируют друг с другом за антигены, сорбированные на твердой фазе.

Иммуноблоттинг — высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИЧ>А или РИА). Иммуноблоттинг ислользуют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др. Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их (блоттинг — от англ. blot — пятно) из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА, Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов*. На эти полоски наносят сыворотку больного B). Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом C). Образовавшийся на полоске комплекс [антиген 4- антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата D), изменяющего окраску под действием фермента.

Полимеразная цепная реакция: основана на амплификации, т.е. увеличении количества копий специфического (маркерного) гена возбудителя. Для этого двунитевую ДНК, выделенную из исследуемого материала, денатурируют («расплетают» при нагревании) и достраивают (при охлаждении) к расплетенным нитям ДНК новые комплементарные нити. В результате из одного гена образуются два. Этот процесс копирования генов многократно повторяется при заданных температурных режимах. Достраивание новых комплементарных нитей ДНК происходит при добавлении к искомым генам праймеров (затравки из коротких од- нонитевых ДНК, комплементарных З"-концам ДНК искомого гена), ДНК-полимеразы и нуклеотидов.

В основу реакций иммунитета положено специфическое взаимодействие антигена с антителом. С помощью известных антигенов можно определить наличие антител в сыворотке крови больного или обследуемого лица (серологическая диагностика инфекционных заболеваний). И, наоборот, наличие специфических иммунных сывороток позволяет установить родовую, видовую и типовую принадлежность микроорганизма (серологическая идентификация микроба по антигенной структуре).

Агглютинация – склеивание микробов или других клеток при воздействии на них иммунной сыворотки, содержащей антитела – агглютинины. Реакция агглютинации проявляется в том, что равномерной взвеси клеток, например бактерий, при добавлении иммунной сыворотки происходит скручивание клеток, образование зернышек или хлопьев, которые постепенно оседают на дно, жидкость же над осадком совершенно просветляется. Однако зернышки или хлопья образуются только в том случае, если реакция происходит в присутствии электролитов. Таким образом, для проявления реакции агглютинации нужно иметь: 1) антиген (агглютиноген) в виде взвеси клеток; 2)антитела (агглютинины) в виде иммунной сыворотки; 3) электролиты (физиологический раствор).

Внешнее проявление положительной реакции агглютинации бактерий имеет двоякий характер в зависимости от свойств антигена: у безжгутиковых бактерий, имеющих только один соматический или О-антиген, происходит склеивание непосредственно самих микробных клеток, и образующиеся кучки имеют вид мелких компактных зерен. Такая агглютинация называется тонкозернистой; она происходит медленно – в течение 18-22 часов. У бактерий со жгутиками имеются два антигена – соматический, О-антиген, в самой клетке и жгутиковый, Н-антиген, находящийся в жгутиках. Клетки склеиваются друг с другом жгутиками и образуют рыхлые крупные хлопья. Такая агглютинация называется крупнохлопчатой; она наступает быстро – в течение 2-4 часов.

Реакция аггютнации благодаря своей специфичности, простоте и постановке и демонстративности получила широкое распространение в микробиологической практике для диагноза многих инфекционных заболеваний: брюшного тифа, сыпного тифа, паратифов, дизентерии, холеры, бруцеллеза и др. Ею пользуются с диагностической целью в 2 направлений.

1. Для определения выделения выделенного из какого-либо субстрата неизвестного микроба. В этом случае агглютинацию ставят с определенной, заранее приготовленной агглютинирующей сывороткой, полученной путем иммунизации кроликов определенным видом бактерий и, следовательно, содержащей агглютинины в отношении этих бактерий.

В качестве антигена берут культуру неизвестного исследуемого микроба. Положительный результат реакции указывает, что неизвестный микроб идентичен тому, который был взят в качестве антигена для приготовления агглютинирующей сыворотки.

2. Для обнаружения агглютининов к тому или другому определенному виду бактерий в сыворотке больного. В этом случае для агглютинации берут определенную лабораторную культуру бактерий (или несколько культур бактерий разных видов) в качестве в качестве антигена и сыворотку больного. Положительный результат агглютинации указывает на то, что сыворотке больного имеются агглютинины к определенному, известному, виду микроба, т.е. данный микроб является возбудителем заболевания, в процессе которого в сыворотке больного накопились защитные антитела.

Механизм: «теория решетки».

Активный центр АТ соединяется с 1 антигенной детерминантой, 2-ой активный центр реагирует с антигенной детерминантой, находящейся на 2 молекуле АГ, в результате происходит склеивание. Если в качестве АТ взята безжгутиковая бактерия, то зернистость мелкая – агглютинация., если жгутиковая – Н-агглютинация (крупная зернистость).

Варианты агглютинации:

1. Ориентировочная на стекле – для выявления серологических свойств бактерий, для выявления признаков, для идентификации.

2. Развернутая в пробирках – мало чувствительна и невысоко специфична. Определяется титр АТ (это максимальное разведение сыворотки, в которой обнаружена агглютинация).

3. РНГА (нагрузочная реакция) – реакция непрерывной Геной агглютинации – используется АГ, абсорбированный на эритроцитах барана, т.о. перевод из растворимого в корпускулярный – агглютинация эритроцитов.

Агглютинирующая диагностическая сыворотка готовится путем иммунизации кроликов.

Сыворотка от больного для постановки реакции агглютинации получается из его крови, взятой стерильно на локтевой вене в количестве 5-10 мл. одновременно часть крови употребляется для посева. Если же кровь нужна только для постановки реакции, вполне достаточно 1-2 мл. тогда берут кровь из пальца проколом иглой Франка.

АГ для реакции агглютинации являются соответствующие живые ил убитые культуры бактерий. Живыми культурами пользуются тогда, когда агглютинация ставится с целью определения вида бактерий, выделенных из какого-либо субстрата.

Диагностикумы – диагностические препараты, содержащие АГ и используемые для обнаружения АТ.

24 Реакция преципитации и ее значение, область применения. Методы постановки. Преципитирующие сыворотки, их получение и титрование. Использование реакции преципитации в диагностике инфекций.

Реакции преципитации основаны на феномене образования видимого осадка (преципитата) после взаимодействия растворимых либо находящихся в коллоидном дисперсном состоянии АГ с АТ. РП позволяют выявлять незначительные количества АГ. Они очень чувствительны, и их применяют для тонкого иммунохимического анализа, выявляющего отдельные компоненты в смеси с АГ. Метод имеет много разновидностей.

Реакция кольцепиципитации. На слой антисыворотки наслаивают жидкость, содержащую АГ, и чрез несколько секунд наблюдают образование кольца преципитата.

Реакции микропреципитации применяют для нефелометрического выявления АТ в небольших образцах сыворотки.

Преципитация в геле – на агаре с ее помощью определяют токсигенность выделенных бактерий. При дифтерии, стаф.токсикозе, для определения клеточного иммуноглобулина в сыворотке крови.

Реакция преципитации характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью. Она позволяет обнаружить минималейшие следы белка – антигена (до разведения 1:100000 и выше), благодаря чему преципитация практически стала важной реакцией в химии, биологии и т.д.

Чрезвычайно большое значение реакция преципитации имеет в судебномедицинской практике для распознавания видовой принадлежности крови не только в свежем и жидком состояниях, но также и в высушенном, например, в пятнах очень давнего происхождения на одежде.

В санитарной практике реакция преципитации является методом для определения фальсификации мясных, мучных и других препаратов.

Для серологического диагноза пользуются реакцией преципитации в тех случаях, когда АГ может быть получен только в жидком состоянии, например в вытяжке из инфицированных органов, в спинномозговой жидкости, в моче больного и т.д.

Реакции преципитации можно ставить как с веществами белковой природы – полноценными АГ, так и гаптенами – неполноценными АГ, которые сами по себе не могут вызывать образование АТ, но могут вступать в соединение с ними.

Постановка реакции. Для постановки реакции преципитации необходимо иметь:

1. преципитирующую сыворотку, приготовленную путем иммунизации кроликов соответствующим антигеном;

2. исследуемый АГ в виде отцентрифугированного или профильтрованного прозрачного раствора (экстракт их микробных тел, патологических субстратов от больного, органов, кровяных пятен, сывороточные белки и т.д.) Перед постановкой реакции разводят АГ – физиологическим раствором не менее чем на 1:1000;

3. физиологический раствор (для разведения сыворотки и АГ);

4. специальные узкие (не шире 0,75 см) пробирки с конусообразным дном и очень прозрачного стекла;

5. пастеровские пипетки;

Обязательным условием является полная прозрачность участвующих в реакции агглютинации ингредиентов – сыворотки и АГ. В противном случае результаты реакции будут не ясны.

В пробирку наливают 0,2 мл преципитирующей сыворотки; затем при помощи пастеровской пипетки осторожно наслаивают на сыворотку 0,2 мл АГ (спускают жидкость по стенке пробирки так, чтобы она не смешивалась с сывороткой, а образовала над ней верхний слой). Добавив АГ. Пробирку ставят в штатив. При положительном результате реакции сразу же или в течение 5-10 минут на границе обеих жидкостей образуется мутное кольцо от выпавшего в осадок АГ. Степень реакции оценивается по величине кольца и времени его проявления.

К опыту ставится несколько контролей, а именно: 1) заведомо известны АГ + специфическая преципитирующая сыворотка; 2) преципитирующая сыворотка + физиологический раствор; 3) нормальная сыворотка + исследуемый АГ.

25 Реакция иммунного лизиса как один из механизмом иммунитета. Компоненты реакции, практическое использование.

Одним из защитных свойств иммунной сыворотки при инфекции является ее способность растворять (лизировать) м/о или другие клеточные элементы, поступившие в организм. Специфические АТ, обуславливающие лизис (растворение) клеток, носят названия лизинов. В зависимости от АГ они точнее называются бактериолизинами, спирохетолизинами, цитолизинами и т.д.

Лизины способны проявлять свое лизирующее действие на АГ только в присутствии дополнительного фактора – комплемента. Комплемент является составной частью любой свежей сыворотки, как нормальной, так и иммунной. При хранении или подогревании сыворотки комплемент разрушается.

Т.о. реакция лизиса происходит при участии двух компонентов: одного специфического, содержащегося в иммунной сыворотке (АТ), и другого неспецифического, присущего любой сыворотке, как иммунной, так и нормальной (комплемент).

Свежеизвлеченная из организма иммунная сыворотка способна к лизису, так как содержит и АТ и комплемент. Если же пользуются иммунной сывороткой, стоявшей или подвергнутой подогреванию и вследствие этого утратившей комплемент, то лизис произойдет только при условии добавления комплемента, т.е. свежей сыворотки. Для обеспечения постоянства результатов иммунную сыворотку заранее инактивируют нагреванием при 56 градусов в течение 30 минут (для разрушения имеющегося в ней комплемента) и прибавляют к ней строго определенное количество комплемента. В качестве комплемента принято пользоваться свежей сывороткой нормальной морской свинки.

При дифференциации холерных и холероподобных вибрионов.

26. Реакция связывания комплемента в диагностике инфекционных заболеваний. Практическое применение, компоненты реакции.

Данная реакция используется для серодиагностики и обнаружения АГ в исследуемом материале, сероидентификации выделенных культур. Она характеризуется высокой чувствительностью и достаточной специфичностью, а также возможностью применения как корпускулярных, так и растворимых Г. Последнее связано с тем, что комплемент связывается с Fc- фрагментом АТ независимо от их специфичности. Таким образом, способность комплемента связываться только с комплексом АГ-АТ за счет Fc-фрагментов последнего и на вызывать гемолиз сенсибилизированных эритроцитов (тест-система) послужила основой для широкого применения РСК в лабораторной практике в течение прошедшего столетия.

Для постановки РСК требуется предварительная подготовка ингредиентов реакции, особенно комплемента, в качестве которого используют сыворотку морской свинки с установкой рабочей дозы. Однако за последние десятилетия выпускается сухой оттитрованный комплемент, что значительно облегчило постановку реакции. Исследуемые сыворотки крови и антигены обязательно контролируются на антикомплиментарность.

Постановку основного опыта производят в пробирках путем внесения в нее определенных объемов сыворотки крови, антигена и рабочей дозы комплемента. Смесь инкубируют в термостате при температуре 37 градусов в течение часа. Регистрацию результатов реакции проводят по гемолизу сенсибилизированных эритроцитов барана. Их приготавливают при смешивании гемолитической сыворотки кролика с эритроцитами барана. При внесении комплемента в эту смесь происходит реакция гемолиза. Т.о в тех случаях, когда комплемент не связывается с исследуемой системой АГ-АТ, т.е. остается свободным, наблюдается полный гемолиз бараньих эритроцитов, который свидетельствует об отрицательной реакции. Отсутствие гемолиза указывает на связывание комплемента системой АГ-АТ, т.е на положительную реакцию, которая обозначается крестами. Интенсивность задержки гемолиза оценивается по четырехкратной системе, при этом полное отсутствие гемолиза обозначается ++++

27 Неполные антитела. Реакция Кумбса (прямая и непрямая). Обнаружение антител к резус фактору у беременных женщин.

Неполные АТ – АТ, имеющие только один активный центр – являются одновалентными.

Реакция Кумбса.

Метод выявляет неполные (одновалентные) АТ, образующиеся при бруцеллезе, резус-конфликте или системных коллагенозах. Для постановки реакции необходима антиглобулиновая сыворотка, содержащая полные (как минимум двухвалентные) АТ.

Неполные антитела в отличии от нормальных моновалентны, поскольку они имеют один активный центр, способный взаимодействовать только с одним эпитопом: в то время как другие эпитопы остаются не связанными. В результате этого не происходит образования крупных комплексов, выпадающих в осадок в растворе электролита. Последние проявляются только в реакциях с бивалентными АТ. Для исправления этого положения вводится антиглобулиновая сыворотка (АГС), содержащая бивалентные АТ к глобулину, которая свяжет между собой моновалентные АТ. Содержащиеся в исследуемом материале. Таким образом произойдет визуально видимая гемагглютинации или агглютинация, свидетельствующая о наличии в исследуемой сыворотке неполных (моновалентных) антител. Например, в случае беременности резус-отрицательной женщины резус-положительным плодом у нее в сыворотке крови появятся неполные антитела. Для их выявления в пробирку с исследуемой сывороткой крови вносят резус- положительные эритроциты, а затем АГС. Появление гемагглютинации свидетельствует о положительной реакции.

Иммунофлюоресценция

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ). Разработана А. Кунсом и носит его имя (метод Кунса). Это один из методов исследования, в котором используются меченные антитела. В качестве метки используется краситель, дающий свечение в ультрафиолетовых лучах (изоцианат флюоресцеина или просто флюорохром). Риф используется в двух модификациях: прямой метод Кунса и непрямой метод Кунса. Прямой метод: исследуемый материал, зафиксированный на предметном стекле, обрабатывается меченой флюорохромом диагностической сывороткой; обязательный этап реакции –

отмывка от непрореагировавших антител; если в исследуемом материале есть искомый антиген, меченные антитела фиксируются на антигене и после отмывки такой комплекс выявляется по свечению при просматривании

препарата под люминесцентным микроскопом. Непрямой метод: в этом случае реакция идет в два этапа – на первом этапе используется немеченая диагностическая сыворотка, на втором этапе используется меченая флюорохромом антиглобулиновая сыворотка; с помощью непрямого метода можно выявлять в исследуемом материале как наличие антигена, так и

наличие и титр специфических антител. Люминесцирующие (флюоресцирующие) сыворотки представляют собой

иммунные сыворотки, содержащие специфические антитела, меченые флюоресцирующими красителями. При приготовлении люминесцирующих сывороток проводят присоединение к глобулиновой фракции иммунной сыворотки флюорохромов путем прочной химической связи. Люминесцирующие сыворотки используют при постановке РИФ.

29. Реакция нейтрализации – способность антител нейтрализовать токсины, вирусы, яды змей. Используется для индикации и идентификации токсинов, для идентификации вирусов, и др. РН не дает видимого результата in vitro,

поэтому она учитывается по биопробе на животных или в культуре ткани. РН in vivo может быть использована для определения степени напряженности антитоксического иммунитета в организме человека (проба Шика).

Токсин – яд микробного происхождения. Токсины микробов делятся на эндотоксины и экзотоксины. Характеристика токсинов см. тема №6.

Анатоксин – обезвреженный токсин. Получают из экзотоксинов путем их обработки формалином и теплом. Анатоксин не обладает ядовитостью, при этом сохраняет антигенные и иммуногенные свойства токсина. Сила

действия анатоксина измеряется в ИЕ. ИЕ (иммуногенная единица) – это такое количество анатоксина, которое в смеси с 1 АЕ сыворотки дает инициальную флоккуляцию. Титр анатоксина – количество ИЕ в 1 мл.

Анатоксины титруют в реакции флоккуляции. Анатоксин используется в качестве вакцины для создания активного антитоксического иммунитета. Примером таких вакцин являются дифтерийный анатоксин, столбнячный

анатоксин и др. Анатоксин используется также дл получения антитоксических сывороток.

Антитоксин или антитоксическая сыворотка – сыворотка, содержащая антитела к токсину. Антитоксические сыворотки – это гетерологичные сыворотки, их получают путем гипериммунизации лошадей соответствующими анатоксинами с последующим взятием у животных крови и получения сыворотки. Содержание антитоксина в антитоксических сыворотках выражается в международных единицах (ME), принятых ВОЗ. Например, 1 ME противостолбнячной сыворотки соответствует ее

минимальному количеству, нейтрализующему 1000 минимальных смертельных доз (DLm) столбнячного токсина для морской свинки массой 350 г. 1 ME противоботулинического антитоксина - наименьшее количество сыворотки, нейтрализующее 10000 DLm ботулинического токсина для мышей массой 20 г. 1 ME противодифтерийной сыворотки соответствует ее минимальному количеству, нейтрализующему 100 DLm дифтерийного токси-на для морской свинки массой 250 г.

30. Реакция флоккуляции (РФ) - используется для титрования антитоксических сывороток, токсинов и анатоксинов. В реакции флоккуляции в качестве антигена участвует токсин или анатоксин. При смешивании их в эквивалентных соотношениях с антитоксической сывороткой появляется помутнение, а затем рыхлый осадок. Реакции возможны только с лошадиными (но не с кроличьими) антитоксическими сыворотками или антитиреоглобулиновыми человеческими антисыворотками. Механизм РФ сходен с таковым реакции преципитации. В реакциях нейтрализации и флоккуляции участвуют в качестве компонентов токсины, анатоксины, антитоксины (антитоксические сыворотки

31. Иммуноферментный анализ - лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.

Классификация по типу иммунохимического взаимодействия на первой стадии анализа (в которой происходит связывание определяемого вещества). Если в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела), то метод являетсянеконкурентным . Если же на первой стадии в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог (меченное ферментом анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе), конкурирующие за ограниченное количество центров специфического связывания, то метод является конкурентным .

Среди конкурентных схем твердофазного ИФА существует два основных формата:

1. Прямой конкурентный формат ИФА использует иммобилизованые на твердой фазе специфические антитела, а меченый ферментом и немеченый антигенконкурируют за связь с иммобилизованным антителом.
В непрямом конкурентном формате ИФА используются меченные ферментом антитела (специфические или вторичные) и иммобилизованный на твердой фазе конъюгат антиген-белок-носитель.
Таким образом, за счёт несомненных преимуществ иммуноферментного анализа: удобства в работе, быстроты, объективности за счёт автоматизации учёта результатов, возможности исследования иммуноглобулинов различных классов (что важно для ранней диагностики заболеваний и их прогноза) в настоящее время является одним из основных методов лабораторной диагностики.

Основные типы тест-систем (диагностических наборов) в зависимости от используемых антигенов

В зависимости от того, какие антигены используются, иммуноферментные тест-системы подразделяются на:

1. Лизатные - в которых используется смесь нативных антигенов (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре);

2. Рекомбинантные - в которых используются полученные генно-инженерным способом белки-аналоги определённых белковых антигенов возбудителя;

3. Пептидные - использующие химически синтезированные фрагменты белков.

Теории иммунитета

1) Эрлиха теория иммунитета (теория боковых цепей) - одна из первых теорий антителообразования, согласно которой у клеток имеются антигенспецифические рецепторы, высвобождающиеся в качестве антител под действием антигена.

2) Клонально-селективная теория , теория Бернета - теория, согласно которой в организме возникают клоны клеток, иммунокомпетентных в отношении различных антигенов; антиген избирательно контактирует с соответствующим клоном, стимулируя выработку им антител.

1. Антитела и лимфоциты с необходимой специфичностью уже существуют в организме до первого контакта с антигеном.

2. Лимфоциты, участвующие в иммунном ответе, имеют антигенспецифичные рецепторы на поверхности своих мембран. В случае B-лимфоцитов рецепторами являются молекулы той же специфичности, что и антитела, которые эти лимфоциты впоследствии продуцируют и выделяют.

3. Каждый лимфоцит несет на своей поверхности рецепторы только одной специфичности.

Лимфоцит, сенсибилизированный антигеном, проходит несколько стадий пролиферации и формирует клон плазматических клеток. Плазматические клетки синтезируют антитела только той специфичности, на которую был запрограммирован лимфоцит-предшественник. Сигналами к пролиферации служат связывание антигена и цитокины, выделяемые другими клетками (в первую очередь, Т-хелперами. Сами активированные В-лимфоциты также выделяют цитокины.

3) Селективную теорию образования антител сформулировал Ерне, он предположил, что в организме синтезируется полный набор антител, но каждое из них образуется в небольшом количестве и независимо от какого-либо стимула поступает в кровь в виде естественных антител. Функция их состоит в том, чтобы избирательно связываться с соответствующим антигеном и таким способом доставлять его неким клеткам организма, для которых они служат сигналом к воспроизведению таких же молекул, т.е. к образованию антител. Это была первая теория, которая объясняла также феномен иммунологической толерантности, принимая, что любые естественные антитела направленные против собственных антигенов будут немедленно абсорбироваться тканями организма, и таким образом не могут запустить образование аутоантител.

34. Иммунологи́ческая толера́нтность - способность иммунной системы специфически не реагировать на конкретный антиген. Например, при беременности развиваетсятолерантность иммунной системы матери